基于生理生化指標選擇紅錐二代優良家系

譚長強 申文輝 劉秀 曹艷云 黃志玲 郝海坤

摘?要：通過對29個紅錐優樹二代家系苗光合碳氮同化過程關鍵物（葉綠素、硝酸還原酶活性、谷氨酰胺合成酶活性、總ATP酶含量、PEP羧化酶含量和RUBP羧化酶含量）進行測定，運用主成分分析及隸屬函數法進行優良家系的篩選和評價。結果表明：9個生理指標29個家系間均存在顯著差異。葉綠素a含量為0.13～0.72 mg·g-1FW，葉綠素b含量為0.01～0.27 mg·g-1FW，葉綠素a+b含量為0.18～0.98 mg·g-1FW，類胡蘿卜素含量為0.03～0.32 mg·g-1FW，硝酸還原酶活性為1.16～10.26 μg·g-1·h-1，谷氨酰胺合成酶活性為0.30～1.24 A·mg-1protein·h-1，總ATP酶含量為0.37～3.55 U·mg-1 prot，PEP羧化酶含量為8.42～21.24 IU·L-1，RUBP羧化酶含量為2.09～9.12 ng·mL-1。其中，總ATP酶含量變異最大，其次為硝酸還原酶活性，變異最小的為RUBP羧化酶含量。采用主成分分析及隸屬函數法分別篩選出10個紅錐優樹二代優良家系，重復率達到90%，分別為B2、B5、P5、A6、P3、P6、R3、D2、R4家系。這說明主成分分析法和隸屬函數法均可用于評價紅錐二代優良家系。

關鍵詞： 轉化酶， 隸屬函數法， 苗期變異， 主成分分析法， 苗期選擇

Seedling selection of the second superior families of Castanopsis hystrix based on the analysis of physiological indices

TAN Zhangqiang， SHEN Wenhui*， LIU Xiu， CAO Yanyun， HUANG Zhiling， HAO Haikun

（ Guangxi Academy of Forestry， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530002， China ）

Abstract：By using 29 families of Castanopsis hystrix seedlings as experimental material， we measured key substances in the process of photosynthetic carbon and nitrogen assimilation of Chlorophyll， nitrate reductase and glutamine synthetase activity， total contents of ATP enzyme， PEP carboxylase and RUBP carboxylase content， and their superiorities were evaluated with principal component analysis and membership function method. The results were as follows： There were significant differences of all indexes among the 29 families. Chlorophyll a content varied from 0.13 to 0.72 mg·g-1FW， chlorophyll b content varied from 0.01 to 0.27 mg·g-1FW， chlorophyll （a+b） content varied from 0.18 to 0.98 mg·g-1FW， carotenoid content varied from 0.03 to 0.32 mg·g-1FW，nitrate reductase （NR） activity varied from 1.16 to 10.26 μg·g-1·h-1， glutamine synthetase （GS） activity varied from 0.30 to 1.24 A·mg-1protein·h-1， total contents of ATPase varied from 0.37 to 3.55 U·mg-1 prot， PEP Case content varied from 8.42 to 21.24 IU·L-1 and RUBP case content varied from 2.09 to 9.12 ng·mL-1. Among indexes， the total contents of ATP enzyme varied most， followed by the nitrate reductase activity， and the RUBP carboxylase content varied minimum. The ten families was selected respectively by principal component analysis and the method of subordinate function respectively and repetition rate reached 90%. Repeat the families were B2， B5， P5， A6， P3， P6， R3， D2 and R4 families. This instructed that principal component analysis and subordinate function method are good for the evaluation of the second generation family of Castanopsis hystrix.

Key words： invertase， membership function method， seedling stage variation， principal component analysis， seedling selection

早期選擇是林木未達到經濟成熟前所進行的選擇（楊秀艷等，2004）。前人研究指出，對林木苗期個體及優良家系的選擇，不僅能縮短育種周期，而且還能降低測定林的試驗規模，更好地提高林木遺傳增益，降低試驗成本（杜克兵等，2009;劉代億等，2009;王軍輝等，2000）。葉綠素具有吸收和傳遞光能的作用，為植物光合作用提供最原始的能量來源，其含量的高低在一定層度上可以反映植物生產能力（高紅霞等，2016;陳隆升，2009）。硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶、總ATP酶、PEP羧化酶和RUBP羧化酶等轉化酶是衡量植物同化及轉化利用能力，以及植物細胞代謝及生長強度的指標（高紅霞等，2016;陳隆升，2009;蔡瑞國等，2008;楊亮等，2007;郝乃斌等，1991;潘瑞熾，2010;吳正鋒等，2014;趙蓉等，2013; Liu et al.， 2015;周竹青等，2009;陳穎等，2015）。因此，通過研究紅錐苗期生理及轉化酶指標，進行紅錐優良家系的苗期篩選具有現實的可行性。

