加減養心通脈方干預對冠心病血瘀證亞型患者CTNNB1基因表達的影響及療效觀察

向忠軍　王建國　簡維雄　吳航宇　張月娟　黃海波　陳伶利　李杰

〔摘要〕 目的 探討加減養心通脈方對冠心病血瘀證亞型CTNNB1基因表達及臨床療效觀察。方法 選擇符合冠心病血瘀證診斷標準患者23例，按胸痹血瘀證亞型診斷標準分成冠心病氣虛血瘀證組7例、氣滯血瘀證組8例和痰濁血瘀證組8例，進行為期1個月的加減養心通脈方的治療，采用實時熒光定量PCR儀檢測服藥前后CTNNB1基因表達的變化，觀察服藥前后血脂血糖臨床療效的變化。結果 治療后不同證型的患者相比治療前CTNNB1基因表達改變不明顯，差異無統計學意義（P>0.05）;治療后相比治療前血糖值均有所下降，氣虛血瘀組治療前后血糖值改變差異有統計學意義（P<0.05）;不同證型的患者中TC、TG在治療后，比治療前值均有所下降，3組治療前后TC值改變差異有統計學意義（P<0.05）;氣滯血瘀證組、氣虛血瘀證組TG改變有統計學意義（P<0.05）;不同證型患者的HDL、LDLC值在治療后相比治療前均有所下降，但差異無統計學意義（P>0.05）。結論 加減養心通脈方對冠心病血瘀證3個亞型（氣虛、氣滯、痰濁）CTNNB1基因表達無明顯的調控作用，以方測證，說明CTNNB1基因的表達可能不是冠心病血瘀證的發病機制之一。但該方可以明顯改善冠心病血瘀證亞型血糖及脂類異常，有較好的降脂和降糖作用。

〔關鍵詞〕 養心通脈方;冠心病;血瘀證亞型;CTNNB1;血脂;血糖

〔中圖分類號〕R256.2? ? ? ?〔文獻標志碼〕B? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.09.020

Effects of Modified Yangxin Tongmai Formula on CTNNB1 Gene Expression in Subtype of Blood Stasis Syndrome in Patients with Coronary Heart Disease and Observation on Its Clinical Efficacy

XIANG Zhongjun1， WANG Jianguo2， JIAN Weixiong2， WU Hangyu2， ZHANG Yuejuan2，

HUANG Haibo3， CHEN Lingli2*， LI Jie2*

（1. Changsha Medical University， Changsha， Hunan 410219， China; 2. Hunan University of Chinese Medicine，

Changsha， Hunan 410208， China; 3. Tongren Polytechnic College， Tongren， Guizhou 554300， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the expression of Modified Yangxin Tongmai Formula on CTNNB1 gene in subtype of blood stasis syndrome in coronary heart disease （CHD） and to observe its clinical effects. Methods A total of 23 CHD cases with blood stasis syndrome met the diagnostic criteria were selected， and they were divided into a group of Qi stagnation and blood stasis syndrome of CHD （n=8）， a group of phlegm-turbidity and blood stasis syndrome of CHD （n=8）， and a group of Qi deficiency and blood stasis syndrome of CHD （n=7）， according to the subtype diagnostic criteria of chest Bi with blood stasis syndrome. They were treated with Modified Yangxin Tongmai Formula for 1 month. Expression change of gene CTNNB1 was detected by real-time qPCR before and after taking medicine. Changes of clinical efficacy in blood lipid and blood glucose were observed before and after taking medicine. Results After the treatment， the expression changes of gene CTNNB1 before the treatment were not significant and there was no statistical significance in the patients with different syndrome types （P>0.05）. However， after the treatment， the blood glucose levels were decreased compared to those before the treatment， and the change of blood glucose in the Qi deficiency and blood stasis group was statistically significant before and after the treatment （P<0.05）. After the treatment， TC and TG in the patients with different syndrome types were decreased compared to those before the treatment. The changes of TC before and after the treatment in the 3 groups were statistically significant （P<0.05）; The changes of TG in the group of Qi stagnation and blood stasis syndrome and the group of Qi deficiency and blood stasis syndrome were statistically significant （P<0.05）. After the treatment， HDL and LDLC in the patients with different syndrome types were decreased， but there was no statistical significance （P>0.05）. Conclusion There was no obvious regulation effect of Modified Yangxin Tongmai Formula on the expression of CTNNB1 gene in the 3 subtypes of blood stasis syndrome of CHD （Qi deficiency， Qi stagnation and phlegm-turbidity）， which suggests that the expression of CTNNB1 gene may not be one of the pathogenesis of blood stasis syndrome of CHD， through testing syndrome by formula. But it can obviously alleviate the abnormal level of blood lipid and blood glucose in subtypes of blood stasis syndrome of CHD， and also has good effects on reducing glucose and lipid.

