從代謝組學角度探討雙重腹水超濾濃縮回輸治療肝腎陰虛型肝硬化腹水的機制

顧歡 叢慶偉 白長川 武春燕 朱英

摘要?目的：從代謝組學的角度探討雙重腹水超濾濃縮回輸治療肝腎陰虛型肝硬化腹水的機制。方法：選取2015年11月至2017年12月大連醫科大學附屬第一醫院收治的肝硬化腹水患者38例作為研究對象，選取其中17例單純肝硬化腹水患者，利用液質聯用平臺獲得腹水超濾治療前后患者的代謝物譜。利用偏最小二乘法-判別分析（Partial Least Square-Discrimination Analysis，PLS-DA）分析，篩選出差異代謝化合物并將其輸入MetaboAnalyst獲得相關代謝途徑。結果：1）腹水回輸治療后，肝腎陰虛型患者中醫證候較前改善;ALT、AST、TBIL較前下降（P<0.05），TP、ALB較前明顯升高（P<0.01）;Urea、Cre較前明顯改善（P<0.01）。2）鑒定出與肝腎陰虛型肝硬化腹水回輸治療密切相關的5種化合物，包括鵝脫氧膽酸、膽酸、順烏頭酸、檸檬酸和棕櫚酸，并得出與腹水回輸治療密切相關的3條代謝通路，包括檸檬酸循環、原發性膽汁酸生物合成和脂肪酸生物合成。結論：腹水回輸治療可能通過影響上述3條代謝通路取得有效臨床療效，為肝腎陰虛型肝硬化腹水的治療提供新思路。

關鍵詞?雙重腹水超濾濃縮回輸;肝腎陰虛;肝硬化腹水;代謝組學;超高效液相色譜-質譜;差異代謝物;代謝通路;機制

Mechanism of Double Ascites with Ultrafiltration and Concentration Technique Treatment of the Liver and Kidney Yin Deficiency Liver Cirrhosis Ascites by Metabolomics

Gu Huan1，Cong Qingwei1，Bai Changchuan2，Wu Chunyan1，Zhu Ying1

（1 Infectious Department，the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University，and Liver Disease of Integrated Chinese and Western Medicine Department，Institute（College）of Integrative Medicine，Dalian Medical University，Dalian 116011，China; 2 Dalian Hospital of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116013，China）

Abstract?Objective：To study the mechanism of double ascites with ultrafiltration and concentration technique treatment of the liver and kidney yin deficiency liver cirrhosis ascites by metabolomics.Methods：In this study，38 patients with cirrhosis ascites from the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University during November 2015 to December 2017 were selected.The clinical effects of ascites reinfusion were observed and analyzed.17 patients with simple liver cirrhosis and ascites were selected，and the metabolite spectrum of the patients before and after ascites ultrafiltration treatment was obtained by LC / MS.Partial Least Square-Discrimination Analysis（PLS-DA）was used to screen out differential metabolic compounds and enter them into MetaboAnalyst to obtain relevant metabolic pathways.Results：After treatment，the TCM syndrome of patients with liver and kidney yin deficiency improved.The liver function ALT，AST and TBIL were decreased after treatment（P<0.05），and TP and ALB were increased after treatment（P<0.01）.The renal function urea and creatinine were significantly improved after treatment（P<0.01）.2）There were 5 compounds closely related to the treatment of ascites with liver and kidney yin deficiency by ascites with ultrafiltration and concentration technique treatment，including Chenodeoxycholic acid，Cholic acid，cis-aconitic acid，Citric acid and Palmitoleic acid.3 metabolic pathways were obtained that closely related to the treatment of ascites by ascites with ultrafiltration and concentration technique treatment，including citrate cycle（TCA cycle），primary bile acid biosynthesis and fatty acid biosynthesis.Conclusion：The treatment of ascites reinfusion can make effect through the 3 metabolic pathways.It provides a new idea for the treatment of ascites with liver and kidney yin deficiency syndrome.