紅錐（Castanopsis hystrix）為殼斗科錐屬（Castanopsis）的常綠喬木，是優質珍貴用材樹種，適應性強，生長快（朱積余等，2014）。目前，僅廣西紅錐造林面積在15 000 hm2以上，隨著國家鄉土珍貴樹種木材儲備計劃的實施、市場對高檔珍貴用材需求的增長及天然林的禁伐，紅錐人工造林的區域將進一步擴大。而對紅錐的遺傳改良研究相對滯后，難以滿足生產對其的需要。當前對紅錐遺傳改良研究多集中在紅錐優樹一代家系生長性狀、光合能力等方面（朱積余等，2014;蔣燚等，2013），有關利用紅錐光合碳氮同化過程中關鍵物質的紅錐二代優良家系早期選擇尚未見有報道，本研究將為紅錐進一步的選育提供科學依據。

1?材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗設置在廣西南寧廣西林科院珍貴樹種苗圃（108°20′ E，22°55′ N），屬濕潤的亞熱帶季風氣候，海拔約80 m，7—8月平均氣溫28.2 ℃，1月平均氣溫12.80 ℃，極端最高氣溫39.4 ℃，極端最低氣溫-1.5 ℃，年均氣溫21.7 ℃。日照時數在1 550 h以上，10 ℃積溫為7 200 ℃，全年幾乎無霜;年均降雨量1 300 mm，干濕季節明顯，主要集中在4—9月。土壤為赤紅壤，pH值為5.6，肥力中等，土壤經風干、粉碎、過篩備用。

1.2 材料及來源

種子于2016年11—12月采集于廣西憑祥的紅錐優樹子代林，共計29個家系。漚曬去殼后，先篩選健壯飽滿種子，然后將所有種子撒于沙床中催芽，待60%～70%的種子胚芽出土時即可開始移植，選取長出胚芽或葉子的小苗進行移植至規格為18 cm × 18 cm的育苗袋中，基質為黃心土。育苗采取相同的水肥、殺蟲等管理措施。

1.3 生理指標測定

2018年1月，選擇每個家系苗高、地徑平均值附近的5株進行生理指標的測定，每株選取3片無病蟲害、剛成熟而未老化的葉片，每個指標3次重復。各指標測定方法如下，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量采用丙酮-乙醇混合提取法（鄒琦，2000），硝酸還原酶活性采用活體法（鄒琦，2000），谷氨酰胺合成酶參照蔡紅梅等（2010）的測定方法，總ATP酶采用南京建成的超微量ATP酶測試盒測定，PEP羧化酶、RUBP羧化酶采用酶聯免疫法的ELISA試劑盒測定。

1.4 數據分析與統計

利用WPS、DPS7.05和SPSS19.0對試驗數據進行整理及統計分析。不同紅錐家系綜合評價用隸屬函數法，其公式為u（xij）=（xij-xjmin）/（xjmax-xjmin）（1）

式中，u（xij）為紅錐i家系j指標的標準化值，xij為紅錐i家系j指標值，xjmax為各家系j指標的最大值。確定不同指標的權重，權重確定采用標準差系數法。計算標準差系數vj，再求各指標的權重wj。

vj=（∑ni=1（xij-xj）2）/xj（2）

wj=vj/∑nj=1vj（3）

求不同家系各指標的綜合評價值，來衡量不同紅錐優樹二代苗木的優劣狀況。

D=∑nj=1[u（xj）×wj]（4）

2?結果與分析

2.1 29個紅錐優樹二代家系苗生理指標

從表1可以看出，29個家系的葉片葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b、類胡蘿卜素、硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶、總ATP酶、PEP羧化酶、RUBP羧化酶在29個紅錐二代家系間差異顯著（P<0.05）。這表明紅錐優樹二代家系間存在豐富變異，開展紅錐優樹二代優良家系的苗期選擇是可行的。其中，葉綠素a含量為0.13～0.72 mg·g-1FW，平均值為0.38 mg·g-1FW，P5家系含量最高，比平均值高155.8%;葉綠素b含量為0.01～0.27 mg·g-1FW，平均值為0.12 mg·g-1FW，P5家系含量最高，比平均值高209.3%;葉綠素a+b含量為0.18～0.98 mg·g-1FW，平均值為0.50 mg·g-1FW，P5家系含量最高，比平均值高160.2%;類胡蘿卜素含量為0.03～0.32 mg·g-1FW，平均值為0.13 mg·g-1FW，R2家系含量最高，比平均值高222.1%;硝酸還原酶活性為1.16～10.26 μg·g-1·h-1，平均值為5.00 μg·g-1·h-1，B5家系含量最高，比平均值高182.1%;谷氨酰胺合成酶活性為0.30～1.24 A·mg-1protein·h-1，平均值為0.54 A·mg-1protein·h-1，P4家系含量最高，比平均值高172.8%;總ATP酶含量為0.37～3.55 U·mg-1 prot，平均值為1.36 U·mg-1 prot，A9家系含量最高，比平均值高233.8%;PEP羧化酶含量為8.42～21.24 IU·L-1，平均值為13.57 IU·L-1，B5家系含量最高，比平均值高94.5%;RUBP羧化酶含量為2.09～9.12 ng·mL-1，平均值為6.92 ng·mL-1，B2家系含量最高，比平均值高101.5%。

