大鼠血清與心肌MMP-2、MMP-9、TIMP-1的相關(guān)性研究

李博維，周萬興，趙艷群，周玉良，崔晨霞

(廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510080)

MMP-2、-9作為基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族的其中一員，多數(shù)分布于心肌組織中[1]，既往大量研究發(fā)現(xiàn)多種心血管疾病導(dǎo)致的心室重構(gòu)過程與MMP-2、-9及其內(nèi)源性抑制劑——金屬蛋白酶組織抑制因子1(TIMP-1)的水平和比值有較密切的關(guān)系，且通過改變上述蛋白水平或比值可有效改善心室重構(gòu)[2-4]。然而由于心肌組織難以獲取，研究者在臨床試驗(yàn)中多通過測定患者血清相關(guān)蛋白水平進(jìn)行研究。但目前尚無研究證實(shí)血清與心肌組織MMP-2、-9、TIMP-1水平具有相關(guān)性。因此本實(shí)驗(yàn)就這一問題進(jìn)行探討，嘗試為臨床評估心室重構(gòu)的新手段提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

HP5500心臟彩色多普勒超聲儀(飛利浦公司)；渦旋振蕩器(江蘇QL-901)；-20 ℃冰箱(德國Siemens公司)；-80 ℃超低溫冰箱(美國Thermo Forma公司)；低速冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司)；臺式高速冷凍離心機(jī)(德國Heracus公司)；Elx500酶標(biāo)儀(美國Biotek公司)；UVS-99紫外分光光度計(jì)(ACTGENE)；Elx500酶標(biāo)儀(美國Biotek公司)。

1.2 主要藥品及試劑

人重組CD147蛋白(美國R&D公司)；多西環(huán)素粉劑(Sigma公司)；大鼠MMP-2ELISA試劑盒(美國Abnova公司)；大鼠TIMP-1ELISA試劑盒、大鼠CD147 ELISA試劑盒(美國R&D公司)；Anti-MMP-2 抗體(美國Abgent公司)；Anti-TIMP-1抗體(美國R&D公司)；Anti-CD147抗體(英國Abcam公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

10只8周齡SPF級WKY雄性大鼠，30只8周齡SPF級原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)雄性大鼠均購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號：11400700025288。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及取材

實(shí)驗(yàn)取材來源于本研究組的前期實(shí)驗(yàn)[5-6]，將大鼠分組如下：20只8周齡雄SHR隨機(jī)分為2組，每組10只。其中一組接受人重組CD147蛋白(MMPs誘導(dǎo)劑)尾靜脈注射，另一組除接受CD147注射外，加用多西環(huán)素粉劑(DOX、MMPs活性抑制劑)溶于生理鹽水后灌胃，本實(shí)驗(yàn)將上述兩組歸為干預(yù)組。另有10只8周齡SHR與10只8周齡WKY大鼠均接受等劑量生理鹽水尾靜脈注射及灌胃，本實(shí)驗(yàn)將這兩組歸為非干預(yù)組。飼養(yǎng)56 d后(16周齡)統(tǒng)一稱質(zhì)量，用10%(φ)水合氯醛(0.3～0.4 mL/100 g體質(zhì)量)經(jīng)腹腔注射進(jìn)行全身麻醉，胸部備皮后取仰臥位固定并開腹解剖，鈍性分離出下腔靜脈后，用5 mL注射器在腎水平處穿刺血管采血3～5 mL，用于檢驗(yàn)各蛋白水平，采血后迅速打開胸腔切除心臟，并分離左室，用生理鹽水沖洗干凈并用濾紙吸干組織水分，并保存在-80 ℃冰箱備用。

1.5 心肌組織MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白的檢測

將-80 ℃保存的心肌組織用玻璃研磨器置于冰上研磨，并用全細(xì)胞裂解液(含PMSF)進(jìn)行裂解30 min后，12 000 r/min，4 ℃臺式高速冷凍離心機(jī)離心30 min。取上清液用Western blot方法進(jìn)行測定[5]。

1.6 血清MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白的檢測

抽取大鼠血液后自然凝固10～20 min，3 000 r/min低速冷凍離心機(jī)離心10 min，吸取上清液置于-20 ℃冰箱保存，用ELISA方法進(jìn)行測定[7]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較方差齊時(shí)用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；方差不齊時(shí)用非參數(shù)檢驗(yàn)。兩變量相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清與左室心肌組織MMP-2、MMP-9、TIMP-1水平及比值

