“三棱-莪術”組分配伍介導PI3K-AKT通路治療大鼠子宮肌瘤的研究

肖紅妮　劉志杰

摘要 目的：研究三棱-莪術對治療子宮肌瘤的療效及可能作用機制。方法：36只雌性SD大鼠隨機分為空白組、模型組、1∶1組、1∶2組，每組9只，其中模型組、1∶1組、1∶2組制備子宮肌瘤模型，空白組、模型組用生理鹽水灌胃，1∶1組、1∶2組根據三棱-莪術配伍比例進行灌胃，干預結束后比較各組子宮/卵巢系數、子宮大小，子宮病理形態以及PI3K/AKT通路標志因子的表達的變化。結果：1）模型組子宮平滑肌出現明顯的病變，三棱-莪術干預后大鼠子宮組織病變有所改善，其中1∶1組改善較1∶2組明顯。2）子宮肌瘤大鼠子宮系數、卵巢系數、子宮橫豎徑、子宮組織中E2和ER、PI3K、p-AKT/AKT表達水平均明顯增加（P<0.05），經三棱-莪術干預后上述指標下降，其中術1∶1組改善較1∶2組明顯（P<0.05）。結論：三棱-莪術配伍可改善子宮肌瘤，這一作用機制可能通過激活PI3K/AKT通路實現。

關鍵詞 三棱-莪術;組分配伍;PI3K-AKT通路;大鼠;子宮肌瘤;子宮系數;卵巢系數;子宮橫豎徑

Study on PI3K-AKT Pathway Mediated by “Rhizoma Sparganii-Rhizoma Sparganii” Components in the Treatment of Rat Uterine Leiomyoma

Xiao Hongni，Liu Zhijie

（Department of Gynecology，People′s Liberation Army Joint Service Support Unit 94th Hospital，Lanzhou 730050，China）

Abstract Objective：To study the therapeutic effect and possible mechanism of Rhizoma Sparganii-Rhizoma Sparganii in the treatment of uterine leiomyoma.Methods：A total of 36 female SD rats were randomly divided into a blank group，a model group，a 1∶1 group and a 1∶2 group，with 9 rats in each group.The model group，1∶1 group and 1∶2 group were used to prepare uterine myoma model.The blank group and the model group were given normal saline by gastric lavage.The 1∶1 group and 1∶2 group were given gastric lavage according to the compatibility ratio of trigonum and zedoary turmeric.After intervention，the changes of uterus/ovary coefficient，uterine size，uterine pathological morphology and the expression of PI3K/AKT pathway marker factors were compared in each group.Results：1）The uterine smooth muscle in the model group showed obvious pathological changes，and the uterine tissue lesions improved after the intervention of Rhizoma Sparganii-Rhizoma Sparganii，and the improvement in the 1∶1 group was more obvious than that in the 1∶2 group.2）The uterine coefficient，ovarian coefficient，transverse and vertical diameter of uterus，and the expression levels of E2，ER，PI3K and p-AKT/AKT in uterine tissue of rats with uterine leiomyoma significantly increased（P<0.05）.The above indexes decreased after intervention with Rhizoma Sparganii-Rhizoma Sparganii.The improvement in 1∶1 group was more obvious than that in 1∶2 group（P<0.05）.Conclusion：The compatibility of Rhizoma Sparganii-Rhizoma Sparganii can improve uterine leiomyoma，and this mechanism may be achieved by activating PI3K/AKT pathway.

Key Words Rhizoma Sparganii-Rhizoma Sparganii; Component compatibility; PI3K-AKT pathway; Rat; Uterine leiomyoma; Uterine coefficient; Ovarian coefficient; Transverse and vertical diameter of uterus

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.09.009

子宮肌瘤是婦科常見的良性腫瘤之一，以下腹部疼痛、墜脹不適、異常出血等為主要臨床表現，嚴重影響婦女的孕育，更甚者常因治療不及時而出現惡變[1]。目前子宮肌瘤的病因尚未完全明了，學者推測其可能與卵巢分泌功能紊亂、雌孕激素平衡受破壞以及生長因子異常有關[2]。隨著研究的逐漸深入，越來越多文獻支持肌瘤細胞增殖/凋亡失常是導致子宮肌瘤發生發展的關鍵，PI3K-AKT信號通路是經典的與細胞增殖/凋亡密切相關的分子信號通路，同時亦與激素受體調控環節關系密切，有研究[5]顯示子宮肌瘤細胞侵襲能力的強弱與PI3K/AKT信號通路激活程度密切相關。

