德克薩斯組鈴鐺鐵線蓮胚胎挽救及促進種子萌發技術研究

孫瑞琦 余偉軍 曾黎輝

摘要：[目的]研究不同植物生長調節劑配比處理對德克薩斯組鈴鐺鐵線蓮打破休眠及胚胎挽救的影響，解決德克薩斯鈴鐺鐵線蓮萌發時間過長，高溫脅迫引起種子發育中途敗育的問題，為提高育種效率，縮短育種周期提供理論依據與指導。[方法]以德克薩斯組鈴鐺鐵線蓮‘王夢’為材料，設計12種不同濃度6-BA、NAA的正交試驗篩選鈴鐺鐵線蓮胚胎挽救最適植物生長調節劑濃度，討論椰乳作為培養添加物對胚胎挽救的促進作用;比較低溫、變溫及不同濃度GA、6-BA對打破鈴鐺鐵線蓮種子休眠的影響。[結果]將授粉后45d的雜交鈴鐺鐵線蓮種子離體培養，MS基本培養基添加0.5mg.L6-BA和0.05mg·LNAA可以使鐵線蓮胚胎正常發育成熟的成功率達到47%，發芽率為54%;在此基礎上培養基中再添加10%的椰乳，種子發育成熟率和發芽率均顯著提高到62%。低溫處理和光培養25℃/暗培養15℃的溫度可以促進鈴鐺鐵線蓮種子發芽，配合50mg.LGA或30mg.L6-BA處理打破休眠更加顯著。[結論]鐵線蓮胚可以通過離體挽救解決高溫帶來的敗育問題;植物生長調節劑處理可以顯著打破種子休眠，促進萌發。

關鍵詞：鈴鐺鐵線蓮;雜交;打破休眠;胚胎挽救

中圖分類號：S567文獻標志碼：A 文章編號：1008-0384（2019）09-1040-07

0引言

（研究意義）鐵線蓮Clematis L是毛茛科、鐵線蓮屬中著名的藤本觀賞植物，全球共約300余種，我國有110種左右，全國各地都有分布。根據英國皇家園藝協會的分類，目前市場上常見的園藝品種可以分為：全緣組、佛羅里達組、早花大花組、晚花大花組、常綠組、南歐租、德克薩斯組、長辦組和蒙大拿組等。德克薩斯組鐵線蓮以鈴鐺花型為主，以其極長的花期和廣闊的適應性和強大的抗病能力被廣大園藝愛好者所喜愛，但花徑較小，不適合作園林綠化材料，其他品系鐵線蓮花大艷麗而花期主要集中在4-5月，抗病性不強。如果將德克薩斯組鈴鐺鐵線蓮同花型大、花量多的大花鐵線蓮進行雜交，可以增加其觀賞價值，在園林綠化中大量應用。（前人研究進展）植物胚是一種多細胞結構，胚胎發育完全成熟，沒有任何機械損傷的種子可直接播種成苗。但在雜交育種過程中，獲得的合子胚經常在發育中途敗育或發生嚴重退化，導致不能正常出苗，嚴重影響了育種效率。通過離體培養進行胚挽救，使可以敗育或退化的胚正常發育獲得和自然成熟一樣的種子和再生植株，這種技術在植物育種中具有十分重要的指導與實踐意義。導致植物種子休眠的主要原因分為外界環境因素和自身因素兩類;外界因素包括：溫濕度、光照、空氣、土壤微生物等，自身因素又包括種殼束縛、以及種胚未發育成熟等。有機酸、酚類、醛類、亞胺等物質是種子內部抑制發芽萌發的主要成分，這些物質需經過一段時間才能被種子分解代謝，以上幾種物質共同造成部分植物種子發芽困艱難。曹昊等研究表明赤霉素處理能夠打破東北鐵線蓮種子的休眠，縮短發芽所需時間，10mg.LGA溶液浸種30min可以明顯促進東北鐵線蓮種子萌發、提高發芽率，當浸種濃度大于50mg.L時種子發芽率降低，表現出一定的毒害現象。因此，鐵線蓮休眠原因可能也與脫落酸、赤霉素、乙烯等內源激素有關。（本研究切入點）在鐵線蓮雜交育種中，經常遇到胚胎敗育和休眠時間過長的問題，如鈴鐺鐵線蓮‘王夢’、‘櫻桃唇’雜交授粉成功后，胚胎需要約80d左右才能完全成熟，但是在發育至55d左右，種子完全成熟前會突然敗育，導致結實率低，雜交效率不理想。鐵線蓮種子的萌發溫度盡量控制在15℃-25℃。普通鐵線蓮種子經過1-2次自然低溫刺激可能萌發，雜交鐵線蓮種子需要2-3年甚至更久才能萌發。鈴鐺鐵線蓮雜交胚胎敗育的具體原因和打破休眠的研究尚未見報道。（擬解決的關鍵問題）本試驗以德克薩斯組鈴鐺花型鐵線蓮‘王夢’為材料進行胚胎挽救和打破種子休眠的初步探索，以期為德克薩斯組鐵線蓮的繁殖及雜交育種提供技術支持。

