梭梭同化枝及其葉苞狀蟲癭的轉錄組差異表達分析

滿玲娟 張樺 姚正培 宗興風 李志強

摘要：【目的】分析梭梭同化枝及其葉苞狀蟲癭的轉錄組差異，為揭示梭梭葉苞狀蟲癭形成的分子機制及梭梭害蟲防治提供理論參考。【方法】以梭梭同化枝及其葉苞狀蟲癭為材料，利用Illumina HiSeq 2000高通量測序平臺對其進行轉錄組測序及差異表達基因分析，并通過測定可溶性糖和葉綠素含量驗證分析結果。【結果】轉錄組測序共獲得159147條Unigenes，平均長度為551 bp，N50為752 bp，在Swissport、GO、Pfam、NR、NT、KOG/COG和KEGG等數據庫均被注釋的Unigenes有8521條（5.35%），至少在1個數據庫注釋的Unigenes有66714條（41.91%），共有49066條Unigenes（30.83%）與物種匹配成功。以q value<0.005且|log2FoldChange|>1為條件，共篩選出3444條差異表達的Unigenes，其中，有1299條上調表達，2145條下調表達。與梭梭同化枝相比，梭梭葉苞狀蟲癭上調表達差異基因富集在代謝過程、有機物代謝過程、催化活性、碳代謝作用和核糖體代謝等通路，下調表達基因富集在細胞、細胞組成、胞內細胞成分和細胞器、嘧啶代謝、細胞周期、DNA復制、光合作用及苯丙烷和類黃酮生物合成等過程。不同發育期梭梭葉苞狀蟲癭中的可溶性糖含量高于梭梭同化枝，而葉綠素含量均低于梭梭同化枝，進一步驗證梭梭葉苞狀蟲癭的糖代謝相關基因上調表達而光合作用相關基因下調表達的轉錄組分析結果。【結論】梭梭葉苞狀蟲癭中核糖體數量增加，翻譯過程加快，代謝水平提高，糖代謝產物積累，但其光合作用降低，伸長與生長減慢，推測其通過吸收利用同化枝的養分以滿足自身需求。

關鍵詞： 梭梭;葉苞狀蟲癭;轉錄組分析;可溶性糖含量;葉綠素含量

中圖分類號： S792.99? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）08-1657-08

Differential expression analysis of transcriptome of assimilating branches and leafy-bracted galls of Haloxylon ammodendron

MAN Ling-juan， ZHANG Hua*， YAO Zheng-pei， ZONG Xing-feng， LI Zhi-qiang

（College of Agronomy， Xinjiang Agricultural University， Urumqi? 830052， China）

Abstract：【Objective】The transcriptome difference of the leafy-bracted gall and assimilating branch of Haloxylon ammodendron was analyzed to provided a theoretical reference for exploring the molecular mechanism of leafy-bracted gall formation and the pest control of H. ammodendron. 【Method】The experimental materials were the assimilating branches of H. ammodendron and the leafy-bracted gall. The transcriptome was sequenced using Illumina HiSeq 2000 high-throughput sequencing platform，and differential expression gene was analyzed. The soluble sugar and chlorophyll contents of them were measured to confirm the results of transcriptome analysis. 【Result】A total of 159147 Unigenes were obtained with average length of 551 bp. Their N50 was 752 bp. In Swissport， GO， Pfam， NR， NT， KOG/COG and KEGG，8521 Unigenes（5.35%） were successfully annotated in all databases， 66714 Unigenes（41.91%） were annotated in at least one database，and 49066 Unigenes（30.83%） were successfully matched to species in total. Using q value<0.005 and |log2FoldChange|>1 as screening condition，3444 Unigenes were differentially expressed，among which 1299 were up-regulated and 2145 were down-regulated. Compared with the assimilating branches of H. ammodendron，the up-regulated genes in gall were mainly enriched in metabolic processes，organic substance metabolic process，catalytic activities，carbohydrate metabolic process and ribosome pathway，while the down-regulated genes were enriched in cells，cell component，intracellular component and organelle，pyrimidine metabolism，cell cycle，DNA replication，photosynthesis，phenylpropanoid biosynthesis and flavonoid biosynthesis. The soluble sugar content in galls of different developmental stages was higher than that of assimilating branches，while the chlorophyll content was lower than that of assimilating branches. The results further confirmed that the genes related to sugar metabolism were up-regulated，but the genes related to photosynthesis were down-regulated in transcriptome analysis. 【Conclusion】The number of ribosomes in the leafy-bractedgall of H. ammodendron increases，the translation process accelerates，the metabolic level increases，and the glycometabolic metabolites accumulates，but its photosynthesis decreases，its elongation and growth slow down. It is inferred that the gall can supply its own needs by absorbing and utilizing the nutrients of assimilating branches.

