基于切片技術的不同顏色籽粒幼苗發育及花青素累積探討

馮漢宇 魏建華 王旭明 張殿朋 岳躍森 歐陽

摘? ?要：為了明確花青素在籽粒和幼苗組織細胞內的累積分布，采用徒手切片，在顯微鏡下觀察京501、京24、A-44、A-45和A-40-3株系的籽粒糊粉層和幼苗組織。結果表明：京501和京24糊粉層淺黃色，A-44籽粒糊粉層細胞有紅黑色糊粉粒，A-45籽粒糊粉層細胞有紅色糊粉粒，A-40-3籽粒糊粉層細胞有黑色糊粉粒，不同放大倍數條件下A-45的糊粉粒都是紅色，A-40-3的糊粉粒由黑色變為紅黑色;室內條件下京501幼苗胚芽鞘綠色，裸露根系白色，京24幼苗胚芽鞘與裸露根系紫紅色，A-44，A-40-3和A-45幼苗胚芽鞘與裸露的根系淡紫紅色;田間條件下，京501幼苗胚芽鞘淡紫色，露出根系紫紅色，京24、A-44、A-40-3和A-45幼苗胚芽鞘與露出根系深紫紅色。結合以上可知，花青素主要分布在糊粉層、紫紅鞘和根皮層組織細胞內。

關鍵詞：玉米;切片;花青素;累積分布

文章編號： 1005-2690（2019）01-0094-03? ? ? ?中圖分類號： S513; TP391.41? ? ? ?文獻標志碼： B

玉米的種子由果皮、胚、胚乳、糊粉層及黑色層幾部分組成。種子發芽過程中，胚、胚乳和糊粉層能夠再利用，胚發育成幼苗，胚乳和糊粉層被分解供幼芽或苗利用;種子萌發期間胚釋放出一種植物激素誘發糊粉層產生淀粉酶和合成一些蛋白水解酶，淀粉酶將淀粉轉變為可溶的糖類供胚生長，因此糊粉層的生理活動和結構變化關系非常密切 [1]。前人通過切片和顯微技術對種子果皮[2，3]、胚乳細胞[4，5]、胚乳傳遞細胞[6，7]、糊粉層[8]及維管束[9～13]等組織、器官進行了一些研究，而且李廣偉（2016）采用姿態調整裝置設計提高了育種用玉米種子切片取樣自動識別方法的準確性，該方法可為玉米種子自動定向切片問題提供解決方案[14]。但是對于彩色玉米育種用玉米種子切片自動定向問題未能提供解決方案，所以目前還只能采用徒手切片。

本研究以不同顏色糊粉層玉米籽粒為材料，以徒手切片為基礎，調查不同顏色玉米種子萌發到苗期的形態變化，并對糊粉層、莖鞘及根進行顯微結構觀察，力圖從發育生物學的角度，初步探討種子內和幼苗發育期間植株中花青素的累積，以明確其物質分布的結構特點。

1? ?材料與方法

1.1? ?試驗材料

試驗用玉米材料包括：自交系京501，糊粉層黃色;自交系京24，糊粉層黃色;含花青素基因的F5代種子和F6代苗。具體的材料來源參照馮漢宇（2018）[15]，編號A-44株系籽粒糊粉層紅色，A-45株系籽粒糊粉層紅黑色，A-40-3株系籽粒糊粉層黑色。

1.2? ?試驗方法

1.2.1? ?切片制作

取不同顏色的玉米籽粒，清水浸泡4 h，剝取種皮和胚，用F.A.A固定液固定去胚和種皮的籽粒24 h，用95%乙醇處理20 min，用80%乙醇處理20 min，用75%乙醇保存，制成切片，采用徒手切片法，把材料徒手切片[16，17]。把一些自交系京501、京24以及含花青素基因的F5代株系種子播種于小紅盆中，按時澆水，并把一些株系放在外面田里、一些放在實驗室內，觀察和記錄苗的表型變化，在苗長到7葉期時，取一些7葉期的苗，去掉泥土，用清水洗干凈，剪去葉片，截取一部分莖鞘和根，用F.A.A固定液固定24 h，用95%乙醇處理20 min，用80%乙醇處理20 min，用75%乙醇保存，制成切片。

