解磷拮抗真菌分離鑒定及其對獼猴桃軟腐病的生防評價

卯婷婷 莫維弟 趙玳琳 王廿 陶剛

摘要：【目的】篩選可應用于獼猴桃果實軟腐病的高效生防菌株，為獼猴桃軟腐病生防制劑研發提供菌種資源。【方法】采集有獼猴桃軟腐病發生的獼猴桃種植園健康植株根際土壤，利用解磷選擇性培養基分離土壤中解磷真菌，采用平板對峙法、菌落直徑法、繼代培養及發酵液抑菌試驗等從中篩選對獼猴桃軟腐病菌具有拮抗作用的菌株，通過形態學結合分子生物學方法對拮抗菌株進行鑒定。【結果】從獼猴桃根際土壤中分離得到35株解磷真菌菌株，通過對峙培養從中篩選出5株對獼猴桃軟腐病菌具有拮抗作用且抑菌率超過50.00%的菌株，其中MHT0308菌株的抑菌效果最佳，對獼猴桃軟腐病菌的抑菌率達87.71%，復篩抑菌圈也明顯，抑菌直徑達33.50 mm;MHT0308菌株的含菌發酵液和無菌發酵液均對靶標菌生長有抑制作用，抑菌率分別達88.13%和80.87%;獼猴桃果實經MHT0308菌株發酵液處理后對獼猴桃軟腐病的離體防效達87.00%;根據MHT0308菌株形態學特征結合其分子生物學鑒定結果，確定MHT0308菌株為哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）。【結論】MHT0308菌株對獼猴桃軟腐病具有較好的防治效果，可作為一種重要的生防菌資源用于獼猴桃軟腐病防治研究。

關鍵詞： 獼猴桃軟腐病;解磷菌;抑菌作用;離體防效;木霉菌

中圖分類號： S436.634? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）08-1748-08

Isolation and identification of phosphate-solubilizing antagonistic

fungus and its biocontrol effects against kiwifruit soft rot

MAO Ting-ting1， MO Wei-di2， ZHAO Dai-lin1， WANG Nian1， TAO Gang1*

（1Institute of Plant Protection，Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang? 550006， China;

2Agricultural College， Guizhou University， Guiyang? 550025， China）

Abstract：【Objective】The aim of the study was to screen the efficient biocontrol strains that could be applied to the green prevention and control of kiwifruit soft rot， and provide resources for biocontrol agent development for kiwifruit soft rot. 【Method】The healthy rhizosphere soil of kiwifruit plantation with kiwifruit soft rot was collected， and the phosphate- solubilizing fungus was separated from the soil using selective phosphate-degrading medium. At the same time， the antagonistic fungus against kiwifruit soft rot were screened by using plate confront culture， colony diameter inhibition assay， subculture and fermentation broth inhibition test. The fungi were classified through the morphological characteristics and molecular biology. 【Result】Thirty-five strains of phosphorus-releasing fungi were isolated from the rhizosphere soil of kiwifruit， five strains with an antagonistic effect on soft rot of kiwifruit and the inhibition rate more than 50.00% were selected through confrontation culture. Among them， MHT0308 strain had the best inhibitory effect and it had 87.71% control efficiency to soft rot of kiwifruit. And the inhibition zone was obvious with the inhibition diameter of 33.50 mm. Both sterilized and non-sterilized fermentation liquid of MHT0308 strain were effective against target pathogen hyphae， the inhibitory rates were 88.13% and 80.87%， respectively. The control effect of kiwifruit in vitro was 87.00% after trea-ted with MHT0308 fermentation broth. According to the morphological characteristics and molecular biology， the strain MHT0308 was identified as Trichoderma harzianum. 【Conclusion】Strain MHT0308 has sound control efficacy against kiwifruit soft rot and can be used as an important biocontrol resource for the prevention and treatment of kiwi soft rot.