Key words： Haloxylon ammodendron; leafy-bracted gall; transcriptome analysis; soluble sugar content; chlorophyll content

0 引言

【研究意義】梭梭（Haloxylon ammodendron）為藜科（Chenopodiaceae）梭梭屬（Haloxylon）植物，其葉片退化為鱗狀葉，由同化枝進行光合作用，生長在沙丘、鹽漬土及礫質戈壁等地，能耐受高溫、干旱、鹽堿、風蝕的惡劣環境，具有防風固沙的生態保護作用（俞闐，2012;Long et al.，2014）。木虱（Psyllidae）可嚴重危害梭梭生長，其在梭梭同化枝上引起的蟲癭外形類似葉苞狀，被稱為梭梭葉苞狀蟲癭（姜夢輝等，2017）。蟲癭是因昆蟲、病菌等刺激誘導寄主植物產生的一種畸形瘤狀物或突起（邵淑霞等，2012;Carneiro et al.，2017），其形成和發育是植物與昆蟲共同作用的結果，明確其形成過程對探討生物間協同進化和減少昆蟲對寄主的危害十分重要（王光鉞等，2010;申潔等，2016）。因此，利用轉錄組測序分析梭梭同化枝及其蟲癭的基因表達差異有助于深入探究蟲癭生長發育及形成的分子機制，對分析木虱與梭梭的進化關系及開展梭梭林蟲害防治具有重要意義。【前人研究進展】通過轉錄組測序可獲取特定生長狀況下某組織或細胞的轉錄本信息，從而分析基因的表達情況，現已發展成為深入挖掘未知基因的重要手段（劉永杰，2016;Hrdlickova et al.，2017;唐玉娟等，2018）。目前，利用該技術開展了大量關于蟲癭的研究工作。如桃金娘葉片及其蟲癭的轉錄組測序結果表明，蟲癭形成與生長素響應基因相關（Bailey et al.，2015）;白蠟蟲真蛹的轉錄組測序結果表明，白蠟蟲蛹期生理活動與蛋白降解和Wnt信號通路等相關（于淑惠等，2016）;長葉木姜子及其杯狀癭的轉錄組測序結果表明，杯狀癭內能量或營養相關基因的改變促使其光合作用降低，可溶性糖含量升高（Shih et al.，2018）;榆樹葉片及其蟲癭的轉錄組測序結果表明，蟲癭的形成與糖代謝、次生代謝、植物激素信號轉導等代謝通路相關（李軒和黃智鴻，2019）;葡萄葉片及其蟲癭的轉錄組測序結果表明，蟲癭的形成與形成層分生組織、生長素信號轉導等途徑相關（Schultz et al.，2019）。關于梭梭葉苞狀蟲癭的相關研究主要集中在蟲癭的形態和生態學方面，李粉蓮等（2012）研究發現，梭梭葉苞狀蟲癭內有異色胖木虱、梭梭胖木虱、矮胖木虱和顯赫胖木虱4種木虱;姜夢輝等（2017）通過對梭梭同化枝及其葉苞狀蟲癭進行野外和顯微結構觀察，將蟲癭的生長發育分為生長期、形成期和衰亡期3個階段，且蟲癭表皮細胞的葉綠體較梭梭同化枝少。【本研究切入點】至今，鮮見有關梭梭葉苞狀蟲癭形成機制及轉錄組差異表達分析的研究報道。【擬解決的關鍵問題】以梭梭同化枝及其葉苞狀蟲癭為材料，對其進行轉錄組測序及差異表達基因分析，并通過測定可溶性糖和葉綠素含量驗證分析結果，旨在了解蟲癭的發育機理及對梭梭生長的影響，為揭示梭梭葉苞狀蟲癭形成的分子機制及害蟲防治提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

在新疆古爾班通古特沙漠南緣選取生長健康且高度基本一致的梭梭植株，采集梭梭同化枝及其生長期和形成期的葉苞狀蟲癭為試驗材料（圖1），液氮速凍后置于超低溫冰箱保存備用。TRIzol植物總RNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司，DNase I（RNase-free）試劑盒購自Thermo公司，其他生化試劑均購自新疆皓博晟達生物科技有限公司。主要儀器設備：DYY-6B型電泳儀（北京六一儀器廠）、Agilent Bioanalyzer 2100生物芯片分析儀（Agilent，美國）、NanoDrop 1000分光光度計（Thermo，美國）和722型可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）。