子宮肌瘤屬于中醫“癥瘕”“積聚”等范疇，《難經·五十五難》云：“氣之所積為積，陽之所聚為聚，積者陰氣也，聚者陽氣也”。認為子宮肌瘤分為癥積與瘕聚，其中癥積乃有形之邪，并多在血分，瘕聚為無形之邪，病在氣分，行氣消積、破血消癥只治療本病的關鍵。通過對近10年文獻的整理罵我們發現氣滯血瘀型是子宮肌瘤發病率最高的證型，故行氣活血化瘀乃其之治則。三棱、莪術均為破血化瘀之良品，二藥屬于“相須”配伍的關系，首載于《經驗良方》，臨床亦不乏二藥合用有效治療婦科疾病的記載[6-7]。隨著中醫藥國際化進程的推進，藥物組份的配伍逐漸成為研究的熱點，本團隊在臨床研究中證實三棱-莪術組份確可有效治療子宮肌瘤，但二藥的配伍比例及作用機制尚不明確，基于此，由此我們以子宮肌瘤模型鼠為研究對象，旨在明確三棱、莪術的配伍規律及可能作用機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 本研究采用36只雌性SD大鼠購買于長沙市天勤生物科技有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（湘）2014-0011，平均大鼠體質重為（200±20）g、所有的實驗大鼠和飼料均經湖南省動檢二站檢測，均達到國家檢疫標準后方簽訂購買合同。所有大鼠均飼養于室溫（23±0.5）℃、濕度（51±3）%環境中，自由攝食，12 h/12 h交替光照。

1.1.2 藥物 三棱莪術配伍組分：1）三棱總黃酮制備：取適量三棱，第一步先采用乙醇提取法進行初提，獲得三棱濃縮液第二步采用石油醚對三棱濃縮液進行脫脂，隨后將脫脂后的三棱樣品進行聚酰胺柱層析，經過蒸餾水、乙醇的層層洗脫后進行真空干燥，獲得三棱總黃酮浸膏并以此為基礎配制成5 g/mL的三棱生藥溶液;2）莪術揮發油的制備：第一步采用水蒸氣蒸餾提取法進行初提，并以此為基礎配制成2 g/mL的莪術生藥溶液;3）“三棱-莪術”組分配伍：將總黃酮與揮發油按生藥量進行折算，其配伍比例為1∶1，1∶2，臨用前加吐溫-80配成乳化劑備用。

1.1.3 試劑與儀器 大鼠雌二醇（E2）ELISA分析試劑盒（北京綠源博德生物科技有限公司，型號：F15321）;大鼠雌激素受體（ER）ELISA分析試劑盒（上海恒遠生物科技有限公司，型號：XL-Er1021）;吐溫-80（Solarbio life sciences公司，型號：T8360）;PI3K一抗[賽信通（上海）生物試劑有限公司，批號39202]，AKT一抗[購自賽信通（上海）生物試劑有限公司，批號2812]，p-AKT一抗[購自賽信通（上海）生物試劑有限公司，批號32412]和GAPDH一抗[賽信通（上海）生物試劑有限公司，批號16234];酶標儀[邁瑞Mindray有限公司，型號：MR-96A];電泳儀（廠家：美國伯樂BIO-RAD公司，型號：PowerPac Basic）;正置LED熒光顯微鏡（上海正晞儀器設備有限公司，型號：ZFM-650）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 36只雌性SD大鼠隨機分為空白組、模型組、1∶1組、1∶2組，每組9只，其中模型組、1∶1組、1∶2組制備子宮肌瘤模型（制備方法如下）。各組大鼠在體質重、飼養環境等條件一致（P>0.05），具有可比性。子宮肌瘤模型制備：除了空白組外，其余的SD雌性大鼠每日灌胃給予己烯雌酚藥液1.35 mg/kg、下肢外側肌肉注射黃體酮注射液1.0 mg/只，3次/周，間隔1 d注射，連續5周;最后2周（即第4周和第5周）開始皮下注射鹽酸腎上腺素注射液0.9 mg/（kg·d），注射4 h后給予隨機給予1種慢性不可預見性刺激，保證整個周期中每種刺激不少于2次。慢性不可預見性刺激分別為以下5種：1）連續3 h不間斷的60 db噪聲刺激，2）晝夜顛倒，3）5～10 ℃冰水浴游泳4 min，4）懸尾10 min，5）50 ℃烘箱烘10 min）。空白組每日灌胃2 mL生理鹽水，下肢外側肌肉注射生理鹽水0.05 mL/只，3次/周，間隔1 d注射，連續5周。