1材料與方法

1.1 試驗材料

供試種子均采自福建農林大學園藝遺傳育種教研室種質資源圃5年生德克薩斯組鈴鐺鐵線蓮‘王夢’。胚挽救試驗種子采用‘王夢’為母本與‘櫻桃唇’為父本的雜交種子。打破休眠試驗種子采用‘王夢’自花授粉的成熟種子。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子百粒重、相對含水量和吸水率的測定隨機取種子100粒，用電子天平稱重（精確至0.0001g），重復3次，然后計算平均值，由此得出‘王夢’種子的百粒重。隨機取種子100粒，用60℃烘箱烘至恒重。重復3次，用下列公式計算種子的相對含水量：種子的相對含水量（%）=（100粒種子原重-千重）/100粒種子原重×100%。隨機取種子100粒，浸泡于水中，直至重量不再變化，稱重。重復3次，用下列公式計算種子的吸水率：種子的吸水率（%）=（100粒種子吸水后重量-100粒種子原重）/100粒種子原重×100%。

1.2.2胚胎挽救 采集父本剛開放花朵的花藥，收集花粉，放人培養皿中備用;母本半開放時，輕輕撥開花苞，將雄蕊拔除。用毛筆蘸取花粉，均勻涂抹到柱頭上。對授粉的花進行套袋標記父本母本和授粉日期。未完成雙受精過程的胚直接敗育（圖1），正常完成雙受精過程的胚生長到45d時剝去外種皮可觀察到綠色飽滿的種仁（圖2），將其放入培養瓶中，加入洗衣粉搓洗10min，再用自來水沖洗60min，在超凈工作臺中用0.1%HgCl消毒8、10、12、15min后接人空白MS培養基中，5d后觀察褐變、污染情況，篩選最適消毒時間。

把無菌的種子分別接人不同濃度的6-BA和NAA的培養基中培養40d后觀察種子發育情況，研究不同植物生長調節劑濃度對鐵線蓮胚胎發育的影響;以6-BA和NAA培養基為基礎，附加10%的椰乳，觀察椰乳對鐵線蓮胚胎發育的影響。每個處理為20粒種子，重復3次。培養基均以MS為基本培養基，添加蔗糖30g.L，pH值6.0，培養溫度（25±2）℃，光照時間16h·d，光照強度4000lX。

將發育成熟的種子播種到光培養25℃，暗培養15℃的人工氣候箱中（基質為泥炭和珍珠巖，體積比3：1），60d后觀察統計發芽情況。

發育率=種胚發育成熟數/接種數×100%

發芽率=發芽數/發育成熟數×100%

1.2.3打破種子休眠 將植株上成熟的種子采收后剝去外種皮，對照直接播種于基質中（泥炭珍珠巖體積比3：1）在田間自然狀態下萌發;處理1將種子放人蒸餾水中在4℃冰箱中放置1月后播種于基質中放入田間自然狀態下萌發;處理2直接播種于基質中放置于人工氣候箱內（光培養25℃/暗培養15℃）萌發，分別觀察低溫和晝夜溫差處理對鈴鐺鐵線蓮種子萌發的影響，每個處理為20粒種子，重復3次。40d后觀察統計萌發率。