Key Words?Double ascites with ultrafiltration and concentration technique treatment; Liver and kidney yin deficiency; Liver cirrhosis ascites; Metabolomics; Ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry; Differential metabolites; Metabolic pathways; Mechanism

中圖分類號：R242;R285.6文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.12.066

肝硬化腹水屬于中醫學“鼓脹”范疇，鼓脹作為疾病名稱首現于《黃帝內經》中[1]。鼓脹多因郁熱傷陰，或濫用攻逐法瀉水傷及陰液，陰損及陽，陰傷日久可致陽虛，故難治性腹水的病機復雜，臨床以肝腎陰虛多見，其中醫治療包括中藥湯劑、中成藥、中藥敷臍和灌腸等[2]，但療程較長，見效較慢。肝硬化腹水的西醫治療包括病因治療、限鈉飲食及應用利尿藥物、避免應用腎毒性藥物等[3-5]。對于難治性腹水可采用大量放腹水及補充人血白蛋白醫治，以及經頸靜脈肝內門體分流術（Transjugular Intrahepatic Portosystem Stent-shunt，TIPS），前者易引起低血容量、腎損傷、后循環功能障礙等并發癥，后者易誘發肝性腦病，更加損傷腎功能，使腹水的臨床診治更加兇險難治[6]。雙重腹水超濾濃縮回輸腹腔術（以下簡稱腹水回輸治療）能夠防止上述問題，在醫治頑固性腹水方面具有明顯優勢，成為臨床上經常使用的方式。腹水回輸治療可迅速緩解腹脹等癥狀，在有效濾出水分及內毒素的同時，充分保留白蛋白等大分子物質[7]。本研究從代謝組學角度，結合肝腎陰虛型肝硬化腹水治療前后證候積分和臨床療效變化及在小分子化合物水平的變化，從中西醫角度了解肝硬化腹水的發病機制，并聯合中醫及西醫理論解釋腹水回輸治療的臨床療效及代謝組學特征，為肝硬化腹水的進一步治療研究提供理論依據。

1?資料與方法

1.1?一般資料?選取2015年11月至2017年12月就診于大連醫科大學附屬第一醫院感染科肝硬化腹水的患者38例作為研究對象。其中男20例，女18例，年齡23～71歲，平均年齡（60.31±10.87）歲，平均病程（7.78±3.45）個月;其中乙肝后肝硬化18例（47.37%），酒精性肝硬化11例（28.94%），丙肝后肝硬化7例（18.42%），原發性膽汁性肝硬化2例（5.27%）。根據有無合并肝衰竭或者肝癌分組：其中單純肝硬化患者17例（44.75%），肝硬化合并肝衰竭患者15例（39.47%），肝硬化合并肝癌患者6例（15.78%）。本方案經醫院倫理委員會審核批準實施（倫理審批號：YJ-KY-FB-2019-14）。

1.2?診斷標準?依據中華醫學會肝病學分會《肝硬化腹水及相關并發癥的診療指南》（2017年版），中華中醫藥學會脾胃病分會《肝硬化腹水中醫診療專家共識意見》（2017年版），《中醫診斷學》第8版，《中藥新藥臨床研究指導原則》，中華中西醫結合學會消化系統疾病專業委員會《肝硬化腹水的中西醫結合診療共識意見》（2011年版）。

