基于非標記蛋白質組學技術研究白羽肉雞不同部位肌肉的蛋白差異

劉志紅，奈日樂，謝遇春，米 璐，馬麗娜，趙 濛，孫 昂，李金泉，王志新,*

（1.內蒙古農業大學動物科學學院，內蒙古自治區動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，農業部肉羊遺傳育種重點實驗室，內蒙古自治區山羊遺傳育種工程技術研究中心，內蒙古 呼和浩特 010018；2.內蒙古農牧業科學院，內蒙古 呼和浩特 010018；3.內蒙古農業大學經濟管理學院，內蒙古 呼和浩特 010018）

白羽肉雞別名AA雞，具有抗病力強、肉質細嫩、飼養周期短等特點。相比于其他肉類，雞肉具有高蛋白、低脂肪、低膽固醇和低熱量等特點[1-2]。每100 g雞肉中含有接近其總質量1/5的蛋白質[3]，相比于豬肉、牛肉、羊肉等高產量肉類，雞肉的蛋白質含量最高。研究表明，烘干基礎上，機械去骨雞肉與新鮮雞胸肉蛋白質含量分別高達90.5%和82.2%，雞肉的氨基酸組成比例均一，蛋白功效比和利用率均很高[4-5]，具有很高的生物價值和消化率。隨著白羽肉雞胴體質量等級的增加，雞胸肉與雞腿肉的質量與內聚性、咀嚼性呈顯著負相關，與硬度呈極顯著負相關[6]。雞胸肉是典型的白肌肌肉，雞腿肉是典型的紅肌肌肉，紅肌和白肌的化學組成和功能特性均存在差異，雞胸肉中含B族維生素較多，因此可以保護皮膚，減輕疲勞，雞腿肉中含有較多的鐵質，可以改善缺鐵性貧血[7]。不同部位的雞肉蛋白質組存在差異。雞肉蛋白質的氨基酸組成比例均衡，且鮮味氨基酸、支鏈氨基酸和抗氧化性氨基酸含量較高，但組成蛋白質的各氨基酸比例存在較大差異[8]。

作為肌肉的重要組成部分，蛋白質的改變會引起肌肉品質的變化[9]。蛋白質的變化規律有其自身的特定性，通常這些特性無法通過基因組學直接反應出來[10]，而蛋白質組學是有效的檢測工具。隨著組學技術的發展，基于質譜的蛋白質組學技術廣泛應用于豬[11]、雞[12]、牛[13]、羊[14]肉質的研究中。Lamctsch等[15]運用質譜技術發現，宰后肌肉組織中鈣蛋白酶的含量與豬肉的嫩度相關。黃曉毅[16]研究發現，肉品質變化可能與熱休克蛋白相關。Doherty等[17]闡述了蛋雞胸肌蛋白質的組成，揭示了相關蛋白質在生長期集中表達的差異。這些研究表明，蛋白質組學技術是鑒定肉質蛋白差異的有利工具。本研究利用非標記蛋白質組學定量技術SWATH（sequential window acquisition of all theoretical fragment-ion spectra）和數據非依賴型采集（data independent acquisition，DIA）技術，對白羽肉雞雞腿肉與雞胸肉進行蛋白質鑒定和定量分析，以期為雞肉肉質形成的分子機制和品質快速鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣本由3 只白羽肉雞（35 日齡）作為生物重復，分別采集3 只雞的雞腿肉與雞胸肉。

蛋白裂解液、尿素、胰蛋白酶（Trypsin）、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、碳酸氫銨 美國賽默飛世爾公司。

1.2 儀器與設備

－80 ℃冰箱 美國賽默飛世爾公司；98-IIIN超聲波粉碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；Z323K低溫離心機 德國Hermle公司；QT-901渦旋儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Eksigent Technologies液相色譜儀、TOF 5600質譜儀 美國AB Sciex公司。

1.3 方法

1.3.1 總蛋白提取

取適量樣品置于含有液氮的研缽中研磨成粉末狀，將樣本轉移至1.5 mL離心管中，加入1 g/100 mL十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）裂解液，每隔1 min在渦旋儀上渦旋30 s，20 min后結束；超聲破碎2 min，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取上清；使用BCA（Bioteke）試劑盒進行總蛋白質量濃度測定。

1.3.2 總蛋白酶解

取蛋白含量100 μg的樣品，加入200 μL含8 mol/L尿素和10 mmol/L DTT的混合溶液，37 ℃變性1 h，12 000 r/min離心40 min，加入200 μL尿素，振蕩、12 000 r/min離心30 min，重復2 次；加入200 μL 50 mmol/L IAA避光反應30 min，12 000 r/min離心30 min；加入100 μL 100 mmol/L碳酸氫銨，12 000 r/min離心20 min，重復3 次；加入適量Trypsin 37 ℃孵育過夜，12 000 r/min離心30 min；加入50 μL 100 mmol/L碳酸氫銨，12 000 r/min離心30 min，重復2 次；收集濾液，凍干，備用。