1. 2 轉錄組測序

利用TRIzol植物總RNA提取試劑盒分別提取梭梭同化枝及其葉苞狀蟲癭的總RNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量。經DNase I（RNase-free）試劑盒純化，使用Agilent Bioanalyzer 2100生物芯片分析儀和NanoDrop 1000分光光度計分別檢測總RNA的純度及濃度。分別將檢測合格的同化枝總RNA溶液及生長期和形成期的葉苞狀蟲癭總RNA等體積混合液送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行轉錄組測序。測序得到的原始序列raw reads經過濾除雜得到高質量clean reads，再利用Trinity對clean reads進行拼接和組裝，最終獲得的Unigenes作為后續分析的參考序列（Grabherr et al.，2011）。

1. 3 轉錄組功能注釋

獲得的Unigenes與NR、NT、Pfam、KOG/COG、Swissprot、GO和KEGG等數據庫比對注釋。其中，根據Nr數據庫注釋結果可得到與Unigenes比對的物種分布圖，并基于NR和Pfam數據庫注釋信息，使用Blast2GO對Unigenes進行GO功能注釋及分類（Conesa et al.，2005）。根據KEGG數據庫將參與各代謝通路的Unigenes進行分類。

1. 4 基因表達水平分析及差異表達基因篩選

參考Li和Dewey（2011）的方法，利用RSEM（bowtie2為默認參數）將每個樣品的clean reads與參考序列進行比對分析，統計與參考序列匹配成功的clean reads，獲得各樣品比對到每個基因的read count數目，對其進行FPKM（每百萬fragments中來自某一基因每千堿基長度的fragments數目）轉換，當FPKM>0.3時判定為基因表達。

使用TMM將read count數據標準化處理后，以DEGseq進行差異表達分析：篩選出閾值為q value （校正后的p value）<0.005且|log2FoldChange|>1的基因，當基因的log2FoldChange>0，則認為該基因表達上調，反之，則認為該基因表達下調（Anders and Huber，2010）。使用GOseq方法對獲得的差異表達基因（Differentially expressed genes，DEGs）進行GO富集分析（Young et al.，2010）;同時采用KOBAS 2.0進行KEGG富集分析（Kanehisa et al.，2008）。

1. 5 可溶性糖和葉綠素含量的測定

為證實轉錄組測序結果的準確性，分別測定梭梭同化枝及其葉苞狀蟲癭中的可溶性糖和葉綠素含量。采集梭梭同化枝及不同發育期的葉苞狀蟲癭（圖2），采用蒽酮比色法測定其可溶性糖含量（張樺，2014），采用乙醇丙酮混合液浸提法測定其葉綠素含量（徐芬芬等，2010），各樣品均設3個重復。

2 結果與分析

2. 1 轉錄組測序結果

梭梭同化枝及其葉苞狀蟲癭的轉錄組測序結果如表1所示，GC含量分別為41.57%和43.70%，Q30為91%，表明測序數據質量較好，可用于后續分析。高質量clean reads經拼接組裝后獲得轉錄本序列，取每條基因中最長的轉錄本作為Unigene，最終獲得159147條Unigenes，平均長度為551 bp，N50為752 bp，其中序列長度最短為201 bp，最長為13228 bp，200～500 bp的序列有113933條，大于2 kb的序列有6296條。

2. 2 Unigenes的功能注釋結果

統計在各數據庫注釋的Unigenens數目，結果表明，159147條Unigenes中，在NR數據庫注釋的Unigenes有49128條（30.86%），在Swissport、GO、Pfam、Nt、KOG/COG和KEGG等數據庫注釋的Unigenens分別有43404條（27.27%）、43396條（27.26%）、42925條（26.97%）、29768條（18.70%）、27121條（17.04%）和20561條（12.91%），在以上7個數據庫均被注釋的Unigenes有8521條（5.35%），至少在1個數據庫注釋的Unigenes有66714條（41.91%）。