在上述研究基礎上，以經過低溫+晝夜溫差處理的種子為對照，研究GA和6-BA處理對打破鈴鐺鐵線蓮種子休眠的影響。將植株上成熟的種子采收后剝去外種皮，放人蒸餾水中在4℃冰箱中放置1周后取出搓洗干凈未剝下的外種皮，吸干水后放人組培瓶，在4℃冰箱中再靜置3周后，將種子取出分別放人5、20、30、50、80mg.LGA或5、20、30、50、80mg.L6-BA中浸泡4h。取出種子用蒸餾水沖洗干凈后播入經過高壓消毒過泥炭土與珍珠巖混合（體積比3：1，含水量75%）的基質中，覆膜，再放人人工氣候箱（光培養25℃/暗培養15℃）。每處理20粒種子，重復3次。40d后觀察統計萌發率。

2結果與分析

2.1 鐵線蓮‘王夢’種子百粒重、相對含水量、吸水率的測定

百粒重直觀的反映種子的品質，種子貯藏的營養物質越多，百粒重越大。胚胎挽救取材于未成熟種子，種子百粒重可以幫助預估胚胎挽救培養時間。測定結果表明鐵線蓮‘王夢’的種子百粒重為（2.672±0.013）g。有報道褐毛鐵線蓮的百粒重為（1.359±0.001）g，林地鐵線蓮的百粒重只有（0.133±0.004）g，與其他鐵線蓮相比，‘王夢’的種子重量較大。

種子萌發與種子含水量關系密切，向日葵種子在含水量6%-7%時，短時間內即可發芽，當含水量在低于5.5%或高于7.5%時種子進入休眠狀態，較難萌發，褐毛鐵線蓮種子的相對含水量為（9.33±0.01）%，棉團鐵線蓮的相對含水量為（13.67±0.15）%，鐵線蓮‘王夢’的種子相對含水量為（18.50±0.01）%，與其他鐵線蓮相比，相對含水量也較高。

2.2 不同消毒時間對鐵線蓮種子的影響

鈴鐺鐵線蓮種子褐變呈乳白色。根據表1可以看出隨著消毒時間的增加，鐵線蓮種子的褐變率逐漸升高，污染率逐漸下降。在消毒15min時，63.33%種子都出現褐變情況，但消毒較為徹底。在消毒8min時，褐變率最低，污染率最高。消毒時間控制在10-12min內可以得到較低的褐變率和污染率。

2.3 不同植物生長調節劑組合對鐵線蓮種子胚胎發育的影響

胚胎挽救培養基配方及發育發芽情況如表2所示。在培養20d后可憑肉眼觀察到種子是否正常發育.正常發育的種子顏色呈淺棕色。厚度均勻，子葉飽滿，種胚發育完好，沒有干癟也沒有過度膨大，外形顏色均與自然成熟種子無異（圖3）。沒有正常發育的種子呈乳白色，少數深褐色，種仁異常膨大或干癟呈敗育狀態，內部充滿水分（圖4-5）。正常發育種子和敗育種子對比（圖6），發育成熟播種后發芽（圖7）。

植物胚胎挽救所需的植物生長調節劑濃度總體較低，不同6-BA和NAA的濃度配比對鐵線蓮胚胎挽救影響差異較大。從表2可以看出，低濃度的6-BA和NAA對鈴鐺鐵線蓮胚的發育率和發芽率影響較小，隨著2種植物生長調節劑濃度的增加，胚的發育率和發芽率也逐漸上升。0.5mg.L6-BA與0.05mg·LNAA等比例混合使用可以使鐵線蓮胚胎正常發育成熟的成功率達到46.66%，同時使發芽率保持在53.57%。6-BA對胚胎挽救發芽率影響比較明顯，而不同水平的NAA對鐵線蓮胚胎挽救的發芽率影響不顯著。培養基中添加椰乳后，明顯提高種子的發育率和發芽率，0.5mg.L6-BA+0.05mg.LNAA+10%椰乳培養基中的種子的發育率和發芽率均達到最高。

2.4 不同處理對鐵線蓮種子萌發的影響

由表3可見，僅低溫處理或晝夜溫差處理的部分種子在播種后40d可以發芽，但萌發率較低。由表4可見，結合6-BA或GA處理的種子發芽率隨著處理濃度增加均呈現先升后降的趨勢，低濃度的GA和6-BA對鈴鐺鐵線蓮種子的萌發均無明顯的促進作用，在植物生長調節劑濃度過高時反而對種子的萌發起抑制作用。50mg·LGA處理的種子發芽率達到了76.66%，30mg.L6-BA處理的種子發芽率最高，達到了81.66%。未經任何處理的鈴鐺鐵線蓮從2018年7月3日采收播種到10月21日開始發芽需要108d，而30mg·L6-BA低溫處理的種子在70d時（30d低溫處理+40d發芽）發芽率達81.66%且發芽時間縮短38d。