1.3.3 總蛋白鑒定

取100 μg凍干粉，50 μL 2%乙腈水溶液復溶，利用DIA與SWATH方法上機鑒定總蛋白與差異蛋白。離子源：DIA掃描模式：正離子模式；噴霧電壓2.3 kV；離子源溫度150 ℃。蛋白鑒定模式：一級掃描模式：全掃描；一級掃描范圍：150～1 200m/z；質譜分辨率設為30 000；選擇窗口：0.4 Da；碎裂模式：誘導碰撞解離（collision-induced dissociation，CID）；碎裂能量：動態碎裂；二級掃描范圍：100～1 500m/z；循環模式：動態排除掃描；動態排除時間18 s；SWATH定量模式：一級掃描模式：全掃描；一級掃描范圍：150～1 200m/z；質譜分辨率設為30 000；間隔窗口25 u（如400～425（m/z）、424～449、448～473, ,1 175～1 200）；碎裂模式：CID；碎裂能量：動態碎裂；二級掃描范圍：100～1 500m/z；循環模式：依次均勻掃描。

1.4 數據處理

1.4.1 蛋白鑒定

將液相色譜-質譜連用采集的雞腿肉與雞胸肉DIA數據利用Protien Pilot 4.5軟件進行搜庫，蛋白數據庫來源于UniProt/Swiss-Prot。

保留時間校準：利用PeakView軟件，對雞腿肉和雞胸肉的SWATH數據與DIA數據進行比對，進行保留時間校準，做定量分析。

1.4.2 差異蛋白的篩選

通過LOG2（Fold Change）與－LOG10（Pvalue）值繪制火山圖，應用Marker View軟件，以Pvalue＜0.05、差異倍數（Fold Change）＞2或＜0.5作為閾值，選取雞腿肉和雞胸肉的差異蛋白。

1.4.3 基因本體論（gene ontology，GO）富集分析

GO富集分析使用DAVID Bioinformatics Resources 6.8軟件的功能注釋一欄對篩選出的差異蛋白按照細胞學組分、分子功能及生物學過程進行分類，使用默認設置進行。

2 結果與分析

2.1 雞胸肉與雞腿肉總蛋白的提取

采用BCA（Bioteke）試劑盒對總蛋白質量濃度進行測定，得到的總蛋白質量濃度標準曲線方程為y=0.012 5x+0.092 4（R2=0.991 3），說明標準曲線比較理想，可以用于樣品蛋白質量濃度的計算。根據蛋白在595 nm波長處的吸光度（A595nm）及標準曲線方程，計算不同部位肌肉樣品的蛋白質量濃度，結果如表1所示。

表1 不同部位肌肉的蛋白質量濃度Table 1 Protein concentration of different carcass parts

取蛋白含量30 μg的樣品進行蛋白均一化，并進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）檢測。由圖1可知，蛋白質提取效果較好，條帶均一，說明蛋白質量濃度測定準確，可用于后期實驗。

2.2 雞胸肉與雞腿肉總蛋白的鑒定

以UniProt/Swiss-Prot數據庫為背景，對雞腿肉和雞胸肉蛋白質進行鑒定，初步建立雞腿肉和雞胸肉的蛋白質表達譜。由圖2可知，1%假陽性（false discovery rate，FDR）條件下檢測到875 個蛋白質及16 855 條肽段。

對總蛋白進行GO組分富集分析，由圖3可知，在生物學進程中參與生物學轉化過程的蛋白質最多，其次為蛋白質穩定化功能；在細胞組分中，富集于胞外外泌體中的蛋白質最多，其次富集于細胞質內；在分子功能中，參與分子功能的多聚核糖核酸結合功能的蛋白質最多，其次為ATP結合功能。

2.3 雞胸肉與雞腿肉的主成分分析

主成分分析是基于原有變量建立兩兩不相關的反應差異蛋白質組數據原有信息的新變量信息[11]。通過主成分分析構建反映雞胸肉與雞腿肉差異蛋白質組信息的分析圖，直觀顯示雞腿肉和雞胸肉的蛋白質組成差異。

由圖4可知，技術重復性均較好，表明儀器狀態良好，數據可信，并且2 組分布在不同區間，說明雞腿肉與雞胸肉的蛋白質組有較大差異。

2.4 雞胸肉與雞腿肉差異蛋白的篩選與鑒定

由圖5可知，以P value＜0.05、Fold Change＞2或＜0.5作為閾值，篩選出雞腿肉和雞胸肉的差異蛋白98 個。其中雞腿肉中上調蛋白71 個，雞腿肉中下調蛋白，即雞胸肉中上調蛋白27 個。