1.3?納入標準?1）與肝硬化腹水診斷標準相符合;2）中醫證候符合肝腎陰虛型;3）志愿加入實驗研究，可以較好地服從實驗規則。

1.4?排除標準?1）上消化道出血患者;2）嚴重腎功能損害患者;3）彌漫性血管內凝血患者;4）心肺功能嚴重障礙者。

1.5?脫落與剔除標準?1）患者依從性差，不能遵醫囑配合治療，影響療效評定;拒絕復查，資料不完整;2）患者自行退出試驗者。

1.6?雙重腹水超濾濃縮回輸治療方法?患者平臥位，分別取左右髂前上棘與臍連線中外1/3處為穿刺點，左入右出，常規消毒鋪單，2%利多卡因4 mL局部浸潤麻醉至腹膜，多孔穿刺針于穿刺點刺入腹腔。將輸入與輸出管路與分子篩連接，治療前用生理鹽水沖洗管路，將多孔穿刺針與腹水超濾機管路相連，建立密閉式腹腔回輸系統，開始行腹水回輸治療術。腹水被引出后經過中空纖維濾過器進行1次濾過，主要濾過小分子毒素及近50%水分，水及小分子物質則通過導管排入裝廢棄廢液的袋內，從而形成1次濃縮液，再經過細菌過濾器進行2次濾過，產生含有白蛋白等有利物質的2次濃縮液，回輸腹內。治療過程中每隔30 min測血壓、脈搏1次，術后多頭腹帶加壓包扎72 h，每次可濾出液體（5 570±3 250）mL，治療時間為1.5～3 h。

1.7?試劑與儀器?超高效液相色譜質譜聯用系統采用Wasters超高效液相色譜（UPLC）-Q Exactive HF MS（Thermo Fisher Scientific，Rockford，IL，USA），離心機（Microfuge 22R，Beckman Coulter公司），渦旋振蕩器（Vortex Genius3德國IKA集團），乙腈、甲酸（色譜純）自美國Fisher公司購置，醋酸銨（分析純）自美國Sigma-Aldrich公司購置，由MILLI-Q超純化水制備系統（美國Millipore公司）制備超純水。

1.8?臨床樣本收集及處理?1）選擇肝硬化腹水患者，經腹水回輸治療前后腹水樣本，每份樣本容積約50 mL。利用裝有干冰的恒溫箱運輸，最終放置在-80 ℃冰箱留存。2）腹水樣品預處理：取150 μL腹水樣本凍干，加入400 μL含內標提取液（75%乙腈），上清取300 μL凍干，復溶于80 μL25%乙腈溶液等待LC-MS分析。配制75%乙腈溶液（含同位素內標），內標終濃度為乙酰酰基肉堿-d3 0.12 μg/mL，癸酰肉堿-d3 0.075 μg/mL，棕櫚酰肉堿-d3 0.06 μg/mL，溶血磷脂酰膽堿0.6 μg/mL，棕櫚酸-d3 0.375 μg/mL，硬脂酸-d3 0.375 μg/mL，膽酸-d4 0.3μg/mL，鵝脫氧膽酸-d40.2 μg/mL，亮氨酸-d3?0.75 μg/mL，苯丙氨酸-d5 3.2 μg/mL，色氨酸-d5 2.7 μg/mL。

1.9?色譜條件

1.9.1?正離子模式?使用Waters BEH C8（規格是100 mm×2.1 mm，1.7 μm）（Waters，Milford，MA）色譜柱，柱溫為50 ℃，流速為0.35 mL/min。流動相：A相是0.1%甲酸水溶液，B相是0.1%甲酸乙腈溶液。梯度是10% B，維持1 min，在4 min內線性增至40% B，在12 min內增至100% B并維持5 min，在22.1 min處降回初始梯度，并平衡2.9 min。

1.9.2?負離子模式?使用ACQUITY UPLC HSS T3（規格是100 mm×2.1 mm，1.8 μm）（Waters，Milford，MA）色譜柱，柱溫為50 ℃，流速為0.35 mL/min。流動相：A相是水添加6.5 mM NH4HCO3;B相是含95%甲醇和6.5 mM NH4HCO3水溶液。梯度是0% B，維持1 min，在2 min內線性增至40%B，在13 min內增至100% B并維持5 min，在22.1 min處降回初始梯度，平衡2.9 min。

1.10?質譜條件?正離子模式下質荷比的掃描范圍是80～1 200 Da，噴霧電壓是3.50 kV;負離子模式下質荷比的掃描范圍是70～1 000 Da，質譜的分辨率是30 K。離子源參數：毛細管溫度是350 ℃，噴霧電壓和毛細管電壓：4.5 kV和49 V，離子傳輸電壓：100 V，鞘氣和輔助氣流速分別是45和8個單位（arbitrary units）。分辨率是12e4。