1.2.2 干預方法 1）空白組：10 mL（kg·只）生理鹽水灌胃;2）模型組：10 mL/（kg·只）生理鹽水灌胃;3）三棱莪術1∶1組：根據1∶1配伍比例10 mL（kg·只）灌胃給藥;4）三棱莪術1∶2組：根據1∶2配伍比例10 mL/kg/只灌胃給藥。均連續給藥10周。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 子宮和卵巢系數 大鼠常規麻醉處死后，解剖取出所需子宮組織和卵巢組織，清除組織表面脂肪和血跡，稱取各臟器濕重，計算子宮和卵巢系數，子宮系數=子宮濕重/大鼠體質重×100;卵巢系數=卵巢濕重/大鼠體質重×100%。

1.2.3.2 子宮橫徑和豎徑 采用游標卡尺測量子宮分角上的部分，記錄子宮橫徑和子宮豎徑，其中子宮橫徑為子宮兩分支中最寬處的長度;子宮豎徑為子宮兩分支中較長一支的長度。

1.2.3.3 子宮病理學觀察 取子宮分角上病理改變較典型部位的組織，常規固定石蠟包埋制作病理切片，經過常規HE染色后，在正置LED熒光顯微鏡下觀察子宮平滑肌細胞的細胞排列、體積及數量等形態，觀察是否有炎性浸潤等。

1.2.3.4 酶聯免疫吸附試驗（ELISA） 檢測E2和ER子宮均漿組織，使用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）進行檢測E2、ER，包被、封閉酶標反應孔、洗滌、加入待檢測樣品、加入酶標抗體、加入底物液、終止反應等過程均嚴格按照說明書進行，檢測時一定要首先進行標準品的復孔設置，使標準曲線的可靠性加強。

1.2.3.5 Western blot檢測PI3K/AKT信號通路 裂解液各組大鼠子宮組織，取上清;采用BCA法測蛋白濃度;將等量蛋白（50 μg）上樣至SDS-PAGE凝膠電泳2 h;PVDF膜轉膜，條件：100 V，100 mA，2 h;5%脫脂奶粉封閉2 h;PI3K、AKT、p-AKT和GAPDH一抗抗體孵育，4 ℃過夜后;加入HRP標記二抗;用化學發光法系統對蛋白條帶進行顯影及拍照分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計量數據以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗;計數資料用例（%）表示，進行χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 “三棱-莪術”組方對子宮病理形態的影響 空白組的子宮組織形態學顯示子宮平滑肌細胞排列、體積及數量均正常，排列有序未見明顯病變;模型組顯示子宮平滑肌纖維排列紊亂無序，體積變大，黏膜上皮細胞出現增生變厚，肌層和肌間均可見炎性細胞浸潤;三棱莪術1∶1組細胞排列較模型組有序，黏膜上皮細胞僅有少量空泡變性;三棱莪術1∶2組可見肌纖維排列紊亂但較模型組有序，黏膜上皮細胞空泡變性較三棱莪術1∶1組多，肌層少量炎性細胞浸潤較模型組輕微。見圖1。

2.2 “三棱-莪術”組分對子宮/卵巢系數、子宮橫豎徑的影響 與空白組比較，模型組、三棱莪術1∶1組、三棱莪術1∶2組的子宮系數、卵巢系數、子宮橫徑和豎徑均明顯增加（P<0.05）;三棱莪術1∶1組、三棱莪術1∶2組較模型組均明顯下降（P<0.05），其中三棱莪術1∶1組下降程度優于三棱莪術1∶2組（P<0.05）。見表1。

2.3 三棱-莪術”組分對子宮組織中E2和ER表達水平影響 與空白組比較，模型組、三棱莪術1∶1組、三棱莪術1∶2組的子宮組織中E2和ER表達水平均明顯上調（P<0.05）;三棱莪術1∶1組、三棱莪術1∶2組較模型組均明顯下調（P<;0.05），其中三棱莪術1∶1組下調程度優于三棱莪術1∶2組（P<0.05）。見表2。

2.4 三棱-莪術”組分對對PI3K/AKT通路的影響 與空白組比較，模型組、三棱莪術1∶1組、三棱莪術1∶2組的子宮組織中PI3K/GAPDH、p-AKT/AKT表達水平均明顯上調（P<0.05）;三棱莪術1∶1組、三棱莪術1∶2組較模型組均明顯下調（P<0.05），其中三棱莪術1∶1組下調程度優于三棱莪術1∶2組（P<0.05）。見表3及圖2。