干預(yù)組及非干預(yù)組大鼠血清、左室心肌組織中MMP-2、MMP-9、TIMP-1水平及MMP-2/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1比值見圖1。兩組之間心肌組織各蛋白水平及變化趨勢可詳見本研究組的前期實(shí)驗(yàn)[5-6]。兩組間心肌組織中MMP-2/TIMP-1比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與非干預(yù)組相比，干預(yù)組心肌組織中MMP-9/TIMP-1比值明顯減少(P<0.05)。而在血清中，兩組間MMP-2、MMP-9水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，干預(yù)組TIMP-1水平較非干預(yù)組有所減少，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。另外，兩組間血清MMP-2/TIMP-1比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但干預(yù)組血清MMP-9/TIMP-1比值較非干預(yù)組增加(P<0.05)。

無論是在干預(yù)組還是在非干預(yù)組中，心肌組織MMP-2/TIMP-1比值均比血清中相關(guān)比值高(P<0.05)。在非干預(yù)組中心肌組織MMP-9/TIMP-1比值較血清中相關(guān)比值高，而在干預(yù)組中恰好相反，血清MMP-9/TIMP-1比值高于心肌組織中相關(guān)比值，兩項(xiàng)結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

血清與心肌各蛋白及相關(guān)比值水平3002001000非干預(yù)組干預(yù)組△#*△△△血清MMP-2(ng/mL)心肌組織MMP-2血清MMP-9(ng/mL)心肌組織MMP-9血清TIMP-9(ng/mL)心肌組織TIMP-1血清MMP-2/TIMP-1(%)心肌組織MMP-2/TIMP-1(%)血清MMP-9/TIMP-1(%)心肌組織MMP-9/TIMP-1(%)

與非干預(yù)組心肌組織比較：*P<0.05；與非干預(yù)組血清比較：#P<0.05；與同組血清比較：△P<0.05。

圖1大鼠血清與左室心肌組織MMP-2、MMP-9、TIMP-1水平及比值

Figure1Levels and ratios of MMP-2,MMP-9 and TIMP-1 in serum and left ventricular myocardial tissue of rats

2.2 兩組大鼠血清與左室心肌組織MMP-2、MMP-9、TIMP-1水平及比值的相關(guān)性

干預(yù)組大鼠血清與左室心肌組織中MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白水平無明顯相關(guān)性(P>0.05)，MMP-2/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1比值也無明顯相關(guān)性(P>0.05)。非干預(yù)組大鼠血清與心肌中MMP-2、MMP-9蛋白水平也無明顯相關(guān)性(P>0.05)，但TIMP-1呈正相關(guān)(P<0.05，r=0.521，圖2)，且MMP-2/TIMP-1呈明顯正相關(guān)(P<0.001，r=0.758，圖3)，但MMP-9/TIMP-1比值無明顯相關(guān)性。

兩組數(shù)據(jù)綜合分析，血清與左室心肌組織中MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白水平均無明顯相關(guān)性(P>0.05)，血清及心肌組織中的MMP-2/TIMP-1比值呈顯著正相關(guān)(P<0.001，r=0.568，圖4)，MMP-9/TIMP-1比值無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

10080604020血清TIMP-1P<0.05,r=0.5210.000.100.200.300.400.500.60心肌組織TIMP-1

圖2非干預(yù)組大鼠血清與心肌組織TIMP-1的相關(guān)性

Figure2Correlation of TIMP-1 between serum and myocardial tissue in the non-intervention group

0.001.002.003.004.005.00心肌組織MMP-2/TIM-12.502.001.501.000.500.00血清MMP-2/TIMP-1P<0.001,r=0.758

圖3非干預(yù)組大鼠血清與心肌組織MMP-2/TIMP-1的相關(guān)性

Figure3Correlation of MMP-2/TIMP-1 between serum and myocardial tissue in the non-intervention group

P<0.001,r=0.5860.01.02.03.04.05.0心肌組織MMP-2/TIMP-12.502.001.501.000.500.00血清MMP-2/TIMP-1

圖4綜合兩組血清與心肌組織MMP-2/TIMP-1的相關(guān)性

Figure4Correlation of MMP-2/TIMP-1 between serum and myocardial tissue in both groups