1.11?觀察指標?選取接受腹水回輸治療前后患者的肝功能、凝血象、腎功能實驗室檢測結果以及觀察臨床證候改善情況。

1.12?療效判定標準?中醫證候積分標準參照2002年中華人民共和國藥品監督管理局制定的《中藥新藥臨床研究指導原則》及中華中醫藥學會發布的《中醫內科常見病診療指南》制定。由于舌象和脈象復雜，無法計算分值，故分別對腹大脹滿、青筋暴露、眼干眼澀、面色晦暗、口干燥咽、齒齦出血、五心煩熱等7個臨床癥狀的嚴重程度記分。見表1。

1.13?數據處理?液質聯用平臺采集的原始數據使用SIEVE V2.1軟件實行濾噪、重疊峰解析、標準化等處置，輸出正、負離子峰表，另存為Excel。將表中數據導入SIMCA-P 11.5軟件，在PLS-DA模式下進行分析，結合得分圖、載荷圖、VIP值及非參數檢驗，篩選出差異代謝化合物。依據化合物的質荷比，通過HMDB（Human Metabolome Database，人類代謝組數據庫），KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因和基因組），METLIN等數據庫確認差異代謝化合物。將差異代謝物輸入MetaboAnalyst，獲得相關代謝途徑。

1.14?統計學方法?采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，計量數據以均數±標準差（±s）表示，采用配對t檢驗;計數資料用百分比/率（%）表示，采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2?結果

2.1?臨床療效分析

2.1.1?38例患者水超濾濃縮回輸治療前后中醫癥候總積分比較?治療前患者中醫癥候總積分（14.00±2.12）分，治療后為（9.20±1.64）分，治療前后比較差異有統計學意義（P=0.008，P<0.01）。

2.1.2?38例患者水超濾濃縮回輸治療前后中醫各癥狀積分比較?治療后腹大脹滿、青筋暴露、眼干眼澀、口干燥咽、五心煩熱積分與治療前比較，差異有統計學意義（P<0.01，P<0.05），均治療后優于治療前;而面色晦暗、齒齦出血的癥狀，治療前后比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.1.3?38例患者腹水超濾濃縮回輸治療前后肝功能和凝血功能比較?治療后ALT、AST、TBIL下降，與治療前比較，差異有統計學意義（P<0.05）;治療后TP、ALB在升高，差異有統計學意義（P<0.01）;治療后ALP、γ-GT下降，與治療前比較，差異無統計學意義（P>0.05）;治療前后PT、APTT比較無明顯變化。見表3。

2.1.4?38例患者腹水超濾濃縮回輸治療前后腎功能比較?治療后Cre、Urea下降，與治療前比較差異有統計學意義（P<0.01）;治療后UA下降，但差異無統計學意義（P>0.05）。見表4。

2.2?腹水代謝組學分析

利用代謝組學在小分子水平分析肝硬化腹水患者的發病機制，排除合并肝癌肝衰竭患者的病例，選取17例單純肝硬化腹水患者進行代謝組學分析。把17例肝硬化腹水患者的腹水代謝組學結果按照治療前后分為2組，將輸出的正、負離子表導入SIMCA-P 11.5軟件中，構建PLS-DA模型，得到得分圖和載荷圖。由于負離子模式下PLS-DA預測能力均較差，正離子模式下PLS-DA預測能力均較理想，故采用正離子模式分析。分析結果如下所示。

2.2.1?PLS-DA模式下得分圖?圖中每一個點代表一個樣本，黑點代表治療前，主要分布在第一象限，紅點代表治療后，主要分布在第三象限，治療前后樣本可以很好的區分，驗證了腹水超濾濃縮回輸治療的有效性，說明腹水回輸治療可顯著影響肝硬化腹水患者內環境中代謝物的水平。見圖1。

