大豆肽-鈣螯合物制備條件優化與質量評價

李國良 侯俊財

(1.黑龍江八一農墾大學動物科技學院， 大慶 163319; 2.東北農業大學食品學院， 哈爾濱 150030; 3.東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室， 哈爾濱 150030)

0 引言

大豆及其新產品的開發越來越引起研究者的關注[1]。大豆蛋白作為一種優秀的膳食蛋白，被我國等亞洲國家視為最重要的可食用蛋白來源之一[2-3]。大豆蛋白中包含人體所需要的8種必需氨基酸，大豆蛋白消化率校正氨基酸評分為1.0[4]。大豆肽通過蛋白酶水解獲得，與傳統的大豆蛋白相比，大豆肽具有分子量小、容易消化吸收、無豆腥味等優點[5-6]。除了具有良好的理化特性外，大豆肽還可以提供人體所需要的營養物質，同時具有調節人體生理機能、預防骨質疏松、降低心血管疾病和高血壓的風險等保健功效[7-9]。

鈣元素是人體生長發育的重要元素之一，約占人體質量的1.5%～2%[10-11]。人體牙齒和骨骼中的鈣約占鈣總量的99%，其余1%的鈣位于人體軟組織內和血液中[12]。人類日常飲食中若缺乏鈣，則會增加多種疾病的發生風險[13]。螯合是指配位體與金屬離子的一種特殊類型的絡合，螯合物是指一個或多個基團與一個金屬離子的配位反應所形成的環狀結構[14-15]。大豆肽-鈣螯合物是由可溶性的鈣離子與大豆肽按一定物質的量比以共價鍵結合而成，從結構的角度可以定義為：氨基酸的氨基端和羧基端與金屬鈣離子按一定的配比形成的環狀結構產物[16]。

大豆脫脂豆粕是大豆提油后的副產物，其中的粗蛋白質量分數高達30%～50%，然而其利用率卻較低，多用作動物飼料[17]。豆粕的酶水解能夠有效改善其功能特性，并拓寬其應用領域。大豆肽-鈣螯合物是將鈣元素與大豆肽結合起來制成的新一代補鈣營養性食品，可同時補充給人體所必需的鈣元素和氮源，具有鈣元素的利用率高、溶解性強和容易被人體吸收等優點[18]。文獻[19]利用堿性蛋白酶進行大豆分離蛋白的酶解以及類蛋白反應修飾，并在醇-水介質中對其進行類蛋白反應修飾。文獻[20]研究了酶解時間以及酸法脫酰胺改性對于脫植酸大豆分離蛋白肽鈣離子螯合能力的影響，并對鈣螯合物的結構特性和營養特性進行了分析。

本文以國產大豆脫脂豆粕為主要原料，研究肽鈣比、反應溫度、反應時間和pH值對鈣結合量的影響，經過單因素和響應面優化試驗，篩選大豆肽-鈣螯合物最佳制備工藝，旨在為新型大豆營養保健產品及合成新型補鈣制劑的研發提供新方法、新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆脫脂豆粕來自哈高科大豆食品有限責任公司；堿性蛋白酶來自諾維信(中國)生物技術有限公司；酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、鹽酸、硼酸、無水氯化鈣、乙醇胺、鄰甲酚酞、8-羥基喹啉、鄰苯二甲醛、β-巰基乙醇、硫酸銅等均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀，上海伍豐科學儀器有限公司；ALC-310.3型電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；pHS-3C型精密pH計，塞多利斯科學儀器(北京)有限公司；LD4-2A型離心機，北京醫用離心機廠；電動攪拌器，金壇市醫療儀器廠；DHG-9240型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司；電磁爐，廣東容聲電器股份有限公司；721型分光光度計，上海元析儀器有限公司；游標卡尺，上海量具刃具廠有限公司；S-3400N型掃描電子顯微鏡，日立掃描電鏡公司。

1.3 加工工藝及要點

大豆鈣肽產品的加工工藝為：大豆蛋白→大豆蛋白液→加入蛋白酶，酶解→滅酶→離心取上清液→冷凍干燥→取一定量加入氯化鈣→螯合→冷凍干燥→大豆鈣肽產品。其工藝要點如下：

(1)大豆蛋白液制備：取大豆蛋白溶于水中，制成蛋白溶液，可加熱加速其溶解。加入1 mol/L的氫氧化鈉將蛋白溶液pH值調節至7.0～8.0。

(2)酶解：向蛋白溶液中準確加入一定比例的堿性蛋白酶，將溶液調節至該蛋白酶最適條件(pH值8.0，最適溫度50℃)進行水解，pH值保持恒定，偏差在±0.01范圍內。

