基于線粒體COI基因序列的武漢地區常見麥蚜蚜種鑒定

楊鈺慧 謝佳燕 吳聰

摘要：【目的】采用線粒體COI基因序列分析武漢地區常見麥蚜蚜種的遺傳組成，探討基于COI基因序列作為常見麥蚜蚜種分子鑒定的可行性，為田間麥蚜的有效識別和綜合治理提供科學依據。【方法】采集武漢市田間和實驗室培養的3種麥蚜（禾谷縊管蚜、麥長管蚜和麥二叉蚜），擴增其COI基因后進行測序，并進行遺傳距離檢測及聚類分析。【結果】3種麥蚜COI基因片段核苷酸組成中堿基C和G的總含量低于堿基A和T的總含量，其中含量最低的堿基為G，具有明顯的堿基偏倚性;不同麥蚜的種內遺傳距離均小于0.010，種間遺傳距離約是種內遺傳距離的10倍;聚類分析結果表明，蚜科的所有物種聚為一支，之后又形成3個分支，分屬于蚜科的3種麥蚜。【結論】3種麥蚜的分子鑒定與形態學分類結果一致，表明采用COI基因序列可對武漢地區常見麥蚜蚜種進行有效鑒定。

關鍵詞： 麥蚜;COI基因序列;物種鑒定;蚜科

中圖分類號： S435.122.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）08-1742-06

Identification of wheat aphid species in Wuhan based on mitochondrial COI gene sequence

YANG Yu-hui， XIE Jia-yan*， WU Chong

（School of Biology and Pharmaceutical Engineering， Wuhan Polytechnic University， Wuhan? 430023， China）

Abstract：【Objective】This experiment used mitochondrial COI sequences to analyze the genetic composition of co-mmon wheat aphids species in Wuhan， investigated the feasibility of COI gene sequence as molecular identification for common wheat aphid species， and provided reference for effective identification and integrated management of wheat aphids in the field. 【Method】Samples of three different wheat aphids species[Rhopalosiphum padi（Linnaeus）， Macrosiphum avenae（Fabricius） and Schizaphis graminum] in the field in Wuhan and cultivated in the laboratory were collec-ted. The COI gene were amplified and sequenced. Genetic distance and the clustering were also analyzed. 【Result】In the nucleotide of COI gene fragment of the three wheat aphids，the total content of base C and base G was lower than the total content of base A and base T. The content of base G was the lowest and showed obvious base bias. All intraspecific genetic distances of these aphid species were lower than 0.010， and interspecific genetic distance was ten times more than intraspecific genetic distance of these aphid species. The analysis of clustering showed that all species of Aphidinae were clustered one clade， and then it formed three small clades which were individually clustered by different wheat aphids. 【Conclusion】The molecular identification of these wheat aphids in the field is consistent with the morphological classification. The results suggests that COI gene sequence can identify effectively the common wheat aphids in Wuhan.

