UPLC-DAD法同時測定不同干燥工藝三白草中5種黃酮成分的含量

孫冬梅，段福先，江潔怡,廖小芳，香志豪，李素梅

(1.廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院(廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點研究室)，廣東 廣州 510095; 2.廣州中醫(yī)藥大學第五臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 520405)

三白草Saururuschinensis(Lour.) Baill.是傳統(tǒng)中藥，最早記錄于《本草經(jīng)集注》，分布于河北、河南、山東和長江流域及其以南各地，生于低濕溝邊、塘邊或溪旁[1]。研究報道，三白草藥材含有揮發(fā)油、黃酮、木脂素、生物堿、鞣質等成分[2]，并具有廣泛的藥理作用。三白草中黃酮類化合物具有很好的抗氧化作用[3]，其中的蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷和槲皮素具有多種生物活性[4]。通過對三白草的地上部分進行活性檢測，發(fā)現(xiàn)其中3個黃酮醇化合物具清除自由基的活性[5]；蘆丁具有清除自由基、促進成骨細胞的生長、降低血糖、抑制結腸癌和前列腺癌等作用[6]；金絲桃苷具有明顯的抗感染作用[6]；槲皮素和槲皮苷具有抑制葡萄糖和半乳糖還原成相應的多元醇的作用，在阻止由糖尿病引起的白內障、神經(jīng)病和血管類疾病的發(fā)生發(fā)揮重要作用[7]。

越來越多的研究報道，干燥加工過程不僅是促使藥用部位所含水分減失至有利于運輸、貯藏，更為重要的是干燥過程，也是中藥材及中藥飲片藥性形成的重要環(huán)節(jié)[8-10]。本文研究了烘箱30 ℃干燥、烘箱60 ℃干燥、真空冷凍干燥3種干燥工藝對三白草中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素等5種成分質量分數(shù)的影響，為改進三白草的初加工及三白草的開發(fā)利用提供理論基礎。

1 儀器與材料

Agilent 1290超高效液相色譜儀，包括四元泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器(美國)；KQ-700DE數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；TLE204電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；HH-6恒溫水浴鍋(北京精科華瑞有限公司)；CIENTZ-30F冷凍干燥機(寧波新芝生物科技有限公司)；DHG-9203A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；ALB-200高速多功能粉碎機(上海塞耐機械有限公司)；Milli Pore Advantage A10自動純水機(美國)。

金絲桃苷對照品(批號：111521-201205，質量分數(shù)：93.3%)、蘆丁對照品(批號：100080-201409，質量分數(shù)：92.6%)、槲皮苷對照品(批號：111538-200504，質量分數(shù)：98.0%)、槲皮素對照品(批號：0081-9034，質量分數(shù)：98.8%)購自中國食品藥品檢定研究院；異槲皮苷對照品(批號：482-35-9，質量分數(shù)：98.6%)購自成都埃法生物科技有限公司；甲醇(色譜純，賽默飛世爾科技中國有限公司)；水為屈臣氏蒸餾水；其余試劑均為分析純。

3批三白草藥材(編號：S1，產(chǎn)地：廣東梅州；編號：S2，產(chǎn)地：廣西玉林；編號：S3，產(chǎn)地：廣東江門)，經(jīng)廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院劉法錦教授鑒定為三白草科植物三白草Saururuschinensis(Lour.) Baill.。分別將同一批新鮮三白草藥材取地上部分，洗凈，晾干，剪碎，平均分成3份，分別用冷凍干燥機真空冷凍干燥、烘箱30 ℃干燥和烘箱60 ℃烘干方法進行干燥，至含水量≤13%。再由粉碎機進行粉碎，過四號篩，備用。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters CORTECS UPLC C18(2.1 mm×150 mm，1.6 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脫(0～5 min，10%～13%A；5～12 min，13%～16%A；18～28 min，16%～30%A；28～30 min，30%～100%A)；柱溫：25 ℃；流速：0.2 mL/min；檢測波長：254 nm；進樣量：2 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別取蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素適量，精密稱定，用甲醇制成每1 mL分別含蘆丁70.58 μg、金絲桃苷60.87 μg、異槲皮苷76.14 μg、槲皮苷75.43 μg、槲皮素19.96 μg的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取三白草樣品粉末(過4號篩)約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%(體積分數(shù)，下同)甲醇50 mL，稱定質量，加熱回流30 min，放冷，用80%甲醇補足減失的質量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 空白樣品溶液的制備 取80%甲醇1 mL，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗與專屬性試驗

分別取混合對照品溶液、供試品溶液、空白樣品溶液各2 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，見圖1?？梢?，空白對照色譜圖中在與對照品色譜圖相應的位置上無對應色譜峰出現(xiàn)，表明方法專屬性良好。