〔Keywords〕 Yangxin Tongmai Formula; coronary heart disease; subtype of blood stasis syndrome; CTNNB1; blood lipid; blood glucose

近年來，冠心病或缺血性心臟病[1]作為人類多發嚴重性疾病之一，其發病率、死亡率都呈上升趨勢。目前，全球最主要的疾病死亡原因之一是冠心病[2]，花費巨大，且對其病理生理機制還未完全弄清。冠心病也是一種多基因遺傳性疾病，課題組前期研究發現冠心病血瘀證是多基因表達異常出現的病理狀態的反應，是具有遺傳特性的多基因證[3-5]。中醫藥確有療效的治療冠心病的方藥較多。因此，在更深層次上通過“以方測證”揭示冠心病（血瘀證）在遺傳學方面的本質，將有利于對冠心病血瘀證臨床診斷和治療。故本研究探討以加減養心通脈方治療冠心病血瘀證亞型，臨床療效及其調節CTNNB1基因表達的作用影響。

1 資料與方法

1.1? 一般資料

選擇冠心病血瘀證患者156例，分別來自長沙縣安沙鎮鼎功橋衛生院、長沙市天心區黑石鋪肉聯廠職工醫院、湘潭市建設社區、株洲市和益陽市冠心病流調義診收集的病例。嚴格按診斷、納入和剔除標準條件，共收入23例血樣為實驗組，各組資料： 冠心病氣虛血瘀證7例（男4例，女3例），年齡（75.67±1.53）歲;冠心病氣滯血瘀證8例（男3例;女5例），年齡（70.12±5.61）歲;冠心病痰濁血瘀證8例（男4例，女4例），年齡（72.67±4.58）歲。組間年齡、性別比較差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。中藥治療后剔除因各種原因未按時服中藥5例，共收集18例血樣（氣滯血瘀證6例、痰濁血瘀證6例、氣虛血瘀證6例），其中冠心病氣虛血瘀證組6例（男3例，女3例），年齡（62.00±8.27）歲;冠心病氣滯血瘀證組6例（男2例;女4例），年齡（67.50±7.61）歲;冠心病痰濁血瘀證組6例（男2例;女4例），年齡（64.00±10.75）歲。經比較組間年齡、性別比較差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2? 病例選擇

1.2.1? 冠心病診斷標準? 參考中華醫學會心血管病分學會制定的《急性ST段抬高型心肌梗死的診斷與治療指南》[6]及中華人民共和國衛生部制定的《冠狀動脈粥樣硬化性心臟病診斷標準》（2010-4-29）。

1.2.2? 胸痹血瘀證亞型診斷標準? 參照《中醫證候辨治規范》辨證分型標準[7]。

（1）氣虛血瘀證 主癥：胸部隱痛，活動后加重;兼癥：心悸，氣短，面色黧黑，口唇、爪甲發青或青紫;舌象：舌質紫暗、瘀點、瘀斑、舌苔淡白、舌下絡脈曲張;脈象：脈細或虛大無力或脈結代或弦細澀。主癥加兼癥、舌脈各1項，即可診斷。

（2）氣滯血瘀證 主癥：胸脹及刺痛，隨情志異常加重;兼癥：胸痛徹背，痛及左肩臂等部，面色黧黑，口唇、爪甲青紫或發青;舌象：舌質紫暗，瘀點，瘀斑，舌下絡脈曲張，舌淡潤或胖大而有齒痕;脈象： 結代或弦沉遲或脈細澀。主癥、舌脈各1項，加兼癥2項以上，即可診斷。

（3）痰濁血瘀證 主癥：胸悶痛，痰多;兼癥： 面色黧黑，口唇、爪甲青紫或發青，咳嗽;舌象：舌質紫暗，瘀點，瘀斑，舌下絡脈曲張，舌苔白潤或滑;脈象： 結代或脈沉澀或脈弦滑澀。主癥加舌脈各1項、兼癥2項以上，即可診斷。

1.2.3? 納入標準? （1）符合中西醫診斷標準：必須同時滿足西醫冠心病的診斷標準和中醫胸痹血瘀證及亞型診斷標準;（2）非血緣冠心病血瘀證，是指所有的納入病例患者之間都沒有血緣關系;（3）完善的個人信息和臨床基本相關指標：包括姓名、性別、年齡、病史、主訴、臨床表現等完整的臨床流調表格信息。

