不同地域來源乳粉及乳制品中乳鐵蛋白含量分析

孫姍姍 羅嬌依 李剛 梁瑞強 曹進 陳啟 劉英華

摘?要：目的：考察不同地域來源的乳產品中乳鐵蛋白的含量，為指導生產企業和消費者合理選擇乳制品提供科學依據，也為國家市場監管部門制定乳制品中乳鐵蛋白最低限量國家標準提供數據基礎。方法：采用質譜絕對定量方法對103批次國內外乳原料及乳制品中乳鐵蛋白含量進行分析，通過合成特異性標準多肽，進行內標法定量。結果：國內外乳原料、乳粉和液態乳中乳鐵蛋白含量平均值分別為63.0、54.6、6.4mg/100g。中國國產乳原料、乳粉和液態乳中乳鐵蛋白含量平均值分別為67.8、58.6、8.1mg/100g，均高于本次分析國內外樣本量的平均值。另外，本研究還發現了不同地域來源的同類型乳產品中乳鐵蛋白含量相差懸殊，同品牌的相似產品也存在較大差異。結論：不同地域來源乳粉及乳制品中乳鐵蛋白含量差異較大，生產企業及消費者應合理選擇乳制品攝入，未來，市場監管部門應盡快制定乳粉產品中乳鐵蛋白最低限量的國家新標準。

關鍵詞：乳鐵蛋白;乳粉;乳粉原料;液態乳;含量分布

乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）是一種具有高生物活性的非血紅素鐵結合糖蛋白，它來源于牛乳、人乳、山羊乳和駱駝乳等原料乳中，在初乳中的含量豐富，常乳中可經過加工分離得到，高純產品可作為高價值的營養補充劑[1]。由于LF多種多樣的生物學功能，其可作為藥物和營養品在臨床上使用，具有良好的輔助治療協同作用[2]。2010年之前，我國對LF的研究基本處于空白，隨著國家衛健委于2013年11月發布第11號公告[3]擴大LF使用范圍至嬰幼兒配方食品，向乳粉、乳飲品中添加LF的產品迅速占領國內市場。雖然我國東北、西北和華北草原帶以及膠東半島屬于國際公認的溫帶季風氣候優質奶源帶[4]，但由于LF提取技術的限制[5]，國內使用的LF多數依賴于進口。這不僅導致乳粉產品價格的波動，更使我國消費者對國產乳制品的質量產生質疑。為了更準確更深入地探究目前我國市場上流通的乳粉、乳制品以及原料粉中LF的含量真實情況，本研究針對以上幾個研究對象分析LF含量及分布特征，即LF含量與其奶源產地的關聯性。

目前，對于LF的分析測定方法較多，有分光光度法[6]、高效液相色譜法[7-9]、酶聯免疫吸附法[10-12]、毛細管電泳法[13-15]、表面等離共振技術[16-17]等。但本研究的分析樣本龐大，需要保證分析定量的準確性與實驗操作的便捷性，故選擇高效液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS/MS）。前處理簡單進行溶解后，使用少量溶解液進行酶解后即可采用質譜分析，質譜法測定大幅度降低了假陽性率的發生，并且內標法確保了定量的準確性。

1?材料與方法

1.1?儀器與試劑

Waters UPLC-Vevo TQ-S液相色譜串聯三重四級桿質譜儀、Masslynx質譜軟件，美國沃特世科技有限公司;G2渦旋振蕩器，美國Scientific Industries公司;B-491恒溫水浴鍋，瑞士BUCHI公司;Seven Easy臺式酸度計，瑞士梅特勒公司;賀力氏21離心機，美國賽默飛世爾科技有限公司;ZWY-240恒溫搖床，上海智城分析儀器制造有限公司;ACQUITY UPLC HSS T3 C18親水柱（2.1mm×100mm，1.8μm），美國WATERS公司。

