降脂理肝湯對非酒精性脂肪肝大鼠腸黏膜屏障的影響

尹抗抗　王柏果　徐琦　程婉紅　鄧天好　譚達全　唐標

〔摘要〕 目的 觀察降脂理肝湯對非酒精性脂肪肝大鼠腸黏膜屏障的影響，探討降脂理肝湯干預非酒精性脂肪肝的機制。方法 40只SD雄性大鼠隨機分為正常組（10只）和造模組（30只），采用高脂飲食喂養(yǎng)復制非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease， NAFLD）大鼠模型，造模組大鼠再隨機分為高脂飲食模型組、降脂理肝湯低劑量及高劑量組（4.6、9.2 g/kg），分別予以相應干預6周后取小腸和門靜脈血液，檢測腸黏膜結構、緊密連接蛋白（Occludin）和ZO-1蛋白水平以及血漿內毒素水平。結果 與正常組比較，高脂飲食大鼠小腸絨毛稀疏且排列不整齊、小腸絨毛高度明顯降低（P<0.01），Occludin和ZO-1蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），血漿內毒素水平顯著上升（P<0.01）。與高脂飲食模型組比較，高劑量降脂理肝湯組小腸絨毛排列較整齊，斷裂較少，絨毛高度顯著升高（P<0.01），Occludin和ZO-1蛋白水平顯著上升（P<0.05），血漿內毒素水平明顯降低（P<0.01）;而低劑量降脂理肝湯組僅顯著降低了血漿內毒素水平（P<0.01）。結論 降脂理肝湯干預非酒精性脂肪肝的機制可能與其改善小腸絨毛結構，恢復Occludin和ZO-1蛋白水平從而減輕腸黏膜屏障損傷，降低血漿中的內毒素水平有關。

〔關鍵詞〕 降脂理肝湯;非酒精性脂肪肝病;腸黏膜屏障;Occludin蛋白;ZO-1蛋白;內毒素

〔中圖分類號〕R285.5;R575.5? ? ? ? 〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.09.008

Effects of Jiangzhi Ligan Decoction on Intestinal Mucosal Barrier in Rats with

Non-alcoholic Fatty Liver Disease

YIN Kangkang， WANG Baiguo， XU Qi， CHENG Wanhong， DENG Tianhao， TAN Daquan， TANG Biao*

（Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To explore the effects of Jiangzhi Ligan Decoction （JZLGT） on intestinal mucosal barrier in rats with non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD）， and to explore the intervention mechanism of JZLGT in NAFLD. Methods Forty male Sprague-Dawley （SD） rats were divided into a normal diet （ND） group （10 rats） and a model group （30 rats）. NAFLD rat model was successfully replicated by high-fat diet （HFD） feeding. Then the 30 rats in the model group were randomly divided into a HFD model group， a JZLGT-Low group and a JZLGT-High group （treated with 4.6 and 9.2 g/kg， respectively）. After 6 weeks of corresponding intervention， blood of intestine and portal vein was collected. The structure of intestinal mucosa， levels of Occludin， ZO-1 and plasma endotoxin were determined. Results Compared with the ND group， the villi of the small intestine in the HFD rats were sparse and irregularly ranged， with the length of the small intestinal villi dramatically decreased （P<0.01）; the expression levels of Occludin and ZO-1 were significantly decreased （P<0.05）， and the plasma endotoxin level was notably increased （P<0.01）. Compared with the HFD model group， the villi of the small intestine in the JZLGT-High group were neatly ranged and less fractured， with the length of villi obviously increased （P<0.01）; the levels of Occludin and ZO-1 were remarkably increased （P<0.05）， and the plasma endotoxin level was significantly decreased （P<0.01）. However， only the plasma endotoxin level was decreased significantly in rats of the JZLGT-Low group （P<0.01）. Conclusion The intervention mechanism of JZLGT on NAFLD may be related to the structural improvement of small intestinal villi and the restored expression levels of Occludin and ZO-1 proteins， which can relieve the injury of intestinal mucosal barrier and decrease the level of plasma endotoxin.