1.2.4? 排除標準? （1）下列各種心臟病任何一種：甲狀腺機能亢進性、肺源性心肌病及風濕性、貧血性心臟病;（2）各類惡性腫瘤、嚴重肝腎功能損害疾病、嚴重高血壓病（中度以上及單純收縮期高血壓）、甲狀腺功能異常性疾病患者;（3）肝病、梅毒及肺結核等具有傳染病及精神異常患者;（4）合并其他嚴重性疾病;（5）資料不全者;（6）受檢者依從性差，或不能完成全部臨床檢測。

1.2.5? 剔除標準? （1）入選后缺乏血壓、升高、體質量等病史資料、生化檢查指標（血脂、血糖）等重要記錄，無法進行分析者;（2）血樣收集后，標號模糊法確認者或無血樣者;（3）誤入病例：納入后發現不符合診斷標準或排除標準;（4）沒有按時服中藥或服用其他中西藥者。

1.3? 治療方法

對納入實驗的冠心病血瘀證亞型按辨證論治的原則進行加減養心通脈方中藥治療;（1）氣滯血瘀證：人參10 g，丹參15 g，枳實10 g，澤瀉10 g，桂枝10 g，香附10 g，延胡索10 g。30劑。（2）氣虛血瘀證：人參20 g，丹參15 g，枳實10 g，澤瀉10 g，桂枝10 g，黃芪20 g，白術10 g。30劑。（3）痰濁血瘀證：人參10 g，丹參15 g，枳實10 g，澤瀉10 g，桂枝10 g，法半夏9 g，陳皮10 g，瓜蔞皮10 g，薤白10 g。30劑。中藥煎服法：每日1劑，分2次服，人參另燉，飯前半小時服，臨床觀察1個月。飲食禁忌事項：以清淡飲食為主，禁食肥甘厚膩及冷食，注意勞逸結合。

1.4? 檢測指標

1.4.1? 引物設計? 基因序列在NCBI 數據庫中查找，設計Real-time PCR引物[8]，如下表所示。

1.4.2? 基因檢測方法? 采用實時熒光定量PCR儀（Life Technologies公司）檢測樣品。提取血液RNA，逆轉錄cDNA，進行Real-time PCR檢測，配置反應體系如下：PCR forward primer（2 ？滋M）2 ？滋L;PCR reverse primer（2 ？滋M） 2 ？滋L;2X All-in-One qPCR Mix 10 ？滋L;Template 2 ？滋L;50X Rox Reference Dye 0.4 ？滋L;ddH20 3.6 ？滋L;Total 20 ？滋L;反應條件設定為：預變性：95 ℃ 10 min，1個循環;擴增反應：95 ℃ 10 S，62 ℃ 20 S，72 ℃ 15 S，45個循環;繪制融解曲線：95 ℃ 10 S，25 ℃ 30 S。每個樣品重復3次。數據分析采用2-ΔCt法，計算CTNNB1基因mRNA轉錄水平的差異。

1.4.3? 血脂、血糖檢測? 中藥治療前后采血前禁食12 h，于早晨空腹臥位取上肢靜脈血10 mL。其中2 mL用EDTA-K2抗凝管收集，用于實驗基因檢測。用無添加劑促凝管收集剩下8 mL血樣，即送湖南中醫藥大學第一附屬醫院檢驗生化科測定血脂指標（其中①血清總膽固醇（total cholesterol， TC）測定：高效液相色譜法;②血清甘油三酯（triglyceride， TG）測定：酶法測定法;③血清高密度脂蛋白膽固醇（high density lipid-cholesterol， HDL-C）測定：勻相測定法;④血清低密度脂蛋白膽固醇（low density lipid-cholesterol， LDL-C）測定：勻相測定法）;血糖用血糖儀器測定。

1.5? 統計學方法

采用SPSS 18.0統計軟件，計量資料先進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，滿足條件者對比采用配對t檢驗;未滿足要求者兩樣本均數比較采用Wilcoxon秩和檢驗[8]。

2 結果

2.1? 冠心病血瘀證不同亞型患者的血糖、TC治療前后的比較

冠心病血瘀證不同亞型患者治療前后比較，治療后的血糖值均有所下降，其中氣虛血瘀組前后血糖值改變有統計學意義（P<0.05）。3組證型患者的TC值在治療后較治療前均有所下降（P<0.05）。各組之間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.2? 冠心病血瘀證不同亞型患者TG、HDL-C、LDL-C治療前后比較