(3)滅酶：待反應結束后，溶液迅速升溫至90℃，滅酶10 min。

(4)離心、冷凍干燥：滅酶后冷卻至室溫(20℃)，pH值調到7.0，離心(4 000 r/min，20 min)，收集上清液，即大豆肽溶液，冷凍干燥。

(5)螯合：50 g/L的肽溶液與0.04 mol/L氯化鈣按一定肽鈣比(肽溶液與氯化鈣溶液質量比)進行混合，調節pH值，充分混合后，在一定溫度下反應一段時間。

(6)成品：螯合后進行冷凍干燥，即得大豆肽-鈣成品。

1.4 檢測方法

鈣結合量的測定采用鄰甲酚酞比色法；溶解性的測定采用雙縮脲法。

1.5 試驗設計

1.5.1單因素試驗

(1)肽鈣比

選擇1、2、3、4、5、6共6個肽鈣比，固定pH值6.0，反應時間30 min，反應溫度35℃的條件下，對鈣結合量進行測定，以研究肽鈣比對鈣結合量的影響。

(2)反應溫度

選擇30、35、40、45、50℃共5個溫度梯度，固定肽鈣比為2，pH值7.0，反應時間為45 min的條件下，對鈣結合量進行測定，以研究反應溫度對鈣結合量的影響。

(3)反應時間

選擇25、30、35、40、45、50 min共6個時間梯度，固定肽鈣比為2，pH值7.0，反應溫度35℃的條件下，對鈣結合量進行測定，以研究反應時間對鈣結合量的影響。

(4)pH值

選擇4.0、5.0、6.0、7.0、8.0共5個pH值，固定肽鈣比為2，反應時間30 min，反應溫度35℃的條件下，對鈣結合量進行測定，以研究pH值對鈣結合量的影響。

1.5.2大豆肽-鈣合成工藝優化

在單因素試驗的基礎上，設計Box-Benhnken的中心組合試驗，選取四因素三水平的響應面分析試驗對大豆鈣肽合成工藝進行優化。

1.6 大豆肽-鈣螯合物的分子量分布測定

利用高效液相色譜法對大豆肽-鈣螯合物的分子量分布情況進行表征[18]。采用乙腈-水-三氟乙酸(體積比45∶55∶0.1)作為流動相，用于溶解大豆肽-鈣螯合物樣品，控制最終質量濃度為5 mg/mL，通過濾膜過濾和超聲后進樣。試驗參數設置：進樣量為20 μL，流速為0.5 mL/min，柱溫為30℃，檢測器波長為214 nm，進樣時間為35 min。

1.7 試驗數據處理

所有數據采用Excel 2010進行處理，并通過SPSS 17.0對數據進行單因素方差分析。采用Design-Expert 7.0軟件，根據Box-Benhnken中心組合原理進行響應面試驗設計和回歸分析。

2 試驗結果與分析

大豆分離蛋白在經過堿性蛋白酶水解后，形成小分子量的大豆肽，這些大豆肽在一定條件下可與鈣離子結合，形成肽-鈣螯合物。但在螯合過程中有許多因素制約著螯合物中的鈣結合量[21]。因此，需要進一步討論螯合工藝的最佳條件，確定最優螯合條件，從而達到高含鈣量的目的。

2.1 螯合條件對鈣結合量的影響

2.1.1標準曲線的確定

鄰甲酚酞與鈣在pH值11.0±0.1的緩沖液中形成紫色絡合物，利用可見分光光度計測定其吸光度，其最大吸收波長為570 nm。用掩蔽劑(8-羥基喹啉)消除其他二價陽離子的干擾。反復測定8次，得出標準曲線如圖1所示。

圖1 鈣含量標準曲線Fig.1 Standard curve of calcium content

2.1.2肽鈣比對鈣結合量的影響

肽鈣比是螯合工藝的重要參數，對鈣結合量起著至關重要的作用。肽含量少，無法與鈣完全結合；肽含量過多，與鈣結合完仍有剩余，造成不必要的耗損[22]。在pH值6.0、反應時間30 min、反應溫度35℃的條件下，考察不同肽鈣比對鈣結合量的影響，試驗結果如圖2所示。