對雞腿肉中的上調蛋白進行GO組分富集分析，由圖6可知，這些蛋白參與酰基輔酶A脫氫酶催化的脂肪酸β-氧化、三羧酸循環及脂質體內平衡等生物學過程；在細胞組分中，主要富集于線粒體；在分子功能中，參與氧化還原酶活性功能、脂肪酰基輔酶A結合功能、NAD結合功能、肌動活動功能、電子載體活性、黃素腺嘌呤二核苷酸結合功能及催化活性等。

對雞胸肉中的上調蛋白進行GO組分富集分析，由圖7可知，在生物學進程中，骨骼肌收縮與心肌收縮過程中富集的蛋白質最多；在細胞組分中富集于胞外外泌體中的蛋白質最多，且沒有蛋白質富集于分子功能中。

3 討 論

蛋白質是生理功能的執行者，利用蛋白質組學方法可以從全新的角度來分析與肉質相關的問題，有望運用蛋白質組學技術對肌肉品質進行有效控制[18-20]。研究表明，蛋白質組成的變化可能引起與肌肉嫩度相關的變化[21]。目前，蛋白質組學多用于篩選多組樣品之間關鍵的有意義差異蛋白[22-23]。本研究利用DIA技術鑒定雞胸肉與雞腿肉的總蛋白，再利用SWATH技術對雞胸肉與雞腿肉進行定量分析，篩選差異蛋白，并通過GO富集分析差異蛋白肉的功能特性，為不同類型雞肉形成的分子機制研究提供參考。

對雞肉進行分類發現，雞腿肉是紅肌肌肉，而雞胸肉是白肌肌肉，紅肌肌肉和白肌肌肉在化學組成和執行功能上存在一定差異[24]。Lesiow等[25]研究發現，雞腿肉蛋白形成的凝膠比雞胸肉蛋白凝膠硬度小。Fretheim等[26]研究表明，雞胸肉蛋白的保水性顯著大于雞腿肉蛋白。廖國周等[27]運用雙向電泳技術篩選云南騰沖雪雞腿肌與胸肌的差異蛋白，結果表明，腿肌含有高表達蛋白點56 個，經鑒定，對應9 種蛋白質；胸肌中含有高表達蛋白點54 個，對應10 種蛋白質。本研究篩選出雞腿肉中的高表達蛋白71 個，雞胸肉中27 個，鑒定數量較多。雞腿肉中的上調蛋白主要參與酰基輔酶A脫氫酶催化的脂肪酸β-氧化、三羧酸循環等生物學過程；在分子功能中，其主要參與氧化還原酶活性、脂肪酰基輔酶A結合等功能；并且主要富集于細胞組分線粒體內。三羧酸循環是化學合成和能量代謝的核心，氧化還原酶可以催化底物發生氧化還原反應，而線粒體則是進行氧化代謝的重要細胞器[28-29]。由GO富集分析可知，雞腿肉中的高表達蛋白均富集于運動相關功能中，可能與腿肌具有負重與行走等功能、需參與有氧與無氧運動有關。對韓國土雞腿肉運用雙向電泳分析蛋白差異發現，高表達的蛋白質主要為磷酸葡萄糖變位酶1、肌鈣蛋白、熱休克蛋白B1、細胞色素C還原酶、乙醛酸酶1和DNA甲基轉移酶3b，其中磷酸葡萄糖變位酶1、肌鈣蛋白和乙醛酸酶1等均與腿肌運動相關，此結果與本研究對雞腿肉的功能推測相符[30]。對雞胸肉中的上調蛋白進行GO組分富集分析，結果表明，在生物學過程中，在骨骼肌收縮與心肌收縮過程富集的蛋白質較多，在細胞組分中富集于胞外外泌體中的蛋白質最多，且沒有蛋白質富集于分子功能中。雞胸部肌肉的主要功能有使肱骨內收、協助肱骨內旋、輔助深呼吸肌及上提肋骨等，因此可能導致雞胸肉中富集于肌肉收縮功能的上調蛋白較多。Cai等[31]研究木質雞胸肉和普通雞胸肉，運用雙向電泳技術篩選出8 個差異蛋白點，分別為與肌肉收縮、蛋白銜接、血漿中蛋白、糖酵解、ATP再生功能相關的蛋白質，而肌肉收縮、ATP再生功能與本研究雞胸肉所參與的功能基本相符。2 組數據的GO富集分析結果表明，雞腿肉和雞胸肉中的高表達蛋白均富集于完全不同的功能中，這與雞腿肉與雞胸肉的肉質差異有關。

4 結 論

雞腿肉和雞胸肉中共有875 個蛋白質與16 855 條肽段，共篩選出98 個差異蛋白，其中包括雞腿肉中的上調差異蛋白71 個。GO功能分析結果表明，雞腿肉中的高表達蛋白均富集于運動相關功能中，而雞胸肉中的上調蛋白多富集于肌肉收縮功能。