3討論與結論

胚的活體轉移、活體培養和離體培養，是迄今為止已有報道的3種植物幼胚拯救方法。幼胚、敗育胚、退化胚等都可以作為胚胎挽救的材料.影響植物胚胎挽救成功率的因素主要有培養溫濕度、生長調節劑配比、胚發育情況、基本培養基、培養方法、其他培養基添加物等。其中椰乳作為一種常用的培養基添加劑對胚的離體培養有重要的作用。陳容茂等發現在培養基中添加10%椰乳，可促進龍眼胚狀體發育正常，甚至經過一段時間培養可以直接萌發。添加椰乳對雜交東方百合幼胚離體培養成活率也有明顯的促進作用?？赡苁怯捎谝橹泻蠱S培養基不能提供的種胚生長發育所必須的營養物質。

在田間栽培過程中發現鈴鐺鐵線蓮種子自然發育成熟需要80d左右。四月初雜交授粉，正常完成雙受精過程的胚生長到45d時，發育正常，種仁飽滿，外種皮較軟，內種皮發育完全，此后種子陸續開始敗育。本試驗主要探究正常胚體外培養的可行性，遂在種子發育至45d時取材進行胚胎挽救。實驗全部過程均在2018年內完成，但在2019年栽培中發現：5月整體氣溫較低，鐵線蓮種子生長狀況良好，未出現敗育情況。查詢歷史天氣可知：2019年5月平均高溫24℃，平均低溫17℃，而2018年5月平均高溫32℃，平均低溫22℃，≥33℃以上的高溫天氣達到15d，且氣溫變化幅度較大，這很可能是導致胚敗育的原因.高溫引起導致植物敗育的機制只在棉花、水稻中有相關研究，花卉方面未見報道。經過胚胎挽救培養的鈴鐺鐵線蓮種子成熟后播種60d的萌發率可以達到62%且發芽時間比自然狀態萌發提前40d左右。目前的胚胎挽救技術主要集中核果類果樹方面，花卉中只有月季、菊花等有少許研究。本研究驗證了鐵線蓮未成熟種子進行胚胎挽救的可行性，篩選了較優消毒時間和植物生長調節劑配方，為提高鐵線蓮雜交育種效率，培育新品種創造條件。

完全成熟的種子ABA含量最高。ABA與GA對植物種子萌發的影響完全相反。種子萌發困難的原因是種子休眠時內部ABA含量升高，高濃度的ABA促進種子休眠以便種子安全度過逆境;當極端天氣結束，萌發環境適宜時，種子內部ABA含量降低，GA濃度逐漸升高，這種激素濃度的動態變化打破種子休眠，促進種子在適宜的環境和時間節點萌發。三因子學說的觀點認為：種子休眠和萌發的原因是種子內部萌發促進物和抑制物的動態變化。萌發抑制物可以消除細胞分裂素和生長素的對萌發的促進作用，隨著種子萌發過程的進行，種子內部激素的動態變化大致為赤霉素、細胞分裂素和生長素的濃度在逐漸升高以及脫落酸的降低。赤霉素可代替低溫處理解除種子休眠，羅登攀的研究表明用250mg.LGA浸種6h可以顯著促進臘梅種子的萌發。6-BA是人工合成的細胞分裂素類物質，它的作用是細胞分裂和橫向增粗，提高種子發芽率，促進種子發芽。20mg.L的6-BA對五指茄萌發、生根都有較好的促進作用。本試驗通過研究低溫、晝夜溫度變化、以及不同濃度植物生長調節劑（6-BA、GA）對打破鈴鐺鐵線蓮種子休眠、促進萌發的影響。結果表明低溫和光培養25℃/暗培養15℃晝夜溫差處理可以適當促進鈴鐺鐵線蓮的萌發，這2種處理配合6-BA、GA對促進鈴鐺鐵線蓮萌發效果更加明顯。通過人工可控環境打破種子休眠，促進提早萌發，是縮短鐵線蓮育種周期的有效手段。