1.2.2? ?切片觀察

徒手進行切片，切片厚度不一，但是均在1 mm以下，采用北京農業生物技術研究中心的Leica熒光正置顯微鏡觀察切片，并用LASV 4.5系統進行顯微拍照。

2? ?結果與分析

2.1? ?不同顯微鏡和光源影響圖像質量

在進行籽粒切片試驗時發現，紅色籽粒糊粉層在顯微鏡自帶光源下為紫黑色，與裸眼觀察不相符，于是采用顯微鏡外置光源，發現籽粒糊粉層是紅色，白色淀粉層的為黃色，臨時采用手機手電筒光源，籽粒糊粉層是紅色，淀粉層白色復原，但是透明的載玻片顯示紅色，與手機圖片下的載玻片顏色不一樣，于是又做了一些糊粉層切片進行仔細觀察，同時加了一些苗期切片認真研究。

2.2? ?顯微鏡下的籽粒糊粉層

在正置顯微鏡觀察了京501、京24、A-44、A-45及A-40-3株系籽粒糊粉層，并在物鏡10倍、20倍、40倍及100倍條件下觀察了A-45和A-40-3糊粉層色澤變化。

由圖2可知，京501和京24糊粉層淺黃色，內部有黃色顆粒，A-45紅色糊粉層細胞內有紅色糊粉粒，A-44紅黑色糊粉層細胞內有紅黑色糊粉粒，A-40-3黑色糊粉層細胞內有紅黑色糊粉粒;在物鏡10倍、20倍、40倍及100倍條件下A-45糊粉層都是紅色，細胞內糊粉粒紅色，A-40-3糊粉層由黑色變為紅黑色，主要是細胞內糊粉粒由黑色變為紅色。由此可知，放大倍數不同，有些糊粉粒色澤可能不一樣。

2.3? ?苗期表型變化

通過苗期表型觀察，發現各個株系苗期表型不一樣。

在室內光線微弱的條件下，京501自交系胚芽鞘綠色，露在土壤外面的一些根系是白色的;京24自交系胚芽鞘紫紅色，露在土壤外面的一些根系也是紫紅色;A-44、A-40-3和A-45這3個株系的胚芽鞘淡紫紅色，露在土壤外面的一些根系也是淡紫紅色。

室外田間條件下與室內不完全一樣，京501自交系胚芽鞘淡紫色，露在土壤外面的一些根系是紫紅色;京24自交系胚芽鞘深紫紅色，露在土壤外面的根系也是紫紅色;A-44、A-40-3和A-45這3個株系的胚芽鞘深紫紅色，露在土壤外面的一些根系是紫紅色，所以A-44、A-40-3和A-45這3個株系調控胚芽鞘花青素累積的基因可能來自京24。

2.4? ?莖鞘與根花青素累積

通過正置顯微鏡觀察了一些幼苗的莖鞘、根皮層維管束組織，發現它們的結構和色澤不盡相同。京24、A-44、A-45和A-40-3的鞘大部分紫紅色，縱向切片觀察發現鞘組織淡紫色，細胞內部有紫色花青素累積物，京501的鞘組織白色，沒有紫色花青素小點，它們的莖維管束組織都是白色;京24、A-44、A-45、A-40-3和京501的紫紅色根組織皮層細胞有紫色花青素累積物，白色皮層和內部維管束沒有花青素累積物。通過以上可知，紫色花青素累積物主要分布在紫紅鞘和根皮層組織細胞內。