2.2 單個指標選擇的潛力

通過對單個指標的選擇（表2）可以了解紅錐優樹二代家系內各指標遺傳改良的最大潛力，每個指標下排名前10的優良家系相互交叉但不完全相同。排名前10的家系平均值高出總體平均值，最大的指標為總ATP酶含量;其次為硝酸還原酶活性;最小的為RUBP羧化酶含量。

2.3紅錐二代優良家系的苗期選擇

2.3.1 主成分分析法?從表3可以看出，根據累計貢獻率>80%的原則選取前4個主成分進行分析，它們的累計貢獻率為80.6%，表明前4個主成分能代表所有抗旱指標進行不同家系間抗旱性評價。第一主成分主要有葉綠素a、葉綠素b、葉綠素（a+b）、類胡蘿卜素，其特征值為3.56，貢獻率為39.6%;第二主成分主要有硝酸還原酶、總ATP酶、PEP羧化酶，其特征值為1.47，貢獻率為16.3%;第三主成分主要有谷氨酰胺合成酶、PEP羧化酶， 其特征值為1.20， 貢獻率為13.3%; 第四主成分主要有谷氨酰胺合成酶、總ATP酶、RUBP羧化酶，其特征值為1.03，貢獻率為11.4%。運用主成分分析法對29個紅錐優樹二代家系進行優選排序，排序前10的家系（表4）分別為B2>B5>P5>A6>P3>P6>R3>D2>P7>R4。

2.3.2 隸屬函數法?運用隸屬函數法排序后， 排在前10的家系（表5）分別為B2>B5>A6>D2>A9>P3>P5>R4>P6>R3。

2.3.3 優良家系綜合選擇?利用主成分分析法和隸屬函數法兩種評價方法得到的結果不完全相同，但總體趨勢一致（表4，表5）。以兩種方法中共有的家系為入選家系，選出B2、B5、P5、A6、P3、P6、R3、D2、R4。

3?討論與結論

植物生理代謝過程是環境及基因調控共同作用的結果。在控制環境下，如果某一植物在某種性狀上基因型存在差異，那么該種差異將會體現在與之對應的生理生物標記上 （蔡紅梅等，2010;姜磊等，2005）。本研究中，葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b、類胡蘿卜素、硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶、總ATP酶、PEP羧化酶、RUBP羧化酶在29個紅錐優樹二代家系間具有顯著性差異，反映出紅錐優樹二代家系間存在豐富的遺傳多樣性，這為開展紅錐優樹二代家系的苗期選擇提供了物質基礎。同樣，趙蓉等（2013）對栓皮櫟優樹子代硝酸還原酶等生理生化特性進行了研究，也認為栓皮櫟子代家系之間存在顯著差異，可以初步作為栓皮櫟速生性狀早期選擇的指標。

從單個指標進行選擇紅錐優樹二代家系，各指標入選的家系存在一定的重復和差異。一方面說明各光合碳氮同化生理指標之間存在一定相關性，各指標所反映的信息存在重疊性;另一方面說明單個指標在紅錐生長過程中作用不同，對紅錐優良家系進行篩選準確性存在偏差。因此，通過多指標的方法進行評價和篩選才能更好地達到預期的目的。目前，多指標的綜合篩選與評價主要有隸屬函數法、主成分分析法和聚類分析法（楊升等，2013）。姜順邦等（2016）運用隸屬函數法對閩楠優樹子代苗期進行了優選。高紅霞等（2016）同時采用隸屬函數法和主成分分析法對紅砂家系進行評價，最終兩種方法篩選出的優良家系重合率達到80%。本研究得出了類似的結果，兩種方法綜合評價篩選出的排名前10的家系，重復率達到90%，分別為B2、B5、P5、A6、P3、P6、R3、D2、R4家系。這表明主成分分析法和隸屬函數法均可用于評價紅錐二代優良家系。對比本研究前期對生長研究結果苗高（B2、A7、B5、A8、P3、B4、A6、R4、D2和R3）、地徑（B2、A7、B5、P3、P2、A3、R4、D2、A6和A2）排名前10位的家系可以看出，生理指標與苗高、地徑排名前10的家系重復率均達到60%以上。說明利用光合碳氮同化過程中關鍵物分析紅錐優良家系的苗期選擇具有一定的可行性。

本研究采用9個光合碳氮同化過程中關鍵生理生化指標，對紅錐優樹二代家系進行苗期選擇，其結果與后期家系生長表現是否密切相關，還有待進一步驗證。在未來研究中，將持續觀測其他生長及生理生化指標（如樹高、胸徑、材積、光合等），進一步優化評價體系，以便更好地探討紅錐苗期選擇的可靠性。

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