基于近紅外光譜法對防風中色原酮含量快速測定的研究

盧泳，孫冬梅，王洛臨，李智勇，李樹民，李潔環，馮健英，陳雪婷，徐文杰

(1.廣州中醫藥大學第五臨床醫學院，廣東 廣州 510095； 2.廣東省中醫藥工程技術研究院/廣東省中醫藥研究開發重點實驗室，廣東 廣州 510095)

防風為傘形科植物防風Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk的干燥根[1]，具有祛風解表、勝濕止痛、止痙的功效[2]。防風的成分主要包括色原酮類、香豆素類、有機酸、多糖類、聚炔類、甾醇類等[3]，其中色原酮作為防風的主要活性成分之一，具有解熱、鎮痛、抗感染的作用[4]。2015年版《中國藥典》一部[防風]項下收載了防風中2種色原酮的質量分數測定方法，該方法樣品處理和測定均耗時較長，因此建立一種快速、準確、簡便的防風色原酮質量分數測定分析方法具有重要意義。近年來，近紅外光譜(near infrared spectrum,NIRS)分析技術由于具有樣品一般無需預處理、測量快速無損、操作簡便、綠色環保等優點，廣泛用于制藥、食品、石油、農業等領域。本研究以防風藥材為研究對象，用聲光可調濾光器(AOTF)便攜式近紅外儀采集其近紅外光譜，建立其2種色原酮(升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷)的定量分析模型，為防風藥材中色原酮質量分數的快速檢驗提供一種新方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HH-8恒溫水浴鍋(邦西儀器科技上海有限公司)；METTLER TOLEDO XS205 DualRange型電子分析天平(德國梅特勒-托利多有限公司)；YR-150多功能粉碎機(永康市五瑞工貿有限公司)；Agilent Technologies 1200 series型高效液相色譜儀(G1322A脫氣機，G1312A二元梯度泵，G1329A自動進樣器，G1316A柱溫箱，G1314B VWD檢測器)；AOTF Luminary 3060型聲光可調濾光器近紅外光譜儀，配有積分球漫反射附件、銦鎵砷(InGaAs)檢測器、CaF2分束器、樣品旋轉器、石英樣品杯(美國Brimrose公司)。

1.2 試藥

93批防風藥材分別購自外蒙古、內蒙古、遼寧、吉林、黑龍江、甘肅、山西、河南、河北、湖南、湖北等產地，經廣東省中醫藥工程技術研究院李智勇博士鑒定均為傘形科植物防風Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk的干燥根。

升麻素苷對照品(批號：111522-201511)、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品(批號：111523-201509)均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇(賽默飛世爾中國有限公司，色譜純)、水(廣州屈臣氏食品飲料公司)、甲醇(廣州化學試劑廠，分析純)。

2 方法與結果

2.1 HPLC法測定防風中2種色原酮的質量分數[5]

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5μm)；檢測波長：254 nm；流動相：甲醇-水(40∶60)，流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；理論塔板數按升麻素苷峰計算應不低于2 000。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取升麻素苷對照品和5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品適量，加入甲醇，制成每1 mL含升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷分別為127.2、128.0 μg的混合對照品溶液，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 取防風藥材細粉約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，稱定質量，水浴回流2 h，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，取續濾液，即得。

2.1.4 樣品測定 精密稱取樣品0.25 g，按照“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液2 μL，注入色譜儀，按“2.1.1”項下條件測定升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的質量分數。93份樣品中升麻素苷的質量分數范圍為0.066 4%～0.656 0%；5-O-甲基維斯阿米醇苷質量分數范圍為0.117 5%～0.749 7%。

2.2 近紅外光譜定量模型的優化和建立

2.2.1 近紅外光譜的采集 將收集到的93批防風樣品粉碎后過80目篩，取約8 g藥粉放入石英樣品杯中，平鋪均勻，以空氣為參比，采用積分漫反射部件進行掃描，儀器參數：波長范圍1 100～2 300 nm；光程2 nm；掃面次數100次；溫度25 ℃；相對濕度40%。每批樣品重復裝填并掃面3次，求平均圖譜。93批樣品近紅外圖譜疊加圖見圖1。