乳鐵蛋白特異肽段：序列為VDSALYLGSR，分子量1 080.22Da，純度≥99%。乳鐵蛋白同位素特異肽段：序列為VDSAL*YLGSR，L*（13C6，15N）同位素標記亮氨酸，分子量1 087.22Da，純度≥95%。乳鐵蛋白同位素內標肽段：序列為ALGFLRIPSKVDSAL*YLGSRYLTTLKNLRE，L*（13C6，15N）同位素標記亮氨酸，分子量3 403.02Da，純度≥95%。以上所有合成肽段均由上海吉爾生化有限公司提供。甲酸、乙腈（質譜級），美國賽默飛世爾科技公司;氯化鈉（分析純），國藥集團化學試劑有限公司;三羥甲基氨基甲烷（分析純），美國Sigma Aldrich公司;胰蛋白酶（質譜級），美國賽默飛世爾科技公司;實驗用水均由純水機（Milli-Q，Integral3）制備，電阻率為18.2MΩ·cm。本研究使用的乳粉樣品采購于北京地區物美連鎖超市、山姆會員店等正規商店;乳原料均采購于淘寶網絡平臺以及阿里巴巴采購網絡平臺。

1.2?乳鐵蛋白的檢測

1.2.1?樣品處理?取1.000 0g乳粉樣品，使用50mmol/L Tris-HCl（pH8.0）緩沖溶液溶解，充分振蕩，60℃水浴1h，冷至室溫并定容至50mL。取200μL溶解樣品，加入200μL 0.1%Rapigest SF進行加熱10min，80℃。冷卻后加入50μL 2μmol/L乳鐵蛋白同位素內標肽段（ALGFLRIPSKVDSAL*YLGSRYLTTLKNLRE）混勻，再向混合樣品中添加10μg的胰蛋白酶，在37℃下溫浴，過夜酶解（16～24h）。次日使用2μL10%甲酸溶液停止酶解反應，加水定容至1mL，15℃下10 000r/min離心10min，取上清液作為樣品待測液。

1.2.2?分析檢測條件?色譜條件：WATERS ACQUITY UPLC HSS T3 C18親水柱（2.1mm×100mm，1.8μm）;流動相：A為0.1%甲酸-水溶液，B為乙腈;梯度洗脫：0～0.5min，5%B、0.5～4.5min，5%B～50%B、4.5～4.6min，50%B～75%B、4.6～6.6min，75%B、6.6～6.7min，75%B～5%B、6.7～9.0min，5%B;流速：0.3mL/min;柱溫：30℃;進樣量：5μL。

質譜條件：離子化模式：電噴霧正離子模式（ESI+）;掃描模式：多離子反應監測（MRM）;毛細管電壓：3.5kV;錐孔電壓：10V;離子源溫度：150℃;偏轉電壓：50V;錐孔氣流量：150L/h;脫溶劑氣溫度：500℃;脫溶劑氣流量：800L/h;其他質譜參數見表1。乳鐵蛋白特異肽段VDSALYLGSR配制成的定量標曲線性范圍為1.25～100nmol/L，向各標準溶液中添加的同位素特異肽段VDSAL*YLGSR的濃度為100nmol/L。圖1分別為乳鐵蛋白特異肽段和同位素特異肽段的質譜提取離子流圖，在3.40min兩種肽段可以被徹底的分離和提取，該液相方法洗脫方法可以滿足質譜定量的峰形要求。

2?結果與分析

2.1?乳粉原料國內外含量分析

大宗乳粉原料在食品加工行業內應用廣泛，可用于制作奶味糖果、含乳飲料、咖啡伴侶、奶味零食、自制火鍋底料等，由于被當作添加的食品輔料，其營養成分從未被關注過，但在終產品的包裝上仍夸大含乳成分的營養價值。目前，在市面上普遍進口乳粉原料的產地集中在新西蘭和波蘭，從表2、圖2可看出，乳業大國——新西蘭（恒天然）的乳粉原料中LF含量從42.8～72.3mg/100g不等，差異明顯，且有50%的檢驗批次含量都未達到總體分析的平均值63.0mg/100g。波蘭的乳原料聲稱為乳清粉，但最終測定含量僅為44.0mg/100g。反之，觀察中國產出的乳粉原料覆蓋東北、山東、江蘇、內蒙古幾個產奶大省，除內蒙古外，其余原料乳粉中LF含量豐富，均優于國外同類產品，并高于本次分析總樣本的平均值。