Key words： wheat aphid; COI gene sequence; species identification; Aphidinae

0 引言

【研究意義】農業害蟲所產生的直接和間接破壞對人類維持作物生產力和營養安全等產生了重要影響。麥蚜是世界各小麥產區的常發性害蟲，隸屬于同翅目（Homoptera）蚜科（Aphidinae），為多型性昆蟲。麥蚜主要寄生在小麥穗部和中上部葉片上刺吸為害，直接造成麥類作物大量減產（李宏德，2016）。麥蚜還可傳播麥類病毒（劉艷莉等，2018），間接造成糧食作物嚴重減產。另外，一些麥蚜已成為入侵物種，對國際糧食生產和貿易產生嚴重危害（Bass et al.，2014）。麥蚜在我國已連續多年嚴重發生，對我國小麥的安全生產構成嚴重威脅（李素娟等，2001）。在我國，危害麥類作物的蚜蟲主要有4種（韓松等，2018），在長江中下游地區危害小麥的主要蚜蟲是麥長管蚜[Sitobion avenae（Fabricius）]和禾谷縊管蚜[Rhopalosiphum padi（Linnaeus）]（杜新慧，2014）。長期以來，麥蚜的防治仍以化學防治為主，田間的不合理用藥導致麥蚜危害加劇及麥蚜抗藥性水平顯著上升（王曉軍等，2004;李宏德，2016）。由于蚜蟲屬典型的r-對策昆蟲，其生活周期短，營孤雌生殖，具有不同的寄主類型和顏色多型現象（張廣學，1999;Shufran et al.，2000），因而對各種生態系統具有較強的生態適應能力;另外，不同麥蚜對作物的取食部位和傳毒能力不同，對作物產生的危害程度也不同，對麥蚜的錯誤識別將影響田間病蟲害的有效管理和風險評估。因此，快速、準確地識別不同蚜種，對保障小麥產業健康發展具有重要意義。【前人研究進展】Enders等（2018）研究了土地覆蓋、溫度和降水等生態因子對麥蚜豐度及傳播病毒能力的影響，結果表明其他生態因子可能影響了禾谷縊管蚜和麥長管蚜的豐度和傳毒能力;麥二叉蚜（Schizaphis graminum）的豐度受秋季降水和冬季溫度的影響，而傳毒能力不受這些因素的影響，麥二叉蚜是麥田中病毒傳播能力最強的麥蚜。DNA條形碼（DNA barcoding）技術是近年來對昆蟲進行物種鑒定的新方法。Hebert等（2003a）首次采用COI基因序列對不同物種進行檢測，發現該基因能進行有效的物種識別。近幾年有關其他昆蟲的研究也表明，COI基因片段作為條形碼可進行有效識別和物種鑒定。如為確定入境口岸攔截的變葉木上纓翅目薊馬科的Leucothrips是否對美國農業構成入侵威脅，Skarlinsky等（2017）采集美國不同地點和不同宿主的薊馬科Leucothrips成蟲和幼蟲進行比較分析，發現采集到的成蟲間無形態差異，形態學分析鑒定為薊馬科昆蟲L. furcatus，但采集的幼蟲形態差異明顯，經線粒體COI基因和rRNA驗證，發現該樣本分成2組，第一組僅由幼蟲構成，與第二組存在明顯遺傳差異，第二組樣本由幼蟲和成蟲組成，遺傳分化較低且形態高度相似，表明它們構成單一物種，而兩組幼蟲在形態上的不同和遺傳上的差異，表明其可能存在另一種隱蔽物種。Syromyatnikov等（2017）發現形態鑒定不易區分扁盾蝽屬物種，因此采用COI基因序列對4種扁盾蝽屬有害物種進行檢測，結果顯示該序列能準確鑒定麥扁盾蝽（Eurygaster integriceps），并開發了能快速鑒定麥扁盾蝽的PCR-RFLP方法。Mackenzie等（2018）采用COI基因序列檢測田間常見蚜種中具有抑制馬鈴薯Y病毒（PVY）傳播殺蟲劑的特定抗性突變基因的頻率，結果表明，在田間采集的45種蚜蟲中至少有17種蚜種被認為是PVY的載體，其中，桃蚜是所有檢測蚜種中對殺蟲劑抗性突變頻率最高的物種，是PVY和馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）中最有效的載體物種。【本研究切入點】湖北省是我國南方小麥主產省份，在全國小麥生產中占有重要地位。近年來，由于化學農藥的不合理使用，致使麥蚜抗性水平不斷增強。因此，如何通過現代生物技術與傳統化學防治相結合，對田間麥蚜物種進行有效鑒定及合理利用化學農藥和田間綜合治理具有重要的實踐意義。目前，基于COI基因序列對田間常見麥蚜蚜種進行分析鑒定的研究報道較少。【擬解決的關鍵問題】對湖北省武漢地區常見麥蚜種類的COI基因序列片段進行擴增及測序，分析不同麥蚜的遺傳特征，探討COI基因序列作為田間常見麥蚜蚜種分子鑒定標記的可行性，為田間麥蚜的有效識別和綜合治理提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試禾谷縊管蚜（RP）和麥長管蚜（SA）樣品于2017年5月采自湖北省武漢市周邊麥田內;麥二叉蚜（SG）為2017年9月采自田間，之后室內采用瑞華HP300G型智能光照培養箱中傳代培養。所有樣本于-20 ℃保存備用。此外，為進行相關物種間的比較分析，從NCBI下載3種麥蚜的16條COI基因序列及取食小麥的其他3種害蟲的COI基因序列進行分析，序列信息見表1。