圖2 肽鈣比對鈣結合量的影響Fig.2 Effect of peptide calcium ratio on calcium-binding capacity

從圖2可以看出，當肽鈣比為2時，鈣結合量達到最大值70.87 mg/g。繼續增加肽鈣比，鈣結合量越來越低。呈現這種變化趨勢主要是因為當肽鈣比為1時，肽含量少，無法與鈣完全結合；當肽鈣比大于2時，與鈣完全結合后，肽仍有剩余，導致每克中鈣含量減少。因此，后續試驗中選擇肽鈣比為2作為最適值。

2.1.3pH值對鈣結合量的影響

pH值是鈣結合量的重要影響因素之一。在大豆肽與鈣螯合反應中，—COO—有至關重要的作用。Ca2+屬于硬酸，易與氨基酸中的羧基發生配位作用，但與氮原子的配位作用較弱。在酸性條件下，大豆肽會發生解離生成—COO—，使得與Ca2+結合的—COO—增加，在pH值大于6.5時，由于質子化氨基的解離,可與Ca2+形成包括O、N配位原子的配合物，部分大豆肽與Ca2+通過吸附作用結合[23]，從而使得鈣結合量在pH值為7時達最大值。因在堿性條件下，OH—會與Ca2+反應產生Ca(OH)2，影響大豆肽與鈣的螯合，因此，本試驗不研究堿性條件下的螯合。

在肽鈣比為2，反應時間30 min，反應溫度35℃，分別在不同pH值的條件下進行螯合，然后測定鈣結合量，試驗結果如圖3所示。通過此單因素試驗可看出，在pH值為7.0時，鈣結合量達到最大值，因此，在后續試驗中選擇pH 值7.0作為最佳參數。

圖3 pH值對鈣結合量的影響Fig.3 Effect of pH value on calcium-binding capacity

2.1.4反應時間對鈣結合量的影響

在肽鈣比為2，控制pH值7.0，反應溫度35℃的條件下，分別反應25、30、35、40、45、50 min，然后測定鈣結合量，考察反應時間對鈣結合量的影響，結果如圖4所示。

圖4 反應時間對鈣結合量的影響Fig.4 Effect of reaction time on calcium-binding capacity

由圖4可知，螯合反應是需要一定反應時間的，30 min前反應較劇烈，30 min后變化趨于平穩，當反應時間為45 min時，鈣結合量達到最大值，即75.89 mg/g。大豆肽與Ca2+通過吸附作用結合，隨反應進行著動態的吸附和解析的過程，當45 min時整個過程達到動態平衡，因此，后續試驗選擇反應時間45 min為最佳參數。

2.1.5反應溫度對鈣結合量的影響

在肽鈣比為2，pH值7.0，反應時間為45 min的條件下，選取反應溫度為30、35、40、45、50℃進行試驗，然后測定鈣結合量，考察反應溫度對鈣結合量的影響，結果見圖5。

圖5 反應溫度對鈣結合量的影響Fig.5 Effect of reaction temperature on calcium-binding capacity

從圖5可看出，溫度對鈣結合量的影響也較明顯，在反應溫度為40℃時，鈣結合量達到最大值，而高于40℃后鈣結合量明顯降低。由此可見，較高溫度對大豆肽與鈣結合是不利的。高溫可能會使水分不斷蒸發，部分氨基酸析出，螯合物分解或發生其它的反應；合適的溫度有利于螯合向正方向發展，高于或低于這個溫度都不利于螯合物生成[24]。因此，選擇40℃為最佳反應溫度進行后續試驗。

2.1.6螯合工藝優化試驗

根據單因素所得結果，以肽鈣比、pH值、反應時間、反應溫度為響應變量，以鈣結合量Y為響應值，采用響應面法中的中心組合設計進行大豆鈣肽螯合最佳配比優化，響應面因素編碼見表1。

表1 響應面因素編碼Tab.1 Factors and codes of response surface design

試驗設計與結果見表2，表2中X1、X2、X3、X4分別表示肽鈣比、pH值、反應時間、反應溫度的編碼值。采用Design-Expert軟件對試驗數據進行回歸擬合分析，得到4個因素與響應值的模型回歸方程為

對建立模型進行方差分析和顯著性檢驗，分析結果分別見表3、4；響應面圖見圖6～11。

表2 響應面試驗結果Tab.2 Experimental results of response surface

表3 方差分析Tab.3 Variance analysis of regression equation

由圖6～11可以看出，鈣結合量隨著肽鈣比、pH值、反應時間、反應溫度的增加均呈現出先升高后降低的趨勢，但增加和降低都較緩慢。從等高線形狀可以看出，各因素之間的交互作用均不顯著。

表4 回歸方程系數顯著性檢驗Tab.4 Significance test for each coefficient in established regression model