2.2?乳制品國內外含量分析

中國國內的乳粉和液體乳市場經本次調查后的檢驗結果較為理想，涉及到10個國產大中型企業品牌的產品，乳粉產品主要集中在嬰幼兒配方乳粉和不同類型的營養乳粉，液體乳覆蓋了全類型的乳飲品，兒童奶、早餐奶、復合營養奶、無乳糖奶、強化營養蛋白奶等。結果反映出了相關原料的2個問題，一是不同廠商的嬰幼兒配方乳粉中LF含量差異較明顯，品牌10和品牌1的一段嬰幼兒乳粉相差了12倍之多，圖3中也明顯看出品牌10的LF含量遠高于其余6個品牌。二是企業內部的不同類型乳粉產品的LF含量也差異懸殊，如表3中品牌1、7、9的產品都有此類情況出現。這可能是不同企業選購的乳粉基粉來源不同，也或許是不同類型產品針對的消費人群不同，采取了不同營養配方的調配比例。但縱觀液體乳的檢測值來看，不同品牌以及品牌內部的不同類型產品中LF含量比較均衡（表4、圖4），波動范圍是6.1～9.6mg/100g。我國的成品乳粉與液態乳中LF含量的比例是7～8倍，平均值分別是58.6、8.1mg/100g。

將中國國內市場的數據與國外產品數據進行橫向比較后發現，對于調制乳粉而言，本次樣本量的LF平均值為54.6mg/100g，中國產乳粉的營養質量位居國際水平的第三名且含量高于平均值。但與前兩名瑞士和新西蘭的乳粉產品的LF含量還是有一定的差距（圖5）。愛爾蘭、荷蘭、丹麥乳粉產品的總體情況較低，低于平均值50%～77%。國外市場與我國國內市場出現的現象相似，同一國家的產品LF含量差異大，例如新西蘭、愛爾蘭、荷蘭的產品（表5）。再觀測液體乳產品情況，也與我國市場大致相同，產品間、產區間波動不大，LF含量平均值為6.4mg/100g（表6）。本次分析的產品產地中78%的國家都高于平均值，中國的液體乳產品營養質量較高，位居第二（圖6）。新西蘭、韓國的液體乳產品間LF的含量差異較明顯，并且含量較低。

3?討論

從本次分析結果來看，國際公認的優質奶源地與高LF含量的結果有所出入，不排除以下可能性：產品批次間存在差異，并非長期使用固定奶源;不同品牌的生產工藝對營養性蛋白有影響;劣質過期或經抽提乳粉經過重新包裝，再次銷售;不同地域奶源質量批次間差異較大等。目前，國家食品標準GB 14880—2012食品營養強化劑使用標準[18]中規定調制乳、風味發酵乳、含乳飲料中的LF的含量不得高于100mg/100g。以此標準來評判本次分析樣本質量，國產乳粉、液體乳以及大宗乳粉原料均為合格產品。但從另一方面考慮，此標準并未定義LF的最低含量，由此引起的食品營養成分缺失、食品真實性問題、乳粉制造商的經濟成本與宣傳的產品營養價值不一致等問題日漸凸顯。本次重點分析調制粉的產品類型為嬰幼兒配方乳粉，也可觀察出國內外產品均出現了LF含量高低分布不均的趨勢。如國內嬰幼兒配方乳粉中LF含量最低值為品牌1（7.7mg/100g），最高值為品牌10（95.0mg/100g）;國外最低值產于愛爾蘭（12.7mg/100g），最高值產于瑞士（90.0mg/100g）。優劣產品間的LF含量有9～10倍的差距。

另一方面，規定及制定LF最低限量值，需結合參考人乳和牛乳中該成分的正常含量和兒童、成人的日常營養需求。據部分文獻報道，分娩后3個月內母乳中LF含量大致在220～245mg/100mL，4個月后降至為102mg/100mL[19];牛初乳中的LF含量一般為150mg/100mL，牛常乳的含量則僅有10mg/100mL[20]。所以無論是人乳和牛乳的初乳中均含有高濃度的LF，而成熟乳中的乳糖和脂肪含量升高導致LF含量下降。因此，建議對嬰幼兒配方乳粉的LF補充量按照不同哺乳時期進行限定，分階段制定配方乳粉中的補充含量范圍。從本次分析的情況來看，1段嬰幼兒配方乳粉中LF含量的平均值只有國家標準要求上限值的一半，其中只有1批次進口荷蘭乳粉品牌聲稱添加較高含量的LF，測定值為500.3mg/100g，與其標示值相符（數據未在列表中，避免使平均值偏離）。

4?結論

由于營養活性的不可替代性，LF在當今乃至未來的乳制品市場上會持續備受關注。從本次研究結論可以得出與普通消費者印象中不相符的結果，并非全部進口原料乳粉、調制乳粉以及液態乳的營養成分含量高于國產產品。因為我國也擁有極其優質的奶源帶區域，生產、運輸、加工成本遠低于國外進口產品，其LF含量經分析位于全球前列，應成為我國消費者的首選。相關市場監管部門應進行調研后，制定出LF在不同類型產品中的最低限量，既能保障乳制品基本營養成分的缺失、造假問題，也可以維護市場同類產品價格懸殊的亂象。

參考文獻

[1]楊燕婷.乳鐵蛋白在食品領域的應用專利技術綜述[J].現代食品，2018（12）：25-29.