2.2.2?PLS-DA模式下載荷圖?圖每一點代表一個代謝化合物。遠離中間原點的變量，對模型組建、組間分別預測的可信度更高。圖中可見多個遠離中心的變量，這些變量作為模型構建中的關鍵變量，間接說明腹水超濾濃縮回輸治療前后代謝物存在顯著變化。見圖2。

2.2.3?水超濾濃縮回輸治療前后差異代謝化合物篩選?在PLS-DA模型中篩選出VIP值大于1的變量，在HMDB、KEGG、METLIN等數據庫中篩選出該變量對應的代謝化合物，鑒定出13個VIP大于1的小分子代謝化合物。包括10-十一碳烯酸、吲哚乳酸、磷酸、龍葵堿、DL-色氨酸、棕櫚酸、十六碳烯酸、8，11，14-二十碳三烯酸、十六碳二烯酸、鵝去氧膽酸、順烏頭酸、檸檬酸和膽酸，說明腹水回輸治療肝硬化腹水對上述化合物影響顯著。其中與腹水回輸治療肝硬化腹水關系密切的化合物有5種，包括順烏頭酸、檸檬酸、鵝去氧膽酸、膽酸和棕櫚酸。見表6。

2.2.4?水超濾濃縮回輸治療前后差異代謝物相關代謝途徑分析?為了鑒定腹水回輸治療前后可能受影響的代謝途徑，我們利用MetaboAnalyst（http：//www.metaboanalyst.ca/）分析腹水超濾濃縮回輸治療前后顯著差異，VIP大于1的代謝物。圖3中可示5條代謝通路，包括檸檬酸循環（三羧酸循環）、原發性膽汁酸生物合成、乙醛酸鹽代謝、脂肪酸的生物合成、色氨酸代謝。圖中顏色越深表示代謝物在代謝途徑中所占比例越高，-log（P）值越大代表代謝途徑越有意義。檸檬酸循環、原發性膽汁酸生物合成為紅色，表明腹水超濾濃縮回輸治療肝硬化腹水前后檸檬酸循環、原發性膽汁酸生物合成中相關代謝物的比例最高。其他代謝通路均為橙色，漸變為黃色，說明腹水超濾濃縮回輸治療前后這些代謝途徑中相關代謝物的比例較低。其中腹水回輸治療肝硬化腹水密切相關的通路包括檸檬酸循環（三羧酸循環）、原發性膽汁酸生物合成和脂肪酸生物合成。

3?討論

腹水是體內水液代謝障礙，聚于腹中而成。疾病日久可傷及肝腎，肝病及脾，脾主運化全身水液，脾傷則運化失[8]，體內水液失于運布，久則及腎，腎主機體氣化功能，腎傷則氣化不行，水濕不化，因而濕聚為水，加重水液的聚集。本研究結果顯示，腹水回輸治療肝腎陰虛型肝硬化腹水后患者中醫癥候總積分及中醫各癥候積分均降低，面色晦暗，腹大脹滿，目睛干澀，牙齦出血，口燥咽干，五心煩熱等癥狀明顯改善，說明腹水回輸治療可能可恢復肝脾腎對水液的運化功能，調節水液疏布紊亂。腹水回輸經過細菌過濾器進行2次濾過后，截留白蛋白、補體等有利物質再回輸腹腔內，腹水蛋白被重新吸收入血后，減少了蛋白質的丟失，提高了血漿TP、ALB水平，增加了膠體滲透壓和有效循環血量，患者肝功能得到明顯改善，故可見腹水回輸治療后TP、ALB明顯升高，ALT、AST、TBIL較前降低。腹水回輸可以濾過肌酐、尿素、尿酸等小分子內毒素，同時隨著有效血容量的增加以及腹壓的降低使腎血管壓迫減輕，從而使腎血流量增多，腎小球濾過增加，患者腎功能得到明顯改善，故可見腹水回輸治療后Cre、Urea明顯降低。腹水回輸治療在臨床上取得較好的療效，本研究欲從分子生物學方面，進一步探討腹水回輸治療肝腎陰虛型肝硬化腹水的機制。

