茶多酚對脊髓損傷大鼠急性期氧自由基與炎癥因子的影響

鄧鳳君　曾婭玲　龔勇珍　廖端芳

〔摘要〕 目的 研究茶多酚（tea polyphenols， TP）對大鼠脊髓損傷（spinal cord injury， SCI）急性期抗氧化與抗炎的作用。方法SD雌性大鼠隨機分為6組，每組6只，建立大鼠脊髓半切SCI模型，分為假手術組、模型組、陽性藥組（甲基強的松龍100 mg/kg）、TP高劑量組（100 mg/kg）、TP中劑量組（50 mg/kg）、TP低劑量組（25 mg/kg）。術后5 min，假手術組和模型組灌胃生理鹽水（10 mL/kg），其他組別灌胃相應藥物。24 h后取受損脊髓局部組織，HE染色觀察脊髓組織形態學變化，測定脊髓組織中·O2-、NO水平及誘導型-化氮合酶（iNOS）蛋白含量、抗氧化酶系統SOD與MDA活性以及血清中炎癥因子IL-1β、IL-6與IL-8的含量。結果 HE染色圖像顯示，TP各劑量組脊髓形態好于模型組;同時，與模型組比較，TP降低了SCI大鼠脊髓組織中活性氧（ROS）的水平、增加了SOD活性、降低了MDA含量（P<0.05），亦減少了血清炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8的含量（P<0.05）。結論 茶多酚能減少SCI大鼠急性期氧自由基與炎癥因子的表達。

〔關鍵詞〕 脊髓損傷;茶多酚;活性氧簇;白細胞介素-1β;白細胞介素-6;白細胞介素-8

〔中圖分類號〕R285.5;R651.2? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.09.006

Effects of Tea Polyphenols on Oxygen Free Radicals and Inflammatory Factors in

Acute Phase of Rats with Spinal Cord Injury

DENG Fengjun1，2， ZENG Yaling2， GONG Yongzhen2*， LIAO Duanfang2

（1. Yiyang Medical College， Yiyang， Hunan 413000， China; 2. Hunan University of Chinese Medicine，

Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To study the anti-oxidation and anti-inflammatory effect of tea polyphenols （TP） in acute phase of rats with spinal cord injury （SCI）. Methods SD female rats were randomly divided into 6 groups， with 6 rats in each group. SCI rat model was established by hemisection at spinal cord. SCI rats were divided into a sham operation group， a model group， a positive drug group （methylprednisolone 100 mg/kg）， a TP high dose group （100 mg/kg）， a TP middle dose group （50 mg/kg） and a TP low dose group （25 mg/kg）. After 5 min of finishing the operation， the sham operation group and the model group were given normal saline （10 mL/kg） by gavage， and the other groups were given corresponding drugs by gavage. After 24 h， local tissue of damaged spinal cord was taken. Morphological changes of spinal cord tissue were observed by HE staining. Contents of O·2-， NO， and iNOS protein in spinal cord tissue， the activity of SOD and MDA in antioxidase system， and contents of inflammatory factors IL-1β， IL-6 and IL-8 in serum were determined. Results HE staining showed that the morphology of spinal cord in the TP groups was better than that in the model group. Compared with the model group， TP decreased the level of reactive oxygen species （ROS） in spinal cord tissue， increased the SOD activity， decreased the MDA content （P<0.05）， and also decreased the contents of inflammatory factors IL-1β， IL-6 and IL-8 in serum of SCI rats （P<0.05）. Conclusion TP can reduce the expressions of oxygen free radicals and inflammatory factors in acute phase of SCI rats.