3 討論

3.1 三棱-莪術組分配伍的用藥比例 莪術，性味屬辛苦溫，歸屬于肝脾兩經。該藥首載于《藥性論》，有破氣行血、消積止痛的作用。常用于氣滯血瘀所致的癥瘕積聚、經閉痛經、心腹瘀痛、食積脘腹脹痛等。早在明代《藥品化義》亦云：“蓬術味辛性烈，專攻氣中之血，主破積消堅，去積聚癖塊，經閉血瘀，撲損疼痛，與三棱功用頗同”，書中蓬術即莪術，莪術油是發揮藥效的主要成分，現代醫學認為莪術油是莪術發揮抗腫瘤藥效物質基礎，該成分同時還可預防血栓、消炎、抑制肝纖維化以及鎮痛等[8-10]。三棱，性味屬辛苦平溫，亦歸屬于肝脾兩經，乃止血、消食和胃、破血行氣之要藥。雖然莪術與三棱均有破氣行血之功，但《醫學衷中參西錄》中記載：“三棱、莪術二藥性皆微溫，為化瘀血之要藥。若細核二藥之區別，化血之力三棱優于莪術，理氣之力莪術優于三棱”，故目前認為三棱偏于破血，莪術偏于破氣，二藥因“相須”為用。三棱總黃酮是三棱的主要藥物成分，大量的基礎實驗[11-14]證實三棱總黃酮具有理想的抗栓作用，同時亦有抗腫瘤、消炎鎮痛效應。在諸多古籍中三棱-莪術應用比例多為1∶1，正如《醫學衷中參西錄》中的理沖湯方中三棱-莪術各9 g，旨在調經祛瘀，主治主治婦女經閉不行、陽虛作冷、食少勞嗽等。《普濟方》中的三棱莪術湯亦將三棱-莪術等分為用，以治療小兒疳積。現代臨床報道亦不乏三棱-莪術1∶1應用治療子宮肌瘤的報道，如賈文芳[15]用海藻昆布湯（三棱和莪術各10 g）治療子宮肌瘤，其有效率高達82.35%;辛昕[16]亦使用等份的三棱-莪術對子宮肌瘤患者進行中藥穴位貼敷，結果顯示83.33%比例的患者治療有效。由此可見三棱-莪術1∶1比例具有扎實的臨床研究支持。在本研究中我們將SD雌性大鼠隨機分為4組，模擬子宮肌瘤病理，將三棱-莪術比例設置為1∶1及1∶2 2組，結果顯示三棱-莪術1∶1組在降低子宮、卵巢系數方面明顯優于1∶2組，同時，與1∶2組比較，1∶1組大鼠的子宮組織的纖維化程度受到更為明顯的抑制。佐證了三棱-莪術1∶1比例對子宮肌瘤確有更為理想的療效。

3.2 基于PI3K-AKT信號通路探討三棱-莪術組分抗子宮肌瘤的作用機制 近年來大量研究對三棱-莪術組分的作用機制進行研究，但目前尚無明確結論。目前資料顯示當孕激素表達減少或雌激素作用被抑制時，孕激素誘發子宮肌瘤增殖的效應被拮抗，故我們認為雌激素與孕激素在研究子宮肌瘤發生發展方面均具有重要作用。子宮內膜細胞異常增殖的同時E2和ER被活化，進一步介導激素相關的細胞應該傳遞通路的活性，從而導致子宮內膜細胞產生異常的有絲分裂，從而影響了肌瘤細胞的增殖、分化、增生等過程。在本研究中我們發現E2和ER在模型鼠中存在高表達，隨著三棱-莪術組分的干預，大鼠的E2和ER水平逐漸減少，我們有理由相信三棱-莪術組分抗子宮肌瘤的可能機制與糾正孕激素和雌激素異常激活有關，其中1∶1比例組顯示出了更明顯的優勢。ER水平的高低受到多方因素的調控，大量的分子信號通路均可通過轉錄、翻譯、剪切等途徑對ER的表達進行介導，其中PI3K/Akt信號通路是目前備受關注的機制之一。生長因子將PI3K活化后將下游的磷脂酰肌醇催化成二磷酸磷酯酰肌醇、三磷酸磷酯酰肌醇，上述2種物質均是細胞重要的第二信使，二磷酸磷酯酰肌醇及三磷酸磷酯酰肌醇被催化激活后進一步將下游的AKT活化，AKT的功能涉及細胞周期調控、凋亡的啟動、血管生成、端粒酶活性和細胞侵襲性等諸多方面[17-18]，與諸多疾病均有密切關系。本研究結果顯示，與空白組比較模型組及三棱-莪術組分組大鼠子宮組織的PI3K、p-AKT濃度上調，其中三棱-莪術組PI3K、p-AKT濃度較模型組明顯降低，其中1∶1比例組大鼠降低更為明顯，這提示1∶1三棱-莪術組分可更有效治療子宮肌瘤，且其作用機制可能是通過介導PI3K/Akt通路實現。

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（2019-07-15收稿 責任編輯：王明）