1. 2 樣本DNA提取、PCR擴增及測序

參照薩姆布魯克和拉塞爾（2002）、楊子祥等（2006）的方法，采用酚—氯仿法提取基因組DNA。利用Foottit等（2008）的引物LepF：5'-ATTCAACCA ATCATAAAGATATTGG-3'/LepR：5'-TAAACTTCT GGATGTCCAAAAAATCA-3'（由北京六合華大基因科技股份有限公司合成）擴增COI基因。擴增程序：94 ℃預變性3 min;94 ℃ 50 s，45～50 ℃每升1 ℃循環5次，50 ℃循環10次，退火1 min，72 ℃ 1.5 min，進行30個循環;72 ℃延伸10 min。將擴增產物送至武漢艾康健生物科技有限公司進行純化和測序。

1. 3 數據分析

對所得COI基因序列采用ClustalX ver.1.83進行多重比對（Thompson et al.，1997），包括NCBI下載3種麥蚜的16條COI基因序列及3條取食小麥的其他害蟲（麥紅吸漿蟲、大青葉蟬和小麥皮薊馬）的COI基因序列（表1），識別COI基因序列后進行不同物種間序列比對分析。利用MEGA 7.0分析3種麥蚜COI基因的序列特征、堿基組成及序列變異情況（Kumar et al.，2016），計算所有序列間的遺傳距離，采用鄰接法（Neighbour-joining）構建不同麥蚜蚜種間的系統發育進化樹，替代模型為Kimura雙參數法（Kimura-2-parameter），聚類樹分支的置信度選擇重復1000次自引導法（Bootstrap analysis）。

2 結果與分析

2. 1 麥蚜COI基因片段的核苷酸組成

對麥蚜的線粒體COI基因序列進行多重比對，得到長度為669 bp的COI基因片段，該片段中未發現堿基插入或缺失。測序分析結果表明，在所有位點中，保守位點有589個（88%）、變異位點80個（12%）。3種麥蚜的堿基平均含量分別為T=40.9%、C=13.9%、A=34.5%和G=10.7%。堿基A+T含量為75.4%，其中第3位點A+T含量為94.1%。堿基C和G的總含量低于堿基A和T的總含量，其中含量最低的堿基為G，但不同麥蚜蚜種間的堿基組成無顯著差異（P>0.05）。堿基替換分析結果表明，有615個一致位，29個位點發生了堿基轉換，25個位點發生顛換，轉換主要發生在T～C之間，顛換主要發生在T～A之間，堿基變異均勻地分布于該序列的各區域。

2. 2 不同麥蚜COI基因序列的遺傳結構

對不同麥蚜COI基因序列間的遺傳距離進行分析，結果（表2）表明，3種麥蚜COI基因序列間的群體內遺傳距離較低，均低于0.010，而所有麥蚜COI基因序列間的平均遺傳距離為0.084。種間遺傳距離約是種內遺傳距離的10倍，種間遺傳距離差異顯著（P<0.05），而種內差異較小。

2. 3 不同麥蚜COI基因序列的聚類分析結果

基于COI基因序列構建的系統發育進化樹（圖1）顯示，蚜科的3個種聚成一支，其他的麥類害蟲各聚成不同的分支;蚜科物種聚成獨立的一支后，又形成3個獨立分支，分屬于蚜科的3種麥蚜，即麥二叉蚜、禾谷縊管蚜和麥長管蚜。3種麥蚜的不同個體各自聚類形成相對獨立的分支，且節點支持率較高。