[2]Drago-Serrano M E，Campos-Rodriguez R，Carrero J C，et al.Lactoferrin：balancing ups and downs of inflammation due to microbial infections[J].Int J Mol Sci，2017，18（3）：501.

[3]關于批準抗壞血酸鈉等8種食品添加劑擴大使用范圍用量的公告（2013年 第11號）.中華人民共和國國家衛生健康委員會.http：//www.nhc.gov.cn/sps/s7890/201402/bfe 217ca72d1412cb842f4a2b9cfa15f.shtml[EB/OL].

[4]國務院辦公廳發布《關于推進奶業振興 保障乳品質量安全的意見》（節選）[J].輕工標準與質量，2018，159（3）：5-21.

[5]涂茂林，周英爽，樊鳳嬌，等.乳鐵蛋白新型工業化制備技術研究[A].中國食品科學技術學會第十二屆年會暨第八屆中美食品業高層論壇論文摘要集[C].2015.

[6]夏明，應鐵進.原子吸收分光光度法間接測定奶粉中的乳鐵蛋白含量[J].藥物分析雜志，2011，31（1）：173-175.

[7]程靜，高學軍，劉曉飛，等.反相高效液相色譜法檢測牛初乳乳鐵蛋白的方法研究[J].乳業科學與技術，2009，32（1）：30-34.

[8]任璐，龔廣予，杭鋒，等.采用HPLC測定乳鐵蛋白質量濃度的方法研究[J].中國乳品工業，2009，37（2）：49-52.

[9]夏明，應鐵進.高效液相色譜檢測乳制品中的乳鐵蛋白含量[J].食品科學，2010，31（2）：165-167.

[10]盧蓉蓉，孫震，許時嬰，等.乳鐵蛋白的免疫化學分析法-酶聯免疫吸附測定法[J].食品科學，2002，23（4）：102-104.

[11]麥巧冰，陳杰，李枘枝.酶聯免疫法檢測配方奶粉中乳鐵蛋白含量研究——以進口嬰幼兒配方奶粉為例[J].現代商貿工業，2016，37（31）：180-181.

[12]吳春香，劉志楠，趙源，等.酶聯免疫吸附法快速檢測嬰兒配方奶粉中乳鐵蛋白含量[J].食品安全質量檢測學報，2018，9（4）：803-807.

[13]趙凌國，尤俊，梁肇海，等.陽離子交換色譜及動態涂層毛細管電泳法檢測牛奶中乳鐵蛋白含量[J].分析測試學報，2014，33（3）：339-343.

[14]顧媛，程利花，姜金斗，等.毛細管電泳法檢測嬰幼兒奶粉中乳鐵蛋白的質量分數[J].中國乳品工業，2011，39（5）：54-56.

[15]劉宇，陳偉，史玉東，等.高效毛細管電泳法快速測定乳鐵蛋白原料的純度[J].中國乳品工業，2016，44（2）：43-46.

[16]涂茂林，楊戩，劉猛，等.乳鐵蛋白檢測方法研究進展[J].乳業科學與技術，2015，38（1）：32-37.

[17]劉梯樓，孫雙姣，張運良.免疫共振散射光譜法測定牛初乳粉中乳鐵蛋白含量[J].江蘇農業科學，2012，40（11）：329-330.

[18]GB 14880—2012，食品安全國家標準.食品營養強化劑使用標準[S].

[19]劉彥品，董學艷，姜鐵民，等.母乳中乳鐵蛋白含量及影響因素研究[J].中國食品添加劑，2018，174（8）：70-74.

[20]包曉宇，陳美霞，王加啟，等.牛乳中活性蛋白生物學功能研究進展[J].食品科學，2017，38（19）：315-324.

（責任編輯?唐建敏）