與Nr數據庫中已知物種序列進行比對分析，發現共有49066條Unigenes（30.83%）與物種匹配成功，其中匹配序列數量最多的為甜菜（Beta vulgaris）25025條（51.00%），其次為林煙草（Nicotiana sylvestris）2368條（4.80%）、絨毛狀煙草（N. tomentosiformis）2263條（4.60%）、大麥（Hordeum vulgare）974條（2.00%）和藍隱藻（Guillardia theta）701條（1.40%），與其他物種匹配序列共計17735條（36.10%），有110081條（69.17%）未匹配成功。

2. 3 差異表達基因的GO富集分析結果

根據Nr注釋信息，對Unigenes進行GO分類，結果發現共有43396條Unigenens注釋到生物過程（Biological process）、分子功能（Molecular function）和細胞組分（Cellular component）中的56個亞類。以q value<0.005且|log2FoldChange|>1為條件，共篩選出3444條差異表達的Unigenes，其中1299條上調表達、2145條下調表達。差異表達基因的GO富集分析結果顯示，有3819條Unigenes注釋到生物過程的20個亞類，560條Unigenes注釋到細胞組分的9個亞類，1448條Unigenes注釋到分子功能的20個亞類。

將GO富集分類中前10個富集項（q value<0.05）在圖3中依次列出。與梭梭同化枝相比，梭梭葉苞狀蟲癭上調表達基因在生物過程類型中主要富集于代謝過程、有機物代謝過程、有機氮復合代謝和氧化還原等過程;在細胞組分類型中主要富集于細胞質、核糖體、核糖核蛋白復合體等;在分子功能類型中主要富集于催化活性和氧化活性等功能方面，說明梭梭葉苞狀蟲癭較其同化枝的代謝水平高。與梭梭同化枝相比，梭梭葉苞狀蟲癭下調表達基因在生物過程類型中主要富集于細胞成分組織或生物的發生、核糖體及核蛋白體發生、細胞或亞細胞成分的運動、光合作用和微管等過程;在細胞組分類型中主要富集于細胞、細胞器、細胞成分和微管等組分;在分子功能類型中主要富集于DNA結合、結構分子活性、核糖體結構成分和微管蛋白結合等功能方面，說明梭梭葉苞狀蟲癭光合作用下降，細胞的伸長與生長受到影響。

2. 4 差異表達基因的KEGG通路分析結果

差異表達基因主要參與五類KEGG通路，分別為細胞過程、環境信息處理、遺傳信息處理、代謝和有機系統。其中，在細胞過程通路中，參與運輸與分解代謝的相關基因最多，為1107條;在環境信息處理通路中，參與信號轉導和膜轉運的相關基因較多，分別為475和149條;在遺傳信息處理通路中，參與翻譯的相關基因最多，為2627條，其次為參與蛋白質折疊、分類和降解過程、轉錄及復制與修復的相關基因，分別為1718、1041和392條;在代謝通路中，參與碳水化合物代謝的相關基因最多，為2005條，其次為參與新陳代謝、氨基酸代謝和能量代謝的相關基因分別為1500、1337和1121條;在有機系統通路中，參與環境適應的相關基因最多，為639條。

差異表達基因參與的代謝通路在表2中按照q value依次列出。與梭梭同化枝相比，梭梭葉苞狀蟲癭中上調表達基因主要富集在核糖體代謝通路，其次為核糖體、乙醛酸和二羧酸代謝、脂肪酸降解、碳代謝作用和脂肪酸代謝等通路，推測這些基因上調表達會引起梭梭葉苞狀蟲癭糖代謝產物的積累。下調表達基因主要富集在光合作用、光合作用天線蛋白、DNA復制、細胞周期、嘧啶代謝作用、苯丙烷類生物合成和類黃酮生物合成等通路，表明與梭梭同化枝比較，梭梭葉苞狀蟲癭的光合效率降低，同時細胞分裂和木質素合成受影響。

2. 5 梭梭同化枝和葉苞狀蟲癭的可溶性糖和葉綠素含量測定結果

分別對梭梭同化枝及其葉苞狀蟲癭進行可溶性糖和葉綠素含量測定，結果如圖4所示。隨著梭梭葉苞狀蟲癭的生長，可溶性糖含量呈先升高后降低的變化趨勢，其中Ha-D1和Ha-D2葉苞狀蟲癭的可溶性糖含量顯著高于同化枝（P<0.05，下同），但Ha-D1、Ha-D2和Ha-D3葉苞狀蟲癭的葉綠素含量均顯著低于同化枝。可見，與梭梭同化枝相比，梭梭葉苞狀蟲癭的可溶性糖含量較高，葉綠素含量較低，進一步驗證梭梭葉苞狀蟲癭的糖代謝相關基因上調表達而光合作用相關基因下調表達的轉錄組分析結果。