〔Keywords〕 spinal cord injury （SCI）; tea polyphenols （TP）; reactive oxygen species （ROS）; interleukin-1β （IL-1β）; interleukin-6 （IL-6）; interleukin-8 （IL-8）

脊髓損傷（spinal cord injury， SCI）作為目前最嚴重的災難性損傷給患者家庭與社會造成了沉重負擔。SCI病理病機復雜，迄今為止尚無特別有效的治療方法。SCI包括不可逆難治療的原發性損傷和可逆性治療手段可介入的繼發性損傷[1]。藥物治療是預防繼發性損傷的有效方式。研究表明，抗氧化劑白藜蘆醇等通過抑制氧自由基、激活抗氧化酶系統，在SCI后修復受損脊髓組織，促進脊髓功能恢復[2]。茶多酚（tea polyphenols，TP）亦是高效天然抗氧化劑，源自于綠茶，是綠茶中最主要活性成分，能高效清除自由基，亦能抑制與自由基有關的酶，產生顯著的抗炎抗氧化作用[3]。TP能透過血腦屏障，保護神經細胞，減少氧自由基所致神經細胞損傷，具有潛在治療神經損傷疾病的價值[4]。但是TP對脊髓損傷作用的研究還少見報道。本文擬研究TP對SCI大鼠急性期抗炎與抗氧化作用，期探討TP對SCI急性期氧自由基與炎癥因子的作用。

1 材料

1.1? 實驗動物

SD大鼠36只，SPF級，健康雌性，二月齡，質量180～220 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物質量許可證號：SCXK（湘）2011-0003。飼養環境通風、清潔、安靜，22～25 ℃，相對濕度40%～70%，飼養一周待動物適應環境后造模給藥處理，每日按時供給水和飼料。

1.2? 實驗試劑

TP：質量分數98%，江西綠康天然產物公司，批號F14079501，生理鹽水現用現配。甲基強的松龍（MPSS）：比利時，批號141267，生理鹽水現用現配。

MDA、SOD、超氧自由基（·O2-）、NO試劑盒（南京建成）。白細胞介素（IL-1β、IL-6、IL-8）ELISA試劑盒（批號依次為301330023113EIA、301330011112EIA、301330101213EIA， ADL公司，USA）。

兔抗iNOS多克隆抗體：ab15323，Abcam，USA，1∶200（V/V）。兔抗GAPDH多克隆抗體：sc137179，Santa Cruz，USA，1∶10 000（V/V）。山羊抗兔 IgG：二抗，sc-2004，Santa Cruz，USA，1∶10 000（V/V）。

1.3? 儀器設備

752型紫外分光光度計（上海光學儀器一廠），XDS-1B倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）;TGL-16A低溫離心機（長沙平凡儀器儀表公司），DY89-II型電動玻璃勻漿機（寧波新芝生物科技股份有限公司），BP121S電子天平（德國Sartorious公司）;G42電泳儀、Fastblot B31蛋白質快速半干轉移系統均購于德國Biometra公司。

2 方法

2.1? 脊髓半切模型建立

選T10節段（T8椎板）作損傷節段，右側半切脊髓[5]。大鼠以水合氯醛（300 mg/kg，i.p.）麻醉，俯臥四肢伸展固定于自制鼠臺。在T10節段右側橫行切斷脊髓，切斷脊髓后，可見大鼠右后肢抽搐數次后軟癱。明膠海綿填塞斷端間隙，逐層縫合肌肉、筋膜、皮膚，皮下注射5 mL生理鹽水預防半切術后脫水。

2.2? 分組與干預

SD雌性大鼠分為6組，每組6只，第一組為假手術組，采用與模型組一致的手術過程，打開椎管暴露脊髓，但不進行半切;其余各組脊髓進行右側半切，分為模型組、陽性藥組（甲基強的松龍100 mg/kg）、TP高劑量組（100 mg/kg）、TP中劑量組（50 mg/kg）、TP低劑量組（25 mg/kg）。術后5 min，假手術組和模型組灌胃生理鹽水（10 mL/kg），其他組別灌胃生理鹽水配制的藥物。

2.3? 取材與檢測

2.3.1? 心臟灌流? 干預24 h后取材。水合氯醛（0.3 g/kg，i.p.）麻醉后心臟灌流，從左心室注入，右心耳流出。37 ℃生理鹽水快速推注150 mL，后滴注200 mL（60滴/min），灌注直至右心耳流出的生理鹽水變清亮，肺和肝變白。

2.3.2? HE病理組織染色? 心臟灌流后，4%多聚甲醛10 min內緩慢推注60 mL后，再滴注200 mL（30滴/min），原切口處剪下4 cm脊柱，以損傷處為中心取下2 cm脊髓，預冷的生理鹽水洗凈組織，濾紙吸干水分，放入EP管中（內有4%多聚甲醛溶液1 mL）避光保存待做病理切片。