Key words： kiwifruit soft rot; phosphate-solubilizing fungus; bacteriostatic effect; control effect in vitro; Trichoderma

0 引言

【研究意義】獼猴桃（Actinidia chinensis Planch）又名長壽果、美容果，每100 g獼猴桃果肉中維生素C含量可達652～930 mg，故又被譽為維C之王（楊宗正，2018）。獼猴桃在我國陜西、甘肅、河南、廣西、廣東、福建、云南、貴州和四川等省（區）均有種植分布。近年來，獼猴桃種植面積逐漸擴大，在產量和效益上升的同時，獼猴桃病害也日益突出，尤其是獼猴桃果實軟腐病作為儲藏期病害對獼猴桃產業危害尤為嚴重，通常采摘時無癥狀，儲藏期開始發病，發病率一般為20%，嚴重時可達50%（馬松濤等，2000），直接影響獼猴桃的經濟價值。目前國內外對該病害的防控主要以化學防治為主，研究表明，抗菌素402、退菌特、抗菌素401、波爾多液（余桂萍和周洪旗，2009），多菌靈（王小潔等，2017），肟菌酯戊唑醇、己唑醇、戊唑醇、異菌脲、苯醚甲環唑（吳文能等，2018）等化學藥劑對獼猴桃軟腐病均有較好的防治效果。但化學藥劑的大量使用既增加了獼猴桃軟腐病菌的抗藥性風險，還容易造成農藥殘留和環境污染等問題。隨著人們對綠色食品的需求，生物防治逐漸在病害防控方面體現出其優勢，因此，挖掘可利用的生防菌資源對獼猴桃產業的可持續發展具有重要意義。【前人研究進展】獼猴桃軟腐病是一類真菌病害，不同國家及地區獼猴桃軟腐病病原菌存在明顯差異，主要有擬莖點霉菌（Phomopsis sp.）（Luongo et al.，2011）和葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）（Zhou et al.，2015）等真菌。李黎等（2016）對我國獼猴桃主產區的28個果園樣本進行病原菌分離鑒定，發現擬莖點霉菌（P. lithocarpus）是我國獼猴桃果實軟腐病的主要病原菌，葡萄座腔菌（B. dothidea）和小孢擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsis microspora）是次要病原菌，并且擬莖點霉菌是貴州、四川及江西等地區的主要為害病原菌。近年來，國內外已有學者對獼猴桃病害的生物防治進行了研究，其中針對獼猴桃灰霉病的研究較多（Dodd et al.，2004;Kim et al.，2015），而對獼猴桃軟腐病的研究相對較少。Mohamed等（2011）發現用1-甲基環丙烯預處理后再用解淀粉芽孢桿菌處理可降低冷藏過程中獼猴桃軟腐病的發病率。何應紅等（2016）在青蒿內生真菌中篩選出一株對獼猴桃軟腐病有抑制作用的菌株青蒿21號，并進一步證明其發酵液粗提物對該病原菌的抑菌活性達100%，但并未對菌株進行鑒定。胡容平等（2017）通過木霉與獼猴桃軟腐病菌的對峙培養及其難揮發性代謝產物的拮抗試驗，發現木霉菌株T156-37對獼猴桃軟腐病有較好的抑制效果，抑制率達66.11%，另一株菌株T163-8的代謝產物則表現出對獼猴桃軟腐病菌的拮抗優勢，其抑制率達63.26%。王小潔等（2017）通過平板對峙法篩選發現多粘芽胞桿菌（Paenibacillus polymyxa）對獼猴桃軟腐病菌的菌絲生長和孢子萌發有顯著的抑制作用。【本研究切入點】目前國內外報道用于防治獼猴桃軟腐病的可用生物菌株資源較少，缺少可替代化學農藥的高效生防制劑。為豐富可有效防控獼猴桃軟腐病害的生防微生物種類，進一步為開展生防菌制劑研發提供菌種資源，有必要分離篩選更多不同類型的微生物功能菌。【擬解決的關鍵問題】利用解磷菌的溶磷特性從土壤中選擇分離解磷菌株，并利用平板對峙法、菌落直徑法、繼代培養及發酵液抑菌試驗等從中篩選對獼猴桃軟腐病菌有拮抗作用的菌株，同時通過形態學結合分子生物學方法對拮抗菌株進行鑒定，以期為獼猴桃軟腐病生防制劑研發提供菌種資源。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 供試材料 供試獼猴桃品種為貴長獼猴桃。供試獼猴桃軟腐病病菌為MHTRF160420，2015年10月分離自貴州省修文縣獼猴桃果園所采集的獼猴桃軟腐病果實病樣，保存于貴州省植物保護研究所植物病理研究室。