0.80.70.60.50.40.31100130015001700190021002300λ/nmAbsorbance

圖193批防風藥材近紅外光譜疊加圖

Figure1NIR spectrum overlay of 93 batches Radix Sanoshnikovia

由圖1可知，1 100～2 300 nm波段區間內光譜比較平滑，不同樣品間的近紅外光譜吸收無明顯差異，但1 300～2 200 nm區間近紅外光譜信息量較豐富，能反映出樣品中的色原酮質量分數差異，因此在此區間內進行建模研究。

2.2.2 近紅外光譜定量模型的建立

2.2.2.1 模型評價指標的確定

本研究采用校正相關系數(Rc)、預測相關系數(Rp)、校正標準偏差(RMSEC)、預測標準偏差(RMSEP)作為指標篩選，其中Rc和Rp越接近1，表示預測值與測定值越接近[6]。RMSEC和RMSEP越小，兩者差異越小，說明模型的預測效果越好，適用性就越好。

2.2.2.2 樣本集的劃分

根據樣品中升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷質量分數測定結果，利用隨機(random selection，RS)法[7]選取83個具有代表性的樣品組成校正集，其余10個樣品為驗證集，二者比例為8∶1，各樣品的質量分數范圍見表1。驗證集樣品的質量分數范圍在校正集樣品質量分數范圍內，可用于近紅外光譜定量模型的建立。

2.2.2.3 建模方法的選擇

在近紅外光譜分析中常用的多元定量校正方法，是建立分析儀器響應值與物質質量濃度之間定量數學關系的一類算法。在近紅外光譜儀分析中常用的定量建模方法包括多元線性回歸(MLR)法、主成分回歸(PCR)法和偏最小二乘(PLS)法等線性校正方法。其中，PLS在近紅外光譜分析中得到較為廣泛的運用，成為了一種常用的建模方法。因此，本研究選擇PLS建模，以期得到較為穩定、預測能力較好的升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的定量模型。

2.2.2.4 不同光譜預處理方法的選擇

藥材樣品由于顆粒大小和光散射等噪聲信息及測定條件等差異，導致基線漂移影響近紅外光譜定量模型的可靠性和準確性，需對原始光譜進行適當的預處理，以減少各種干擾的影響，提高分析準確度。用化學計量學軟件對原始光譜進行預處理，其常見的光譜預處理方法有多元散射校正(MSC)、標準正態變量變換(SNV)、求導(一階導數1st Derivative、二階導數2nd Derivative)、平滑處理(S-G卷曲平滑、Norris平滑)[8-10]等。以模型評價指標Rc、Rp、RMSEC、RMSEP，通過對預處理方法的對比優選出S-G卷曲平滑作為升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷定量模型光譜預處理方法。結果見表2。

2.2.2.5 不同光譜區段的選擇

由于全波段光譜中除包含待測組分信息，還包含大量冗余信息，為獲取與待測組分質量分數相關的最大信息、減少冗余信息，以建立最優的預測模型[11]，對不同光譜范圍所建模型性能進行考察，結果見表3。通過與其他波段的對比，確定1 300～1 900 nm為升麻素苷定量模型最佳建模區間、優選出1 300～2 200 nm為5-O-甲基維斯阿米醇苷定量模型最佳建模區間。

2.2.2.6 主成分的選擇

主成分對模型的建立具有很大的影響，過少或過多均會影響模型的準確性[12]。本研究以RMSEC為指標，RMSEC越小，預測準確度越高。以影響模型的主成分值為橫坐標，RMSEC為縱坐標作圖，得圖2。結果表明升麻素苷定量模型的最佳主成分值為16，此時RMSEC為0.028；5-O-甲基維斯阿米醇苷定量模型的最佳主成分值為19，此時RMSEC為0.011 9。

2.2.2.7 定量模型的建立

分別將83批升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷校正集樣品，通過The Unscramler7.8化學計量學軟件結合PLS法，按表4所示升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的最優建模參數，建立定量分析模型。結果見圖3。