2.3.3? 活性氧簇水平測定? 心臟灌流后原切口處剪下4 cm脊柱，剝離取下4 cm脊髓，冰冷的生理鹽水洗凈組織，濾紙吸干水分。精準稱重組織，冰上操作加生理鹽水制備成10%的組織勻漿，3 000 r/min，離心10 min，取上清加入生理鹽水按1∶9稀釋成1%的組織勻漿，根據試劑盒測定·O2-、NO水平。

2.3.4? iNOS蛋白含量測定? 脊髓組織100 mg加入0.5 mL RIPA裂解液4 ℃裂解1 h。12 000 r/min、 4 ℃離心20 min，取上清。加入上樣緩沖液，煮5 min讓蛋白變性。每孔上樣總蛋白8 μL，15% SDS-聚丙烯凝膠濃縮膠電壓80 V，分離膠120 V電泳2 h，80 mA轉膜30 min。室溫下封閉2 h（用50 g/L牛血清白蛋白的TBST緩沖液），然后分別加入一抗：兔抗iNOS多克隆抗體（1∶200）、兔抗GAPDH多克隆抗體（1∶10 000），4 ℃過夜。再分別加入相應二抗室溫孵育1 h[山羊抗兔 IgG （H+L）/HRP，1∶10 000]。ECL發光試劑盒顯影，用Image-Pro軟件分析條帶吸光值。

2.3.5? 抗氧化酶系統活性測定? 根據試劑盒測定1%的組織勻漿中SOD、MDA水平，方法同“2.3.3”。

2.3.6? 血清IL-1β、IL-6與IL-8含量測定? 給藥24 h后摘右眼球取血5 mL。血液22 ℃靜置2 h，4 ℃冰箱放置18～22 h，2 000 r/min 離心20 min，取上清，根據ELISA試劑盒說明書進行血清炎癥因子含量測定。

2.4? 統計學方法

實驗數據以“x±s”表示。SPSS 17.0軟件做統計分析，數據分析采用單因素方差分析，各組之間多重比較方差齊性采用LSD法，方差不齊采用Dunnett’s法。P<0.05表示差異有統計學意義，P<0.01表示差異有顯著統計學意義。

3 結果

3.1? TP對脊髓組織病理形態的影響

HE染色后光學顯微鏡下觀察，假手術組大鼠脊髓組織結構完整，細胞膜完整，神經細胞分布均勻、形態正常，神經纖維排列整齊，細胞間基質均勻。模型組脊髓組織在損傷區中央見大片血細胞，出現囊腔樣變化，細胞腫脹、空泡變性，并有大量炎性細胞浸潤。TP高劑量組組織結構排列較完整，神經纖維排列整齊，細胞間基質較均勻，偶見炎性水腫。TP中、低劑量組脊髓組織空泡減輕，可見炎性細胞浸潤，但低于模型組。見圖1。

3.2? TP對SCI大鼠脊髓中活性氧簇的影響

大鼠脊髓右側半切24 h后，與假手術組相比，脊髓組織對·O2-活性抑制能力下降，NO水平與iNOS蛋白表達上升（P<0.01）。TP高、中、低3個劑量組給藥24 h后，與模型組相比，脊髓組織對·O2-活性抑制能力增加，NO水平與iNOS蛋白表達均下降（P<0.05或P<0.01）。與高劑量組相比，TP中、低劑量抑制·O2-活性能力低于高劑量，TP低劑量降低NO水平能力低于高劑量（P<0.05），其余指標3個劑量TP組均無統計學差異，見表1。iNOS蛋白表達條帶灰度值越小，說明iNOS蛋白表達量越少，見圖2。

3.3? TP對SCI大鼠抗氧化酶系統的影響

脊髓組織右側半切24 h后，與假手術組相比，組織中SOD活性下降，MDA水平增加（P<0.01，表2）。TP高、中、低3個劑量給藥24 h后，與模型組比較，脊髓組織中SOD活性增加，MDA含量減少（P<0.05或P<0.01，表2）。3個劑量TP組之間差異無統計學意義（P>0.05）。