1. 1. 2 培養基 解磷選擇性培養基：葡萄糖10.00 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.30 g，MgSO4·7H2O 0.30 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4 0.03 g，（NH4）2SO4 0.50 g，磷酸鈣5.00 g，蒸餾水1000 mL，瓊脂15.00～20.00 g，pH 6.8～7.0。木霉培養基：馬鈴薯200.00 g，葡萄糖20.00 g，瓊脂20.00 g，鏈霉素（Streptomytin）0.10 g，氯霉素（Chloramphenicol）0.30 g，玫瑰紅（Rose bengal）0.02 g，蒸餾水1000 mL，自然pH。PD液體培養基：葡萄糖 20.00 g，土豆200.00 g，蒸餾水1000 mL，自然pH。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 獼猴桃軟腐病拮抗菌株的分離與篩選 解磷菌株篩選：在貴州省修文縣中哨村獼猴桃園區（東經106°34′25″，北緯26°47′42″，海拔1314.0±3.0 m）選擇獼猴桃軟腐病等病害發生嚴重的地塊為土樣采集點，利用五點法采集健康植株的根際土壤。將土樣與無菌水以1∶10的比例稀釋，于150 r/min振蕩20 min后制成土壤初懸液備用，按逐級梯度稀釋法制備濃度為10-3、10-4和10-5的懸浮液，在冷凝的解磷選擇性培養基上涂布100 μL土壤懸浮液并置于25 ℃的培養箱中培養，每個濃度重復5板。培養2 d后開始觀察，純化保存有解磷圈產生的菌落，從而分離獲得解磷真菌菌株。

平板對峙法試驗：以獼猴桃軟腐病菌MHTRF 160420為靶標病原菌，分離保存的解磷真菌菌株為待測菌進行平板培養，在PDA培養基兩側分別接種直徑為5 mm的病原菌及待測菌菌餅，25 ℃培養7 d后，計算待測菌的抑制率，抑制率的計算參照梁建根等（2007）的方法，根據菌株抑制率初篩出獼猴桃軟腐病菌拮抗菌株，然后進行抑菌圈復篩。

拮抗菌復篩試驗：將獼猴桃軟腐病菌培養9 d以上待其產孢后，用無菌水洗脫制成1×106 CFU/mL的孢子懸液，按1∶10的比例將其與PDA培養基混勻后倒板，然后在含有病原菌的PDA培養基中央接種初篩拮抗效果較好的菌株，25 ℃黑暗培養，3 d后記錄抑菌圈直徑，篩選出效果最好的拮抗菌株進行下一步試驗。

1. 2. 2 拮抗菌株繼代培養試驗 對篩選獲得的拮抗菌進行繼代培養，根據其生長速率，28 ℃培養條件下每生長3 d為1代，然后于菌落邊緣打取菌塊后繼續培養3 d為第2代，以此類推，繼代培養后獲得第1、5、10、15和20代拮抗菌株，用平板對峙法分別測定拮抗菌不同培養代數的拮抗活性，評估其拮抗性狀的遺傳穩定性。

1. 2. 3 拮抗菌發酵液抑菌活性試驗 將活化好的拮抗菌株接種到PD液體培養基中，25 ℃下150 r/min發酵培養7 d，利用單層無菌紗布過濾掉發酵液中的菌絲塊，將濾液分為兩份，一份放入10000 r/min的離心機中離心3 min，充分離心2次，得到的上清液為不含菌體發酵液，主要含有拮抗菌的次生代謝產物;另一份濾液再過一次無菌單層紗布后，放入3000 r/min的離心機中離心3～5 s，并利用血球計數板將其發酵濾液分生孢子濃度調整為1×106 CFU/mL，獲得的上清液為含有菌體發酵液。以獼猴桃軟腐病菌為指示菌，用菌落直徑法測定拮抗菌兩種發酵液的抑菌特性。

兩種發酵液抑菌活性測定：分別將拮抗菌的兩種發酵液與PDA培養基按體積1∶10的比例混勻后倒板，冷凝后在中央接種獼猴桃軟腐病菌菌餅，以普通PDA培養基為對照，將處理與對照同時放于25 ℃的生化培養箱中培養7 d后，調查獼猴桃軟腐病菌的菌落生長直徑，計算兩種發酵液對獼猴桃軟腐病菌菌絲生長的抑制率，每處理3次重復。