〔Keywords〕 Jiangzhi Ligan Decoction; non-alcoholic fatty liver disease; intestinal mucosal barrier; Occludin protein; ZO-1 protein; endotoxin

非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease， NAFLD）是一種無過量飲酒史，以肝細胞脂肪變性和脂質沉積為主要特征的代謝綜合征。目前普遍認為NAFLD是遺傳-環(huán)境-代謝相關性疾病，其發(fā)病機制主要與胰島素抵抗、氧化應激、脂質過氧化、細胞因子、內毒素血癥和炎癥反應等多種因素有關，并且部分NAFLD會進展為肝纖維化和肝硬化[1]。此外，也有研究提出“腸-肝軸”學說介導了NAFLD發(fā)生和發(fā)展過程，腸黏膜屏障功能受損導致腸道細菌移位和內毒素進入門靜脈系統(tǒng)，加重肝臟炎癥反應及肝臟損傷。近年來，“腸-肝軸”學說受到越來越多的關注，腸黏膜屏障在NAFLD發(fā)病機制中的作用成為NAFLD干預的重要問題[2]。

腸黏膜屏障由機械屏障、化學屏障、免疫屏障與生物屏障組成[2-3]，其中機械屏障最為重要，機械屏障的結構基礎主要包括完整的腸黏膜上皮細胞以及上皮細胞間的緊密連接。緊密連接由多種緊密連接蛋白構成，其中最為重要的兩種連接蛋白為Occludin和閉合小環(huán)蛋白ZO-1，這些緊密連接蛋白的異常會導致緊密連接受損[4-5]。降脂理肝湯由澤瀉、決明子、丹參、郁金、海藻、荷葉等6味中藥組成。前期臨床研究表明，降脂理肝湯具有調脂、護肝、減肥作用，治療NAFLD療效確切[6-8]，我們前期研究揭示降脂理肝湯可通過調控腸道菌群的結構，抑制NAFLD大鼠腸道細菌的過度生長，干預NAFLD[9]。而腸道菌群對腸黏膜屏障的維持具有重要作用[10]，本實驗旨在進一步觀察降脂理肝湯對NAFLD大鼠腸黏膜屏障的影響，探討降脂理肝湯干預NAFLD的機制。

1 實驗材料

1.1? 動物

健康SPF級SD雄性大鼠40只，體質量（150±10）g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，生產許可證號SYXK（湘）2011-0003。

1.2? 藥物及主要試劑

降脂理肝湯：澤瀉10 g，決明子30 g，丹參10 g，郁金10 g，海藻30 g，荷葉10 g。參照前期研究制備藥物和給藥[7]，中藥飲片均購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥房，由制劑室煎制成含生藥為0.92 g/mL和0.46 g/mL的濃縮液。兔抗大鼠Occludin多克隆抗體（貨號：SAB4200593）、兔抗大鼠ZO-1多克隆抗體（貨號：HPA001636）均由Sigma公司提供，山羊抗兔二抗（貨號：AP132P ，Merck Millipore公司），DAB顯色試劑盒（貨號：AR1021博士德公司），內毒素檢測試劑盒（貨號：H178南京建成生物工程研究所）。

1.3? 主要儀器

LEICADNLB2型雙目顯微鏡，德國LEICA公司;Shandon325石蠟切片機，英國Shandon公司。

2 方法

2.1? 動物分組及干預

將SD大鼠隨機分為正常 （normal chow diet，ND）組（10只）和造模組（30只）。造模組采用高脂飲食喂養(yǎng)復制NAFLD大鼠模型，再隨機分為高脂飲食模型（high-fat diet，HFD）組，降脂理肝湯低劑量（4.6 g/kg，JZLGT-Low）組，降脂理肝湯高劑量（9.2 g/kg，JZLGT-High） 組，每組10只。參照前期研究構建模型和進行藥物干預[7]。ND組用普通飼料喂養(yǎng)，HFD組和降脂理肝湯實驗組用高脂飼料喂養(yǎng)，造模后，隨機取正常組和模型組大鼠肝組織進行HE染色，檢測模型復制是否成功。降脂理肝湯組在造模成功后（6周）采用灌胃給藥干預6周，每天1次，ND組和HFD組每天灌胃給予等容量生理鹽水，并且在后6周HFD組和降脂理肝組繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。干預結束后，靜脈麻醉取小腸組織和門靜脈血液待檢測。