3? ?討論與結論

3.1? ?結論

3.1.1? ?顯微鏡下籽粒組織色澤

顯微鏡下自交系京501和京24淺黃色籽粒糊粉層含有黃色顆粒，A-44紅黑色糊粉層細胞內含紅黑色糊粉粒，A-45株系籽粒淀粉層白色，紅色糊粉層細胞內有紅色糊粉粒，在物鏡10倍、20倍、40倍及100倍條件下糊粉層和細胞內糊粉粒都是紅色，A-40-3株系籽粒黑色糊粉層在物鏡10倍、20倍、40倍及100倍條件下由黑色變為紅黑色，主要是細胞內糊粉粒由黑色變為紅黑色。由此可知，放大倍數不同，糊粉粒色澤可能不一樣。

3.1.2? ?苗期花青素表型

各個株系苗期表型不同。在室內光線微弱的條件下，京501自交系胚芽鞘綠色，裸露根系白色，京24自交系胚芽鞘與裸露的根系紫紅色，A-44、A-40-3和A-45株系胚芽鞘與裸露的根系淡紫紅色，室外田間條件與室內不盡相同，京501自交系胚芽鞘變為淡紫色，露出根系紫紅色，京24自交系胚芽鞘與露出根系深紫紅色，A-44、A-40-3和A-45株系的胚芽鞘與露出的根系深紫紅色，所以這3個株系調控胚芽鞘花青素累積的基因可能來自自交系京24。

3.1.3? ?花青素亞細胞分布

幼苗的莖鞘、根皮層維管束組織結構和色澤有差異。京24、A-44、A-45和A-40-3淡紫色鞘組織細胞內部有紫色花青素累積物，京501的白色鞘組織未發現紫色花青素小點，它們的莖維管束組織都是白色;京24、A-44、A-45、A-40-3和京501的紫紅色根皮層細胞內含紫色花青素累積物，白色皮層和內部維管束無花青素累積物。通過以上可知，紫色花青素累積物主要分布在紫紅鞘和根皮層組織細胞內。

3.2? ?討論

3.2.1  ?不同光源與切片厚度影響圖像質量

有的學者采用熒光標記研究玉米維管束組織，并用染色劑染色，再加上不同色光源觀察，只能看到維管束本身，在同一視野下看不清周邊組織[18]。若不使用染色劑染色，則為黑白片，看不到彩色花青素在玉米幼苗莖鞘組織中累積[19]。

Badone（2010）采用原位切片技術進行籽粒組織學觀察，發現花青素在糊粉層累積[20]。在觀察切片的過程中發現不同光源影響切片色彩，切片厚度調節明暗亮度，即使進行縱橫切姿態調整，也無法避免有些厚切片由于光線無法透過而不能使用。

四季草莖切片發現花青素累積在紫紅色莖皮層細胞內，綠色的莖皮層細胞內沒有花青素累積[21]。

采用本色切片技術，沒有使用任何染色劑染色，因為籽粒和幼苗本身就是彩色的，通過切片可以看出籽粒糊粉層黃色無花青素累積，不同倍數的紅色、紅黑色及黑色的糊粉層切片都有彩色糊粉粒。

3.2.2? ?種子萌發成苗與花青素分布

種子從萌芽到苗期花青素累積既受自身基因的調節，也受外部環境的影響。通過對小麥幼苗胚芽鞘切片觀察，發現花青素積累在小麥幼苗胚芽鞘外皮層細胞內，小麥幼苗胚芽鞘分布有紫紅色花青素，而綠鞘小麥幼苗觀察不到花青素[22]。花青素合成途徑是植物次生代謝途徑之一，花青素苷種類的多樣性則源于其不同分支途徑的形成[23]。

不同類型的花青素玉米，其花青素累積與分布不同，爆裂紫玉米花青素主要累積在果皮[24]，而黑玉米花青素可分布在植株和籽粒中[25]。研究發現，除了黑玉米外，紅色玉米植株和籽粒也有花青素分布，進一步切片分析發現花青素主要分布于糊粉層細胞、紫紅鞘和根皮層組織細胞內。

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（收稿日期：2018-08-29）