產咖啡酸刺五加內生細菌CX15的鑒定及活性研究

摘 要：研究內生細菌CX15的活性作用及活性代謝物。采用HPLC法對CX15發酵液中活性代謝物進行分析;采用濾紙片法對內生細菌CX15進行抑菌活性研究;結合形態學特征、生理生化特性及16S rDNA序列同源性分析對該菌株進行了鑒定。結果表明，內生細菌CX15發酵液中含有咖啡酸;同時，該菌株具有較好的抑菌活性;經鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），說明內生細菌CX15為咖啡酸產生菌，該菌可能與宿主植物刺五加具有相同的代謝機制。

關鍵詞：內生細菌;抑菌活性;鑒定;咖啡酸

中圖分類號：R932; Q939.97

文獻標識碼：A

刺五加（Acanthopanax sentcosus（Rupr.et Maxim.）Harms）為北方瀕危藥用植物[1]，具有抗腫瘤[2]，抗氧化、免疫調節[3]，抗抑郁[4]、降血糖[5]等作用，現廣泛應用于食品、藥品領域[6]，其主要活性成分為黃酮類、簡單苯丙素類、有機酸類、香豆素類、三萜皂苷類、氨基酸類以及其他類化合物[7]。

本文基于內生菌與宿主植物在長期協同進化過程中形成了互惠共生關系理論，即：宿主植物為內生菌生長發育提供必需的生態環境，避免外界生物或非生物的干擾等[8];同時，內生菌代謝產物能夠刺激植物生長發育，提供宿主植物對環境脅迫的抵抗能力[9]，刺激宿主產生各種次生代謝產物以維護機體的健康[10]。以刺五加內生細菌CX15為研究對象，對其發酵液中次生代謝產物進行分析;同時也開展活性研究;并對其進行了菌種鑒定。為綜合利用該菌株，采用微生物發酵法生產刺五加活性成分奠定基礎。

1材料與方法

1.1 菌種與培養

供試菌：刺五加內生細菌CX15（黑龍江大學生物制藥專業實驗惠贈）。

NA培養基由牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉組成;PDA培養基由馬鈴薯、葡萄糖組成[11]。

16Sr DNA序列擴增引物（上海生工生物工程股份有限公司）。

1.2儀器與試劑

高效液相色譜儀（FL2 200型，浙江溫嶺）。

試劑：甲醇為色譜純級別，其他試劑均為分析純。

1.3內生細菌CX15發酵液供試品的制備

取已活化的CX15菌株接種于NA液體培養基中，120r/min，37℃振蕩發酵培養5d，取出，于2000r/min離心10min，得發酵液，凍干，備用。

1.4內生細菌CX15發酵液分析

采用HPLC法對CX15菌株發酵液中活性成分進行分析。取內生細菌CX15發酵液分析供試品液，甲醇溶解，微孔濾膜過濾（ 0.45um），取濾液作為供試品溶液。分別精密吸取0.5mg/mL咖啡酸對照品液及供試品液各10uL注入色譜儀，色譜柱：Venusil XBP-C18柱;流動相：甲醇-水-磷酸（30：70： 0.2）;流速：1 mL/min;檢測波長：254nm。

1.5抑菌活性檢測

取內生細菌CXl-5發酵液的供試品，以適量甲醇溶解成1mg/mL的供試品液，過濾（0.22um無菌濾器），采用濾紙片法[12]，進行抑菌活性測定。

1.6內生細菌CX15菌株鑒定

1.6.1內生細菌CX15形態學觀察及生理生化指標測定

形態學鑒定主要觀察內生細菌CXl5菌株的菌落、細胞形態，革蘭氏染色，有無鞭毛等;生理生化測定主要選取以下微生物常用的指標進行鑒定：生長溫度的測定，需氧性的測定，耐鹽性的測定，耐酸堿度的測定，生長曲線的測定，淀粉水解反應，明膠液化試驗，酶的測定，甲基紅試驗，運動性試驗等[13]。

1.6.2 16S rDNA序列擴增和序列分析

利用細菌16S rDNA基因的通用引物對內生細菌CX15菌株進行PCR擴增，對擴增產物進行核苷酸序列測定。將獲得的序列與GenBank中相關菌株的16S rDNA序列進行同源性分析，并利用最大簡約法構建16S rDNA系統進化樹[14]。

2結果與分析

2.1 內生細菌CX15發酵液分析結果

通過HPLC法，以咖啡酸為對照，對CX15發酵液中活性成分進行分析，在CX15發酵液中檢測到咖啡酸，而陰性對照（培養基）無干擾;同時CX15發酵液中色譜峰采用對照品加入法，得到了較好的確認，其結果如圖1及圖2所示;同時，在CX15發酵液中還存在與刺五加生藥相同的未知成分x，說明在CX15發酵液中含有大量的與宿主植物刺五加相同或相似的活性代謝物。

2.2抑菌活性檢測結果

刺五加內生細菌CX15發酵液對11種致病菌均有不同程度的抑制作用，結果見表1。

2.3內生細菌CX15菌株鑒定結果

2.3.1內生細菌CX15菌株形態學觀察及生理生化指標測定結果

CX15菌株形態學觀察及生理生化指標測定結果見表2。

2.3.2 16S rDNA序列擴增和序列分析結果

CX15菌株PCR擴增后得到1條1603bp的特異性條帶，通過GENBANK比對，CX15（登錄號為：JQ756968）與枯草芽孢桿菌KT873853.1序列相似性達到92%，綜合生理生化和16S rDNA基因序列的分析結果，初步鑒定菌株CX15為枯草芽孢桿菌（Bacillus suhtilis）。菌株CX15系統發育樹見圖3。

3結論

本研究對刺五加內生細菌CX15發酵液進行初步分析，發現在刺五加內生細菌CX15發酵液中存在與宿主植物刺五加相同的活性成分咖啡酸，說明內生細菌CX15為咖啡酸產生菌;同時也說明刺五加內生細菌CX15在次生代謝產物產生機制方面與宿主植物刺五加有著相似之處。為了深入開發應用內生細菌CX15，對其進行了抑菌活性研究，也同時對其進行了菌株鑒定。若開展系統提取分離法，對CX15發酵液中咖啡酸等活性代謝物進行分離、鑒定等研究將具有重要意義。以CX15為發酵菌株，開展微生物發酵法生產咖啡酸原料及CX15菌株的綜合利用研究工作還在繼續進行中。

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作者簡介 ：康勛 （ 1978- ），男，江省濱人，高級藝師，現從事業技術推廣與服務工作。