3 討論

本研究的梭梭同化枝和葉苞狀蟲癭轉錄組測序及功能注釋結果顯示，159147條Unigenes中，在NR、NT、Pfam、KOG/COG、Swissprot、GO和KEGG等數據庫中均被注釋的Unigenens有8521條（5.35%），至少在1個數據庫注釋的Unigenens有66714條（41.91%），但僅有49066條Unigenes（30.83%）與物種匹配，表明梭梭同化枝和葉苞狀蟲癭中仍有大量未知的Unigenes，這些序列可能編碼新蛋白。Bailey等（2015）對桃金娘葉片及其蟲癭進行轉錄組差異分析，結果表明，在正常桃金娘葉片中存在未表達卻因蟲癭形成而重新啟動的基因。同樣，本研究發現只在梭梭葉苞狀蟲癭中表達的Unigenes有530條，推測這些Unigenes是與葉苞狀蟲癭形成有關的特異表達序列，為今后挖掘相關基因提供了參考。

蟲癭通過消耗較高的能量以維持其旺盛的生長和新陳代謝，導致寄主植物組織的結構和功能發生改變，光合作用減弱（Carneiro et al.，2017）。可溶性糖為植物生長提供能量并構成結構物質，在植物生長過程中發揮重要作用（Ma et al.，2017）。前人研究發現，荔枝和無患子的蟲癭中可溶性糖含量比正常葉片高，說明可溶性糖是蟲癭代謝、發育及昆蟲生長的營養物質（Huang et al.，2015;Oliveira et al.，2017）。本研究的GO富集分析和KEGG通路分析結果顯示，梭梭葉苞狀蟲癭上調表達差異基因主要富集在代謝過程、有機物代謝過程、催化活性、碳水化合物代謝和核糖體代謝等通路，說明梭梭葉苞狀蟲癭中核糖體數量增加，翻譯過程加快，代謝水平提高，糖代謝產物積累，為梭梭葉苞狀蟲癭及若蟲的生長提供能量和條件，與不同發育階段梭梭葉苞狀蟲癭的可溶性糖含量均高于梭梭同化枝的結果相互印證。此外，本研究發現不同發育階段梭梭葉苞狀蟲癭的葉綠素含量均低于梭梭同化枝，與梭梭葉苞狀蟲癭下調表達基因富集在光合作用和光合作用天線蛋白的結果相互印證，表明葉苞狀蟲癭的光合作用降低。前人研究也發現，櫻桃和無患子葉片的蟲癭內葉綠素含量較低，光合作用下降（Larson，1998;Oliveira et al.，2017），與本研究結果基本一致。梭梭葉苞狀蟲癭的光合作用降低，代謝活性升高，推測其通過吸收利用梭梭同化枝的養分以滿足自身需求。

微管在植物生長發育中參與細胞內運輸、細胞運動及分裂過程，同時構成細胞骨架，維持細胞形態，且參與合成植物中的纖維素和木質素等（邱鴻和于榮，2009;饒國棟和張建國，2013），而苯丙烷類代謝產物可進一步轉化成類黃酮、木質素等，在植物木質化和自我保護過程中發揮重要作用（Grace and Logan，2000;孟雪嬌，2011;王星等，2017）。本研究的GO富集分析和KEGG通路分析結果顯示，下調表達基因富集在微管及其過程、微管運動及其活性、微管結合、微管蛋白結合、結構分子活性、苯丙烷和類黃酮生物合成、細胞周期和DNA復制等過程。這些基因與細胞分裂、運動和伸長生長相關，其表達量降低不利于營養物質的長距離運輸、細胞伸長及形態維持，可能是造成梭梭葉苞狀蟲癭較短小的主要原因，而苯丙烷、類黃酮等次生代謝產物合成相關基因的表達量降低，可能是導致梭梭葉苞狀蟲癭質地較軟且木質化程度下降的主要因素。但關于葉苞狀蟲癭是如何影響梭梭同化枝正常生長而形成現有形態、如何改變次生代謝而利于幼蟲生長均有待進一步研究。

4 結論

梭梭葉苞狀蟲癭中核糖體數量增加，翻譯過程加快，代謝水平提高，糖代謝產物積累，但其光合作用降低，伸長生長減慢，推測其通過吸收利用同化枝的養分以滿足自身的需求。

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（責任編輯 陳 燕）