冠心病血瘀證不同亞型患者在治療前后比較，治療后的TG值均有所下降，其中氣滯血瘀證組、氣虛血瘀組前后TG值改變差異有統計學意義（P<0.05）;3組證型患者的HDL-C、LDL-C值在治療后較治療前均有所下降，但差異無統計學意義（P>0.05）。各組之間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。

2.3? 冠心病血瘀證不同亞型患者治療前后CTNNB1基因表達實時熒光定量檢測比較

采用實時熒光定量儀（Life Technologies公司）檢測樣品，每個樣品重復3次。冠心病血瘀證不同亞型患者治療前后基因表達改變不明顯，差異無統計學意義（P>0.05）。但氣虛血瘀證組有所升高。見圖1和表4。

3 討論

冠心病是危害人類生命健康的多發嚴重性疾病之一，其中不合理膳食、身體活動不足或遺傳因素導致的高血脂癥是冠心病發病的危險因素之一;研究發現血管管腔的直徑大小和血管內皮的彈性及厚薄與過多的TC、TG沉積在血管內皮內膜密切相關，影響心肌的供血和供氧而造成心臟的相關疾病[9-10]。課題組前期研究已發現冠心病血瘀證發病機制及與脂代謝紊亂和血糖過高有密切聯系[11-17]。

中醫“胸痹”之病的臨床表現同現代醫學的冠心病非常相似，傳統中醫理論認為“胸痹”血瘀證病位以“心”為主，但可涉及肝、脾、肺、腎、胃等臟腑，心主血脈、肝藏血，主疏泄、脾胃為氣血生化之源，肺主治節、腎為全身陰陽之根本。故而胸痹之病，非獨心也，五臟皆能致胸痹也。胸痹的主要病機為“心脈痹阻”。臨床流行病學研究顯示，胸痹（冠心病）血瘀證在血瘀證亞型以氣滯、氣虛、痰濁、陽虛等證最為多見[18]。本次研究發現冠心病血瘀證不同亞型患者通過加減養心通脈方治療后血糖值均有所下降，氣虛血瘀組治療前后血糖值改變差異有統計學意義（P<0.05）;不同證型的患者中TC、TG在治療后，比治療前值均有所下降，3組治療前后TC值改變差異有統計學意義（P<0.05）;氣滯血瘀證組TG改變差異有統計學意義（P<0.05）;不同證型患者的HDL-C、LDL-C值在治療后相比治療前均有所下降。

CTNNB1基因定位于人染色體3p21，由16個外顯子組成，全長23.2kb，能編碼一種β-catenin蛋白（β-連環蛋白）。β-catenin蛋白為細胞粘附結構分子，是一種轉錄作用中的活化因子。CTNNB1基因突變會導致β-catenin蛋白異常表達，從而激活Wnt/β-catenin信號轉導通路，導致腫瘤的發生。所以CTNNB1基因與腫瘤的發生、發展及預后密切相關[19]，但其與冠心病的關系研究較少。本次研究發現冠心病血瘀證不同亞型患者通過加減養心通脈方治療后相比治療前CTNNB1基因表達改變不明顯，無統計學意義。

加減養心通脈方是在經典名方養心通脈片[20-21]基礎上根據不同血瘀證亞型組方而成，其中氣滯血瘀證加香附、延胡索以增強行氣活血化瘀;氣虛血瘀證加黃芪、白術以增強補氣活血化瘀;痰濁血瘀證加半夏、薤白、瓜蔞皮以增強化痰寬胸理氣。方中丹參活血化瘀，祛瘀止痛，除煩安神;人參補已虛之元氣，扶養心氣，二者同為君藥;枳實化痰除滿，破氣消積，理氣行血，為臣藥;澤瀉利水滲濕，通利泄熱，為佐藥;桂枝助陽化氣，溫經通脈，為佐使藥。方中配伍可謂主次有別，適合病機，本項目在中醫的化痰祛瘀、行氣活血、補氣活血法指導下，通過組方嚴謹、安全可靠、作用及機制明確的有效配伍系列復方，發現加減養心通脈方對冠心病血瘀證3個亞型（氣虛、氣滯、痰濁）CTNNB1基因表達無明顯的調控作用，以方測證，說明CTNNB1基因的表達可能不是冠心病血瘀證的發病機制之一，但該方可以明顯改善冠心病血瘀證亞型血糖及脂類異常，有很好的降脂和降糖作用。由于本次病例數收集有限、疾病的發展不是一成不變的及服藥時間較短，因此在今后的研究及臨床過程中將繼續擴大試驗樣本數，進一步探討中藥在辨證論治的基礎上加減變化取得較好臨床療效和對基因表達的作用機制，為冠心病及不同亞型的防治提供臨床指導。

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