3 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠血清中MMP-2、MMP-9水平經(jīng)CD147誘導(dǎo)后變化趨勢并不如心肌組織中相關(guān)蛋白明顯[5-6]，且與左室心肌組織MMP-2、MMP-9蛋白水平無明顯相關(guān)性，可能與以下因素有關(guān)：本實(shí)驗(yàn)中干預(yù)組大鼠均接受CD147藥物干預(yù)，部分同時(shí)接受DOX干預(yù)[5-6]。其中DOX是MMPs的廣譜拮抗劑，主要抑制MMPs活性，一般不影響其蛋白水平[8]。但CD147作為MMPs的天然誘導(dǎo)物，對體內(nèi)多種MMPs(如：MMP-2、-8、9、-14、MT1-MMP等)的蛋白水平及基因表達(dá)均有上調(diào)作用[9]。同時(shí)MMP-8、-14、MT1-MMP也會影響MMP-2、-9蛋白水平[1，9]。此外，CD147還對多種炎性因子(如：白介素18、環(huán)孢素A等)起上調(diào)作用，這些炎性因子也可以進(jìn)一步影響MMP-2、-9蛋白水平[9]。上述結(jié)果提示，要想真實(shí)反映血清與左室心肌組織中MMPs的相關(guān)性，首先須排除外界干擾因素。但是，在剔除CD147的干預(yù)因素后，非干預(yù)組大鼠血清與左室心肌組織MMP-2、-9相關(guān)性仍不明顯。這可能由于MMP-2、-9除分布于心肌組織外，還可見于成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、骨骼肌及多種腫瘤細(xì)胞中，既往研究發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞中的MMP-2、-9也有一定影響作用[10]?？梢?，血清中的MMP-2、-9蛋白水平是機(jī)體多部位、多因素綜合反應(yīng)的體現(xiàn)，未必能單獨(dú)反映心肌組織相應(yīng)蛋白的水平。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)大鼠血清與左室心肌組織中MMP-2/TIMP-1比值有良好的相關(guān)性，且當(dāng)剔除CD147以及DOX的干擾因素后，兩者之間MMP-2/TIMP-1比值的相關(guān)性更為明顯。TIMP-1作為MMPs的特異性抑制劑，可以在等分子量下1∶1非共價(jià)結(jié)合MMPs的催化區(qū)域，阻止MMPs與底物結(jié)合而調(diào)節(jié)MMPs活性[10]，在多種疾病狀態(tài)下，不同的病變部位中，MMP-2、TIMP-1之間均可相互影響[11-12]。有研究認(rèn)為心室重構(gòu)的發(fā)生是由于MMPs、TIMPs失衡所致。既往也有臨床研究發(fā)現(xiàn)血清中的MMPs/TIMPs比值與心室重構(gòu)指標(biāo)相關(guān)[13-15]。而MMP-2/TIMP-1比值正是其中一類重要的衡量指標(biāo)，且本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠血清與左室心肌中兩者比值具有良好相關(guān)性，這可能是由于MMP-2、TIMP-1蛋白雖然在全身多組織中分布并相互作用，但兩者的變化趨勢仍與心肌組織中的相似。但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)無論在干預(yù)組還是非干預(yù)組中，血清與左室心肌組織的MMP-9/TIMP-1含量均無明顯相關(guān)性。過去也有一些實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果。如Garcia等[7]發(fā)現(xiàn)不同血壓的患者血清中，MMP-2及MMP-9水平及活性的變化趨勢并不一致：隨著血壓增高，血清MMP-9水平的增幅更大，但心肌組織MMP-9水平是否存在同樣趨勢尚未可知。而血清與心肌MMP-9水平增幅不匹配，可能是本實(shí)驗(yàn)中血清與心肌MMP-9/TIMP-1相關(guān)性不明顯的原因之一。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)大鼠血清與心肌組織中MMP-2/TIMP-1比值有較好的相關(guān)性。由于心肌組織難以在臨床實(shí)驗(yàn)中獲取，本研究結(jié)果提示血清中MMP-2/TIMP-1比值可能可以代替心肌組織中的相關(guān)蛋白，成為評估患者心室重構(gòu)的指標(biāo)。血清蛋白與心肌組織蛋白水平的相關(guān)性還需進(jìn)一步研究。