3.4? TP對血清炎癥因子的影響

大鼠脊髓半切24 h后，與假手術組相比，血清炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8含量均增加（P<0.01，表3）。TP高、中、低3個劑量給藥24 h后，與模型組相比，血清IL-1β、 IL-6、IL-8含量均減少（P<0.05或P<0.01，表3）。與高劑量組相比，TP低劑量組對IL-6、IL-8含量的影響低于高劑量（P<0.05或P<0.01，表3）;其余指標3個劑量TP組差異無統計學意義（P>0.05）。

4 討論

SCI是一種后果嚴重、災難性的神經損傷，其中具有可逆性并可被調控的繼發性損傷急性期主要表現為氧自由基損傷、炎癥因子聚集等，因而具有抗氧化抗炎的藥物成為治療SCI的重要手段，如被美國FDA唯一批準治療SCI的藥物MPSS，以及臨床常用的神經節苷脂。但是這兩種藥物或者毒副作用明顯，或者療效不穩定。高效抗氧化劑成為了SCI研究近幾年的熱門方向。本文探討了天然高效抗氧化劑TP對SCI的作用。TP源自綠茶，能清除自由基，具有抗炎、抗衰老、提高免疫力、防癌等一系列優異功能，且易通過血腦屏障，清除自由基[6]。因此，我們推測它也許能保護神經細胞，治療神經細胞損傷性疾病。

繼發性脊髓損傷急性期機體產生ROS，主要包括·O2ˉ、NO和H2O2等，損害機體引起多種途徑的細胞功能紊亂。·O2ˉ自由基能夠間接啟動脂質過氧化損傷，破壞生物大分子如DNA、酶等。NO是體內最活躍的自體活性物質，過量的NO參與許多病理損傷過程，而iNOS能誘導產生NO，導致細胞凋亡[7]。機體在氧化代謝過程中會產生少量的自由基，機體本身亦存在抗氧化系統，包括清除ROS的GSH-Px、SOD等，用以維持氧自由基的代謝平衡[8]。SOD活性愈高，機體清除氧自由基能力愈強;與SOD密切相關的另一物質MDA是過氧化反應的最終產物，具有細胞毒性，其水平越高，細胞受自由基攻擊的嚴重程度越明顯[9]。本文研究結果顯示，SCI大鼠急性期脊髓組織抑制·O2ˉ能力下降，NO水平與iNOS蛋白含量均增加，TP給藥后，各濃度組抑制·O2ˉ能力增加，高劑量效果優于中低劑量;NO水平降低，中高劑量優于低劑量;3個劑量TP組均能降低iNOS蛋白含量，且差異無統計學意義。說明TP能有效拮抗SCI急性期的氧自由基的活性。同時TP處理后，受損脊髓組織內SOD活性升高，MDA水平下降，且3個劑量組之間差異無統計學意義，顯示TP能提高受損脊髓組織抗氧化酶系統的活性。

中樞神經系統炎癥反應會出現小膠質細胞的激活和白細胞的浸潤，進而誘導釋放IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等前炎癥因子。脊髓損傷后，產生的前炎癥因子可加重繼發性損傷的程度。研究認為，SCI后急性期產生的IL-lβ具有啟動神經細胞凋亡和加劇炎癥反應的作用，IL-6是參與全身炎性反應綜合癥的眾多介質中最有影響的促炎因子，IL-8是一種有效的炎性介質，趨化和刺激中性粒細胞和T淋巴細胞，從而介導炎性反應[10-11]。SCI急性期，IL-1β、IL-6與IL-8水平明顯增高，是急性時相的一種表現，使脊髓在原發性損傷的基礎上進一步導致局部缺血而加重脊髓繼發性損傷[12]。本研究發現TP能減少SCI大鼠血清中IL-1β、IL-6與IL-8水平，說明TP通過抑制炎癥因子釋放，產生顯著抗炎作用，從而有效保護受損脊髓。

綜上所述，TP能降低受損脊髓組織活性氧簇水平，提高抗氧化酶系統活性，減少炎癥因子的釋放，說明TP對繼發性SCI急性期可能具有一定的保護作用。本研究為SCI防治提供了一種可能有效的活性成分。尚需進一步研究的是TP對SCI慢性期藥效學觀察及其抑制SCI的分子作用機制。

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