桂枝芍藥知母湯緩解類風濕關節炎的網絡調控機制研究

謝健，譚麗雯，江福能，鐘惟德，梁宇翔

(廣州市第一人民醫院，廣東 廣州 510180)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性系統性自身免疫性疾病[1]。RA病程中綜合體現了滑膜增生、炎癥、自身免疫、內分泌紊亂等多種病理生理過程，它們相互關聯、相互作用，形成一個錯綜復雜的網絡。

桂枝芍藥知母湯(GuiZhi Shaoyao Zhimu Decoction，GSZD)出自《金匱要略·中風歷節病脈證并治第五》，由9味中藥組成，包括桂枝、白芍、甘草、麻黃、生姜、白術、知母、防風、附子，具有祛風除濕、溫經散寒、滋陰清熱之功效，主要用于治療風寒濕痹日久、漸次化熱傷陰之證[2]。GSZD具有寒溫并用、溫散而不傷陰、養陰而不礙陽的特點，是古今醫家治療風濕歷節的常用方[3]。

已有臨床研究表明GSZD具有減輕炎癥活動、抑制免疫、改善微循環作用，產生減輕關節腫脹、疼痛的功效，對RA患者的整體調節具有重要作用[4]。然而，其對人體免疫功能、致炎因子等方面的作用機制尚不明確。因此，本研究擬采用網絡藥理學方法，預測該方緩解RA的作用靶標，并通過網絡拓撲特征計算，闡釋該方的配伍規律，揭示其對RA疾病網絡的干預機制。

1 材料

1.1 GSZD化學成分數據集的建立

基于中醫藥百科全書數據庫(The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine，ETCM，http://www.nrc.ac.cn:9090/ETCM/，version 1.0)[5]，收集GSZD所含中藥的化學成分信息，建立GSZD的化學成分數據集。

1.2 GSZD候選靶標譜的預測

在ETCM的Target子庫中，檢索GSZD所含化學成分的候選靶標譜。ETCM采用MACCS(Molecular ACCess System)分子指紋，使用開源軟件OpenBabel來進行化學指紋特征的提取，并采用Tanimoto系數定義的相似度計量方法，通過與FDA上市藥物進行相似性打分(Score≥0.8)，并提取作用靶標[5]。

1.3 已知RA治療靶標譜的收集

基于DrugBank數據庫(https://www.drugbank.ca/，version 5.1.2，released 2018-12-20)[6]，利用關鍵詞“rheumatoid arthritis”，收集已知用于RA治療的藥物信息，并匯總其靶標基因信息。

2 方法

2.1 “GSZD候選靶標-已知RA治療靶標”相互作用網絡構建與分析

基于String數據庫(https://string-db.org/，Version：10.5)[7]，收集GSZD候選靶標和已知RA治療靶標的相互作用信息，并采用Cytoscape軟件進行網絡可視化和計算網絡特征值，包括節點連接度(degree)、節點緊密度(closeness)和節點介度(betweenness)。以“節點連接度(degree)”的2倍中位數為卡值，選取“GSZD候選靶標-已知RA治療靶標”相互作用網絡的核心節點(hubs)；在此基礎上，建立核心節點的直接相互作用網絡，并計算節點連接度(degree)、節點緊密度(closeness)和節點介度(betweenness)等3個拓撲結構特征值，選擇3個拓撲特征值均大于相應中位數的節點作為GSZD緩解RA的關鍵網絡靶標。

2.2 基因功能和通路富集分析

基于本體數據庫(Gene Ontology，GO)和KEGG 通路數據庫[8]，采用The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery(DAVID，https://david.ncifcrf.gov/，v6.8)的分析平臺[9]，針對GSZD緩解RA的關鍵網絡靶標參與的生物學功能和通路，開展富集分析。

3 結果

3.1 GSZD所含的化學成分及其候選靶標譜

通過ETCM數據庫，共收集GSZD所含9味中藥的509個化學成分，其中，白芍57個，白術33個，防風33個，附子40個，甘草134個，桂枝13個，麻黃29個，生姜128個，知母42個。基于上述化學成分的結構信息，共預測獲得GSZD的候選作用靶標718個。如圖1所示，GSZD的候選靶標主要參與血管新生通路(如VEGF signaling pathway、Cardiac muscle contraction、Vascular smooth muscle contraction)、免疫炎癥調節通路(如Steroid hormone biosynthesis、Steroid biosynthesis、Fc epsilon RI signaling pathway、B cell receptor signaling pathway、T cell receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway)、破骨細胞分化通路(如，Osteoclast differentiation)以及能量和藥物代謝相關通路(如Caffeine metabolism、Retinol metabolism、Linoleic acid metabolism、Nitrogen metabolism、Bile secretion、Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450、Drug metabolism、Ascorbate and aldarate metabolism、Carbohydrate digestion and absorption、Drug metabolism、Arachidonic acid metabolism、Pentose and glucuronate interconversions、alpha-Linolenic acid metabolism)。

圖1GSZD候選靶標顯著富集的GO功能和KEGG通路統計圖

Figure1GO function and KEGG pathway statistical map with significant enrichment of GSZD candidate targets

3.2 GSZD緩解RA的關鍵網絡靶標

基于GSZD候選靶標與已知RA治療靶標之間的相互作用信息，建立“GSZD候選靶標-已知RA治療靶標”互作網絡，包含519個節點和3 131條邊。以2倍節點連接度中位數作為卡值，篩選得到113個hub節點。進而構建hub節點的直接相互作用網絡，包含113個hub節點和1 248條邊。通過hub節點的節點連接度(degree)、節點緊密度(closeness)和節點介度(betweenness)中位數卡值篩選，獲得45個關鍵網絡靶標，其網絡拓撲特征值見表1。