2.2? 小腸絨毛染色及高度和寬度的測量

在距盲口5 cm處取大鼠回腸組織，經4%多聚甲醛固定后石蠟包埋，切片機切片，每張厚度為4 μm，放入水育箱內展片，待切片充分展開后用載玻片來撈取組織，在烘干機上徹底烘干后進行HE染色。HE染色后于光鏡下觀察小腸絨毛病理學改變，并通過Image-Plus Pro軟件測量和分析小腸絨毛高度和寬度。小腸絨毛高度測量從絨毛基部到頂部的長度，小腸絨毛寬度共測量3個部位，分別為小腸絨毛基部、中部和尖端，再求3個部位寬度平均值，評價小腸絨毛的寬度。

2.3? 小腸免疫組織化學染色觀察小腸緊密聯(lián)結蛋白Occludin和閉鎖小帶蛋白ZO-1的表達

小腸石蠟切片經常規(guī)脫蠟水化，蛋白酶37 ℃消化10 min，PBS緩沖液沖洗后，兔抗大鼠Occludin抗體或兔抗大鼠ZO-1抗體于4 ℃孵育過夜，PBS緩沖液沖洗后，加入二抗于37 ℃孵育30 min，PBS沖洗。DAB顯色，并控制顯色時間，PBS代替一抗做空白對照。通過Image-Plus Pro軟件測量陽性染色區(qū)域的平均光密度值，平均光密度值與蛋白水平成正相關。

2.4? 血漿內毒素檢測

操作按照內毒素檢測試劑盒說明書進行，首先向預先包被了抗體的酶標孔中加入樣本，再加入生物標記的識別抗原，于37 ℃孵育1 h，PBST洗滌3次，加入親和素HRP，于37 ℃孵育1 h，在450 nm波長下測吸光度值，以標準孔吸光值及其對應濃度繪制出標準曲線，計算各組血漿中內毒素的濃度。

2.5? 統(tǒng)計學分析方法

實驗數(shù)據(jù)通過SPSS 23.00軟件進行處理，計量數(shù)據(jù)采用“x±s”表示，組間比較采用單因素方差分析，每兩組間比較用LSD檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01表示差異有顯著統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1? 降脂理肝湯對NAFLD大鼠小腸絨毛形態(tài)的影響

HE染色結果顯示，HFD組大鼠，小腸絨毛稀疏、排列不整齊、呈倒伏狀并且部分缺失;JZLGT-Hight組，小腸絨毛排列整齊，斷裂較少;JZLGF-Low組小腸絨毛形態(tài)介于兩者之間。與ND組相比，HFD組大鼠小腸絨毛高度顯著降低（P<0.01）;與HFD組相比，JZLGF-Low組小腸絨毛高度差異無統(tǒng)計學意義 （P>0.05）;與HFD組相比，JZLGT-Hight組小腸絨毛高度顯著增加（P<0.01）。此外，各組間小腸絨毛寬度差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖1。

3.2? 降脂理肝湯對NAFLD大鼠小腸緊密聯(lián)結蛋白Occludin和ZO-1蛋白表達水平的影響

與ND組比較，HFD組大鼠小腸組織中連接蛋白Occludin和ZO-1蛋白水平均顯著降低（P<0.05）。與HFD組比較，JZLGF-Low組小腸組織中Occludin和ZO-1蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;與HFD組比較，JZLGT-Hight組大鼠小腸組織中Occludin和ZO-1蛋白水平顯著升高（P<0.05），且ZO-1蛋白水平與ND組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖2和圖3。