注： ** 代表差異極顯著(P<0.01)；*代表差異顯著(P<0.05)。

圖6 肽鈣比和pH值對鈣結合量影響的響應面圖Fig.6 Response surface plot for effect of peptide calcium ratio and pH value to calcium chloride on chelate ratio

圖7 肽鈣比和反應時間對鈣結合量影響的響應面圖Fig.7 Response surface plot for effect of peptide calcium ratio and reaction time to calcium chloride on chelate ratio

圖8 肽鈣比和反應溫度對鈣結合量影響的響應面圖Fig.8 Response surface plot for effect of peptide calcium ratio and reaction temperature to calcium chloride on chelate ratio

圖9 pH值和反應時間對鈣結合量影響的響應面圖Fig.9 Response surface plot for effect of pH value and reaction time to calcium chloride on chelate ratio

圖10 pH值和反應溫度對鈣結合量影響的響應面圖Fig.10 Response surface plot for effet of pH value and reaction temperature to calcium chloride on chelate ratio

圖11 反應時間和反應溫度對鈣結合量影響的響應面圖Fig.11 Response surface plot for effect of reaction time and reaction temperature to calcium chloride on chelate ratio

利用Design-Expert軟件計算得到大豆鈣肽螯合的最佳工藝參數為：肽鈣比1.62、pH值6.65、反應時間43.64 min、反應溫度38.43℃，鈣結合量的預測值為78.86 mg/g。從實際操作考慮其可行性，最佳工藝參數修改為：肽鈣比1.6、pH值6.6、反應時間44 min、反應溫度38℃。在此條件下進行驗證試驗，重復3次，最終得到鈣結合量平均值為78.73 mg/g，與理論預測值相差0.13 mg/g，說明利用此優化方法得到的大豆肽-鈣的制備工藝是可靠的。

2.2 大豆肽-鈣的溶解性

采用雙縮脲法測定大豆肽-鈣溶解性，得到標準曲線如圖12所示。雙縮脲法是基于銅離子與蛋白質之間的反應，溶解于堿性溶液中的硫酸銅加入蛋白質溶液中，二價的銅被還原成一價銅并在堿性環境中與蛋白質分子肽鍵中的氮形成絡合物，該絡合物呈紫紅色，可在540 nm處進行檢測，吸光度與蛋白質質量濃度成正比。

圖12 溶解性標準曲線Fig.12 Standard curve of solubility

標準曲線線性良好，可用于溶解性計算。經過3次重復實驗，得到大豆鈣肽溶解度最終平均值為98.59%。

2.3 大豆肽-鈣分子量分布

圖13所示為大豆肽-鈣螯合物的分子量分布情況，試驗結果得出：分子量大于5 000 Da的大豆肽-鈣螯合物占總體的1.76%；3 000～5 000 Da的占總體的2.79%；2 000～3 000 Da的占總體的3.51%；1 000～2 000 Da的占總體的11.70%；500～1 000 Da的占總體的25.87%；180～500 Da的占總體的47.91%；小于180 Da的占總體的6.64%。由此可知分子量小于5 000 Da的占絕大多數，是總體的98.24%，其中180～500 Da占比最大。優質大豆肽的分子量應小于1 000 Da，本試驗所得分子量小于1 000 Da的大豆肽-鈣螯合物占總體的80.24%。曾有研究發現，分子量大于1 000 Da的肽段與小于1 000 Da的肽段相比，更易參與大豆肽-鈣螯合物的形成，這與本研究得到的結果有所不同，這可能是由于酶種類、效果及改性方式的差異所引起的[18]。此外，文獻[25]采用超濾發現分子量低于1 000 Da的蝦蛋白肽具有較高的鈣結合量，這說明金屬離子與不同相對分子量肽的結合與肽的來源也密切相關。

圖13 分子量分布圖Fig.13 Molecular weight distribution map

3 結論

(1)通過試驗確定了肽鈣比、反應時間、反應溫度和pH值對鈣結合量的影響，通過單因素試驗和響應面試驗設計，確定最佳螯合工藝為：鈣肽比1.6，pH值6.6，反應溫度38℃，反應時間為44 min，通過此工藝制備所得大豆肽-鈣螯合物中鈣結合量為78.73 mg/g。

(2)大豆肽-鈣螯合物的溶解度為98.59%。大豆鈣肽螯合物的分子量大于5 000 Da的占總體的1.76%，小于5 000 Da的占98.24%，小于1 000 Da的占80.24%，其中分子量180～500 Da占比最大。