100806040200100806040200100806040200mAUmAUmAU1234512345051015202530t/minABC

1.蘆?。?2.金絲桃苷； 3.異槲皮苷； 4.槲皮苷； 5.槲皮素；A.三白草黃酮混合對照品； B.三白草樣品； C.空白樣品。

圖1超高效液相色譜圖
Figure1UPLC chromatograms

2.4 線性關系的考察

精密量取混合對照品溶液0.1、1、2、4、8、10 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得不同質量濃度的系列混合對照品溶液。按“2.1”項下色譜條件分別進樣測定，以進樣量為橫坐標、各峰面積值為縱坐標進行線性回歸，5種成分的回歸方程和相關系數(shù)結果見表1?？梢姡?種成分在其相應線性范圍內均有良好相關性。

2.5 精密度試驗

精密吸取同一供試品溶液(編號S1，60 ℃烘箱干燥)2 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件重復進樣6次，記錄峰面積。結果蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素的峰面積RSD值分別為0.48%、0.31%、0.30%、0.31%、0.55%(n=6)，均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液(編號S1，60 ℃烘箱干燥)，分別在0、2、4、8、12、24 h各進樣1次，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積。結果蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素峰面積的RSD值分別為0.52%、0.94%、0.58%、1.45%、1.36%，均小于2%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗

取同一批樣品(編號S1，60 ℃烘箱干燥)，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2. 1”項下色譜條件下分別進樣，測定峰面積并計算質量分數(shù)。結果蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素質量分數(shù)的RSD值分別為1.65%、1.54%、0.78%、1.61%、1.19%，均小于2%，表明方法重復性較好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知質量分數(shù)同一批次的三白草樣品(編號S1，60 ℃烘箱干燥)6份，研細，每份0.5 g，精密稱定，加入一定量的對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件分別進樣測定，計算加樣回收率，結果見表2。

表1 5種黃酮成分線性關系的考察結果Table 1 Results of the linear relationship of the five components

2.9 三白草中黃酮類成分的測定

取不同干燥方法制備的三白草樣品(四號篩)，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，“2.1”項下色譜條件進樣測定，并按外標法計算質量分數(shù)，結果見表3。可見，不同干燥條件下，3批三白草藥材5種黃酮類成分的質量分數(shù)有一定的差異，從大到小的順序為：烘箱30 ℃干燥>真空冷凍干燥>烘箱60 ℃干燥，烘箱30 ℃干燥對黃酮成分的保留效率最高。

表2 加樣回收率試驗結果Table 2 The results of the recovery test

表3 不同干燥方式下三白草黃酮類成分的質量分數(shù)Table 3 The contents of flavonoid in Saururus chinensis (Lour.) Baill. by different drying methods (n=2) w/(mg·g-1)

3 討論

3.1 提取條件的優(yōu)化

分別考察了不同的提取溶劑(甲醇、80%甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇)、提取方法(回流、超聲)、提取時間(15、30、45 min)對三白草中5種成分提取效果的影響，結果顯示回流 30 min時，80%甲醇回流提取效果最佳。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

通過DAD檢測器對供試品色譜在200～400 nm 波長范圍內進行光譜掃描，綜合考慮5種成分，最終選擇 254 nm 作為該方法的檢測波長。

比較乙腈-水溶液、乙腈-0.1%冰醋酸溶液、乙腈-0.1%H3PO4、乙腈-0.1%甲酸溶液等不同洗脫系統(tǒng)對分離效果的影響，結果表明以乙腈-0.1%甲酸溶液為流動相時，色譜中各待測成分均能達到很好的分離效果，故選擇乙腈-0.1%甲酸溶液作為洗脫流動相。

分別比較了柱溫為 20、25、30 ℃，流速分別為0.1 mL/min和0.2 mL/min對色譜分離效果的影響，結果表明柱溫為 20 ℃、流速為0.2 mL/min時，分離效果比較好。

共考察了3種不同品牌的色譜柱：Waters CORTECS UPLC C18(2.1 mm×150 mm，1.6 μm)、Advance Bio Petide plus(2.1 mm×150 mm，2.7 μm)、ACQUITY UPLC BRH C18(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)的分離效果，結果顯示只有Waters CORTECS UPLC C18柱能將金絲桃苷和異槲皮苷的色譜峰分開，因此，選擇該色譜柱。

3.3 不同干燥方式的干燥時間比較

烘箱30 ℃干燥對新鮮三白草藥材的烘干時間最長，但加工工藝簡單，成本較低；真空冷凍干燥耗時長，且對設備要求高、耗能大，不適合批量處理；60 ℃烘箱干燥效率高，溫度可控，處理量大，適用于大多數(shù)中藥材的干燥加工。但本文研究結果顯示，60 ℃烘箱干燥對三白草黃酮類成分的保留率較低，不建議采用60 ℃烘箱干燥法對三白草進行干燥。

3.4 不同干燥方法對三白草黃酮類成分質量分數(shù)的影響

不同干燥條件下，三白草中黃酮成分質量分數(shù)從大到小的排列順序是烘箱30 ℃干燥>真空冷凍干燥>烘箱60 ℃干燥，在烘箱30 ℃干燥條件下，三白草藥材中黃酮成分保留較好。

本研究建立的UPLC法同時測定三白草中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素質量分數(shù)方法快速、簡便、準確、可靠，可用于控制三白草的質量。不同干燥工藝的黃酮成分保留以烘箱30 ℃干燥為最佳，為三白草的初加工及開發(fā)利用提供參考。