3.3? 降脂理肝湯對腸源性內毒素的影響

與ND組比較，HFD組大鼠門靜脈血漿中內毒素水平顯著上升（P<0.01），低劑量和高劑量降脂理肝湯干預后，其血漿中內毒素水平均顯著下降（P<0.01），且低劑量和高劑量降脂理肝湯組內毒素水平與ND組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖4。

4 討論

研究表明，NAFLD發(fā)病伴隨著腸黏膜屏障受損[11-12]，大量研究揭示肝病患者常具有可見的腸黏膜屏障功能受損[13]，改善腸黏膜屏障成為干預NAFLD的重要途徑。前期我們的研究顯示降脂理肝湯能調節(jié)NAFLD大鼠的腸道菌群，并降低腸道酶活性[9]，而腸道菌群對腸黏膜屏障的維持具有重要作用[10]。因此，在本研究中從腸道屏障功能的調控探討降脂理肝湯干預NAFLD的機制。

本研究結果顯示，高脂飲食喂養(yǎng)后，大鼠小腸絨毛高度顯著縮短，絨毛形態(tài)學上表現(xiàn)為稀疏、排列不整齊、呈倒伏狀以及部分缺失;經高劑量降脂理肝湯干預后，大鼠小腸絨毛高度較高脂飲食模型組明顯增加，小腸絨毛呈現(xiàn)排列較整齊、密集、斷裂較少。小腸絨毛的高度和寬度決定小腸絨毛表面積，與小腸的消化吸收功能密切相關。因此，實驗研究常通過測量小腸絨毛高度和寬度來評價斷腸黏膜屏障損傷程度[13]。本研究結果提示高脂飲食能導致大鼠腸黏膜屏障受損，而降脂理肝湯的干預能減少腸黏膜屏障損傷。另外，本研究結果顯示，各組大鼠小腸絨毛寬度均無明顯改變，提示造模對小腸絨毛寬度的影響不大，這可能與高脂飼料喂養(yǎng)時間較短僅為12周有關。同樣，也有研究報道，高脂持續(xù)喂養(yǎng)16周后，小腸絨毛寬度較12周要明顯縮短[13]。

本研究結果顯示，與正常組相比，高脂飲食模型組大鼠腸道連接蛋白Occludin和ZO-1蛋白水平明顯降低，提示高脂飲食喂養(yǎng)誘導的腸黏膜屏障功能受損可能與Occludin和ZO-1蛋白有關，這一發(fā)現(xiàn)與之前的研究結果一致[14]。高劑量的降脂理肝湯干預能顯著增加大鼠腸道Occludin和ZO-1蛋白水平。這提示降脂理肝湯可能通過調控腸道Occludin蛋白和ZO-1蛋白水平減少腸黏膜屏障損傷。

此外，我們前期的研究揭示，高脂飲食喂養(yǎng)可誘導大鼠腸道大腸桿菌數(shù)量增加[9]，而大腸桿菌數(shù)量增加進而導致內毒素增加和蓄積。因此，本文檢測發(fā)現(xiàn)在NAFLD大鼠門靜脈血漿中內毒素水平顯著上升，而經降脂理肝湯高劑量和低劑量干預后，血漿中內毒素水平均顯著下降，這提示減少腸黏膜屏障損傷降低血漿中的內毒素水平可能是降脂理肝湯能顯著改善NAFLD的重要原因。

綜上所述，高脂飲食喂養(yǎng)誘導的NAFLD可能與高脂飲食導致的小腸絨毛結構以腸黏膜屏障受損有關。降脂理肝湯干預NAFLD的機制可能與修復NAFLD大鼠腸黏膜屏障，降低血漿中內毒素水平有關。本研究為降脂理肝湯的臨床應用提供了進一步的實驗依據(jù)。

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