肝腎陰虛型肝硬化腹水患者治療前后順烏頭酸、檸檬酸、鵝去氧膽酸、膽酸和棕櫚酸差異顯著，說明雙重腹水超濾濃縮回輸治療可能通過影響小分子化合物水平參與機體三羧酸循環、原發性膽汁酸生物合成和脂肪酸生物合成，從而達到改善患者臨床癥候的效果。

順烏頭酸和檸檬酸是三羧酸循環的重要中間產物和調節點[9]。檸檬酸循環，也被稱作三羧酸循環，在肝臟中進行，是機體全部能量代謝的關鍵，循環中相關物質與機體糖類代謝、氨基酸代謝及脂類代謝密切相關[10]。順烏頭酸含量降低可使檸檬酸在順烏頭酸酶作用下直接產生異檸檬酸，加快檸檬酸循環，促進糖類、脂類及蛋白質的生成與代謝。腹水回輸治療后順烏頭酸和檸檬酸含量均顯著降低，說明腹水回輸治療可能通過降低順烏頭酸及檸檬酸含量來影響機體的檸檬酸循環，進一步影響機體的能量代謝，從而增加機體的能量供應，為肝腎陰虛型肝硬化腹水患者提供部分能源物質。這可能與腹水回輸治療后患者血清白蛋白水平升高有關。

鵝脫氧膽酸和膽酸屬于游離型膽汁酸，參與原發性膽汁酸生物合成。肝硬化患者的肝臟對膽汁酸的攝取和代謝清除功能降低，并且受到側支循環形成及門靜脈高壓的影響，可使膽汁酸直接入血，導致血清膽汁酸升高[11-12]，游離性膽汁酸積聚可產生細胞毒性。法尼醇X受體（FXR）是膽汁酸受體，對膽汁酸代謝起到重要調節作用，其與膽汁酸結合后，可抑制膽汁酸合成的限速酶CYP7A1的轉錄，從而抑制膽汁酸的合成[13]。腹水回輸治療后鵝脫氧膽酸和膽酸含量顯著降低，說明腹水回輸治療可能通過激活FXR，影響膽汁酸合成途徑，減少膽汁酸生物合成，改善內環境。腹水回輸治療后血清T-BIL降低，可能與治療后特異性差異代謝化合物鵝脫氧膽酸與膽酸顯著降低相關。

棕櫚酸，又稱軟脂酸，是一種飽和高級脂肪酸，作為一種游離脂肪酸廣泛存在于人體器官和組織。有研究發現適量的棕櫚酸具有一定的抗氧化應激作用，棕櫚酸合成代謝可刺激細胞產生炎性反應因子，進而誘導核轉錄因子Nrf2和血紅素加氧酶（HO-1）的表達，Nrf2是細胞抗氧化應激反應的關鍵因子，可通過轉錄激活下游靶基因HO-1，通過抗氧化應激反應來維持細胞內環境的穩態，進而起到保護機體的作用[14]。腹水回輸治療后棕櫚酸顯著增加，說明腹水回輸治療可能通過影響脂肪酸生物合成途徑，增加棕櫚酸合成，提高機體抗氧化應激能力，從而起到保護作用。

中醫證型與現代醫學中小分子生物學理論有著明顯的相關性，中醫證型的分子生物學機制研究可以作為中西醫結合的契合點[15]。可通過代謝組學特征，結合中醫理論和西醫機制很好的解釋腹水回輸治療后臨床療效改善的機制。為研究腹水回輸治療肝腎陰虛型肝硬化腹水的機制研究提供新思路。

4?致謝

感謝全國名老中醫白長川老先生在本研究“中醫證候代謝組學”的選題思路給予的啟發和指導，以及在本文總結審閱中提出的重要修改意見。

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（2018-12-29收稿?責任編輯：芮莉莉）