3 討論

對于小型昆蟲蚜蟲物種而言，其在不同季節、不同地點和宿主均存在多種生物型、顏色變種和隱存種的可能（Rebijith et al.，2013）。Duan等（2017）研究了禾谷縊管蚜種群生命周期與遺傳多態性的關系，結果表明，具有相同生殖方式的禾谷縊管蚜種群表現出相似的遺傳結構，而生殖方式不同的群體間遺傳差異顯著。這些差異將增加形態學鑒定的難度，且消耗大量的鑒定時間和精力。DNA條形碼技術為小型昆蟲的快速鑒定提供了可能。已有研究表明，COI基因序列作為條形碼可有效識別和鑒定不同的昆蟲物種（Hebert et al.，2003a;Syromyatnikov et al.，2017），同時可檢查不同地理種群的差異。Xu等（2011）擴增了17個地區麥長管蚜種群的線粒體COI基因序列，結果顯示，我國北方麥長管蚜種群的遺傳多樣性高于華南種群，季節對寄主植物的影響可能增強了北方種群的遺傳多態性水平。

COI基因為線粒體內的蛋白質編碼基因。在本研究中，3種麥蚜的COI基因序列與其他昆蟲線粒體DNA序列組成具有相似的特點，COI基因序列中的堿基組成表現出明顯的堿基偏倚性（Jermiin and Crozier，1994），序列中未發現堿基缺失或插入現象，可能與COI基因為線粒體蛋白質編碼基因滿足功能上的需要和三聯體密碼子結構的限制有關（Hebert et al.，2003b）。在蚜科中，已采用COI基因序列片段作為DNA條形碼對取食不同寄主植物的蚜蟲進行快速而準確的鑒定。汪珍春等（2013）研究表明，采用DNA條形碼快速鑒定常見花卉蚜種具有可行性。溫娟等（2013）基于COI基因序列對北京薔薇科植物上的9屬12種蚜蟲進行DNA條形碼分析，結果顯示北京薔薇科花卉蚜種有83%能通過DNA條形碼進行有效區分。Coeur d'acier等（2014）為274種歐洲蚜種構建了DNA條形碼數據庫，其可對歐洲蚜種進行無偏差分類，簡化了80%用于物種鑒定的消耗。Lee等（2015）采用COI基因序列對寄生于同種沙棘植物上形態相似的3種蚜種進行有效區分，并鑒定出一個隱種。

種間和種內遺傳距離間的差異程度是COI基因序列作為DNA條形碼進行物種鑒定的關鍵（Aliabadian et al.，2009），在DNA條形碼研究中物種劃分的參考值為0.02（腔腸動物門除外）（Hebert et al.，2003b）。本研究中武漢市常見麥蚜物種內COI基因的遺傳距離差異均低于0.010，且與種間遺傳距離的差距在10倍左右，表明該基因序列適用于麥蚜蚜種間的鑒定（Hebert et al.，2003a，2004;Meyer and Paulay，2005）。Shufran和Puterka（2011）采用基于COI基因條形碼檢驗了美國谷物作物上的蚜蟲，發現該序列可成功鑒定8種全周期型蚜蟲和2種常見谷物蚜蟲。本研究以COI基因序列構建麥蚜系統發育進行樹，結果顯示，蚜科聚成獨立的一支，之后又形成3個分支，分屬于蚜科的3種麥蚜，麥二叉蚜、禾谷縊管蚜和麥長管蚜個體各自聚類形成相對獨立的分支，其他物種也各自聚成獨立的分支，物種間界限明晰，分支節點支持率較高，說明麥蚜的COI基因序列分子鑒定與常規分類結果一致，表明該基因對武漢市常見麥蚜物種的鑒定可行。因此，可通過COI基因鑒定技術與傳統分類結合的方法，對田間麥蚜物種和其他麥類害蟲進行有效鑒定。

4 結論

3種麥蚜的分子鑒定與應用形態學方法分類的結果一致，表明采用COI基因序列可對武漢地區常見麥蚜進行有效鑒定。

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（責任編輯 麻小燕）