表1 升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷定量模型校正集和驗證集的劃分Table 1 Partition of calibration and validation set in prim-O-glucosylcimifugin and 5-O-methyl-vismitol

表2 不同光譜預處理方法對NIR模型的影響Table 2 Influence of different pretreatment on NIR model

表3 不同波長范圍對NIR模型的影響Table 3 Influence of different wavelength range on NIR models

由圖3可知升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷Rc分別為0.975 8、0.992 3，Rp分別為0.904 0、0.907 3；RMSEC分別為0.028、0.011 9；RMSEP為0.055 6、0.041 3。說明模型可以用于色原酮成分的定量分析，且預測誤差較小，NIRS預測值與HPLC實測值差異無統計學意義，模型準確度和預測結果良好。可以采用近紅外光譜法對升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的質量分數進行快速無損的測定。

2.2.2.8 定量模型的驗證

分別在建立的定量分析模型中，將升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷驗證集樣品質量分數的測定值與預測值進行比較并計算平均相對誤差，詳見表5。結果表明，NIRS所建模型的對升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷質量分數的預測結果與HPLC法的測定結果接近，平均相對誤差均小于10%，表明所建模型具有良好的預測能力，可用于防風藥材中2種色原酮質量分數的測定。

3 討論

本研究采用NIRS法建立了防風藥材中升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷2種色原酮成分的快速檢測方法，建立的定量模型預測精度較高，預測集的平均相對誤差均<10%。相較傳統的HPLC方法，不需要繁瑣的供試品制備，不消耗化學試劑，不產生任何污染[13]。

近紅外光譜技術作為一種分析速度快、效率高的在線分析技術，一般檢測限為0.1%，不適用于痕量分析[14]。雖然在本研究中部分樣本集升麻素苷的質量分數低于0.1%，但運用這些樣本所建立的定量模型相關系數仍都大于0.9，模型預測準確度、精密度較好。說明近紅外光譜技術對于某些質量分數低于0.1%的化學成分同樣適用。

0.120.110.100.090.080.070.060.05RMSEC135791113151719主成分值135791113151719主成分值0.100.090.080.070.060.050.04BA

A.升麻素苷； B. 5-O-甲基維斯阿米醇苷。

AB0.10.20.30.40.50.60.70.80.10.20.30.40.50.60.70.80.70.60.50.40.30.20.100.80.70.60.50.40.30.20.10實測值/%預測值/%實測值/%

A.升麻素苷； B.5-O-甲基維斯阿米醇苷。

圖3防風中2種色原酮成分的定量校正模型
Figure3Quantitative calibration models of two chromones in Radix Saposhnikoviae

表5 驗證集樣品中2種色原酮成分質量分數的HPLC與NIRS測定結果

Table5HPLC measured and NIRS predicted mass fraction results of two chromones in validation setw/%

編號升麻素苷HPLC法NIRS法平均相對誤差編號5-O-甲基維斯阿米醇苷HPLC法NIRS法平均相對誤差FF040.331 20.355 06.138 2FF140.213 30.185 18.509 3FF100.334 30.356 0FF190.201 10.203 0FF140.246 80.217 7FF230.155 50.171 6FF210.118 40.134 2FF400.208 50.215 8FF280.270 90.216 0FF620.313 20.337 2FF370.248 50.296 0FF670.367 20.331 7FF410.270 50.211 0FF740.354 90.350 4FF820.259 50.207 0FF790.237 70.293 0FF880.324 60.325 0FF840.296 2 0.331 9FF910.136 10.147 0FF870.371 80.360 3

本研究共收集不同質量分數的防風藥材共93批，得到的定量校正模型預測相關系數均在0.9以上；但未高于0.95，預測結果還存在一定的誤差。這可能是因為防風產地分布廣、含量豐富，所采用的樣本集不具有較好的代表性導致的。此外，還可能是因為本研究中色原酮成分在長波近紅外光譜范圍的基線漂移、噪音影響較大，結構信息不夠豐富而導致模型預測有一定的誤差。在后期實驗中應擴大樣本范圍，采用近紅外光譜全波長進行建模，結合更多更優的化學計量學方法提高2種色原酮模型的預測能力。