表1 GSZD緩解RA關鍵網絡靶標拓撲特征值列表

Table1Topological eigenvalue list of key network targets for GSZD mitigation of RA

基因名稱連接度緊密度介度AKT1290.520 930 230.020 207 91ALB330.574 358 970.051 202 05CALM1230.504 504 50.023 469 87CALM2220.502 242 150.015 113 54HSP90AA1200.464 730 290.015 203 12INS340.586 387 430.051 813 5NR3C1200.523 364 490.014 653 9APP280.506 787 330.057 757 1GPER230.476 595 740.024 909 96POMC300.516 129 030.081 662 44AKR1C3260.478 632 480.005 681 16CYP1A1460.533 333 330.027 581 99CYP2E1380.541 062 80.022 683 52CYP3A4470.562 814 070.036 820 6HSD3B1260.506 787 330.020 376 79HSD3B2250.50.019 607 53UGT1A1390.486 956 520.008 647 97UGT1A10350.476 595 740.004 413 22UGT1A4350.476 595 740.004 413 22UGT1A6400.541 062 80.033 945 27UGT1A8350.476 595 740.004 413 22UGT1A9390.497 777 780.016 309 5AR200.50.013 875 13CYP19A1230.528 301 890.027 308 5CYP1A2410.511 415 530.012 177 32CYP3A5360.489 082 970.005 404 65HPGDS320.583 333 330.064 149 11ESR1220.554 455 450.016 219 17IL1B250.489 082 970.012 959 18IL2210.470 588 240.006 145 72PIK3CA250.489 082 970.009 277 02CYP2C9380.523 364 490.013 608 02CYP2B6410.557 213 930.037 558 97CYP2C8360.518 518 520.012 570 75CYP4A11360.518 518 520.018 361 68FOS300.568 527 920.042 487 61JUN320.580 310 880.040 962 01

表1 (續)

根據生物學功能和通路富集結果顯示(圖2和表2)，GSZD緩解RA的關鍵網絡靶標主要參與代謝類通路(如Drug metabolism-cytochrome P450，Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450，Retinol metabolism，Arachidonic acid metabolism，Drug metabolism-other enzymes，Ascorbate and aldarate metabolism，Metabolic pathways，Linoleic acid metabolism，Pentose and glucuronate interconversions，Porphyrin and chlorophyll metabolism)、免疫-炎癥調節通路(如Steroid hormone biosynthesis，TNF signaling pathway，T cell receptor signaling pathway，Toll-like receptor signaling pathway，Inflammatory mediator regulation of TRP channels，Fc epsilon RI signaling pathway，B cell receptor signaling pathway)、骨破壞相關通路(如Osteoclast differentiation)和血管新生相關通路(如VEGF signaling pathway)。

注：紅色標注節點為GSZD緩解RA關鍵網絡靶標。

圖2GSZD緩解RA關鍵網絡靶標互作網絡及其主要參與通路圖

Figure2Interaction network and main participation path diagram of key network targets for GSZD mitigation of RA

表2 GSZD緩解RA關鍵網絡靶標的功能和通路富集列表Table 2 Functional and pathway enrichment list of GSZD mitigating RA key network targets

表2 (續)

4 討論

網絡藥理學對“疾病-表型-基因-藥物”的多層次信息進行融合，從系統和網絡的角度理解疾病表型與生命大分子的關系，在其對“疾病表型-生物分子”網絡構建的思路指導下進行中醫藥證候生物學基礎的研究已經取得一定的進展[10]。從中醫藥“整體觀念”切入，采用“網絡藥理學”研究策略，按照“中藥化學成分收集—成分靶標預測—靶標互作網絡挖掘”的技術路線，通過分析中藥靶標與疾病相關基因和通路之間的關聯性，揭示中藥的作用機制，有助于適應并體現中藥多成分、多靶點、協同作用的特點，并為方證研究和新藥開發提供全新的選擇與向導[11]。

RA是一種慢性、系統性、自身免疫性疾病，主要病理表現為對稱性、多發性關節炎癥[1]。除關節病變外，RA還可引起多種關節外病變，包括心血管系統、內分泌系統、血液系統、神經系統疾病等，因而又稱為病譜性疾病[12]。在RA進展過程中，往往出現滑膜增生、炎癥、自身免疫、內分泌紊亂等多種病理生理表現，各個病理環節的相關基因之間形成錯綜復雜的相互作用網絡。

作為古今醫家治療風濕歷節的常用方劑，GSZD具有寒溫并用、溫散而不傷陰，養陰而不礙陽的特點[3]。現代臨床研究和藥理學研究表明，GSZD可通過減輕炎癥活動、抑制免疫、改善微循環等作用，發揮其減輕關節腫脹和疼痛及調節機體免疫功能的療效[13]。Guo等[14]研究發現，GSZD具有改善RA病情、減輕RA癥狀的作用，其作用機制可能是通過調控HDAC1-HSP90AA1-NFKB2-IKBKB-TNF信號軸來矯正RA進展相關的“炎癥-免疫失衡網絡”。為進一步探明GSZD治療RA的作用機制，本研究整合藥物靶標預測、網絡分析和功能富集，旨在發現該方抗RA的關鍵網絡靶標，并深入挖掘其機制。通路富集結果表明，GSZD緩解RA的關鍵網絡靶標主要參與4種類型的信號通路：藥物代謝相關、炎癥-免疫相關、破骨細胞分化和血管新生信號通路。

本研究結果表明，GSZD 抗 RA作用可能是通過逆轉炎癥-免疫系統的失衡、調節機體代謝、緩解骨破壞和抑制血管新生而實現。相關研究結果為GSZD抗RA的作用機制探索提供新靶點、新通路，為進一步驗證性研究提供了理論依據。