1. 2. 4 拮抗菌發酵液對獼猴桃軟腐病的離體防效測定 取新鮮健康的獼猴桃果實用75%酒精浸泡30～60 s，然后用無菌水浸洗3次，擦干果實表面水分，用接種針過火消毒后刺傷果皮，每果刺孔數相同，待獼猴桃表皮毛軟化后將其分為兩組，一組用1.2.3試驗中制得的無菌發酵液噴霧整個獼猴桃果實后于傷口處接種獼猴桃軟腐病菌菌餅，另一組噴霧無菌水后接種獼猴桃軟腐病菌作為對照，兩組同時放入用無菌紗布保濕的保鮮盒中，用保鮮膜密封保鮮，置于溫度26 ℃、相對濕度90%的恒溫室中12 h光照黑暗交替培養，每處理重復3組，每組設6次重復。3 d后開始觀察獼猴桃的發病情況，7 d后調查獼猴桃軟腐病發病率及拮抗菌發酵液的防治效果。

1. 2. 5 拮抗菌株鑒定 形態學方法鑒定：刮取新生長3 d的菌落邊緣菌絲，用1%葡萄糖溶液制成拮抗菌菌懸液，吸取1滴菌懸液制片并觀察其菌絲形態;將1%葡萄糖溶液倒入平板后用無菌刷洗菌落，制成孢子懸浮液后，吸1滴孢子懸浮液制片并觀察分生孢子形態特征。

分子生物學方法鑒定：在冷凝的PDA培養基上鋪無菌玻璃紙，在培養基中央隔離接種拮抗菌，待菌絲長滿培養皿后，收集約20 mg菌絲體用液氮研磨成粉末加入到15 mL的無菌離心管中，利用生工生物工程（上海）股份有限公司的Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒進行標準步驟抽提獲得拮抗菌DNA備用。PCR擴增和反應體系參照White等（1990）的方法。PCR反應體系25.0 μL：DNA模板1.0 μL，2×Es Taq Master Mix 12.5 μL，上、下游通用引物ITS1和ITS4各1.0 μL，無菌水9.5 μL。系統發育進化樹構建及進化分析：先將測得的拮抗菌株ITS序列在NCBI數據庫中進行相似性檢索，利用拮抗菌株的ITS序列及GenBank相近似真菌的ITS序列在MEGA 7.0中采用ClustalW進行對齊，用Neighbor-joining法構建系統發育進化樹，采用自舉法對其進行檢驗，重復1000次，進而分析拮抗菌株的分類地位。

2 結果與分析

2. 1 解磷拮抗菌株對獼猴桃軟腐病菌的抑菌作用

從獼猴桃根際土樣中分離得到35株解磷真菌菌株，對峙培養結果（表1）顯示，從35株解磷真菌中共篩選出5株對獼猴桃軟腐病菌有拮抗作用且抑菌率超過50.00%的菌株，其中對峙抑菌效果最好的為MHT0308菌株，其對獼猴桃軟腐病菌的抑菌率達87.71%，其次為MHT0946菌株，兩者對獼猴桃軟腐病菌的抑菌率差異不顯著（P>0.05，下同），但均顯著高于其他3株菌株（P<0.05，下同）。5株菌株均能產生抑菌圈，其中MHT0308菌株所產生的抑菌圈最大（圖1），其復篩抑菌圈直徑在培養第3 d時達33.50 mm，而MHT0946菌株復篩第3 d的抑菌圈直徑為24.90 mm（圖2），復篩效果稍差。經對峙初篩及抑菌圈復篩兩次篩選后，最終選擇MHT0308菌株進行后續試驗。

2. 2 MHT0308菌株繼代培養結果

對2.1中篩選獲得拮抗效果最好的MHT0308菌株進行繼代培養，結果（圖3）表明，MHT0308菌株子代拮抗病原菌能力在第10代之前無顯著差異，其對獼猴桃軟腐病的抑制率僅從第1代的87.71%變為第10代的86.64%，第15代開始對獼猴桃軟腐病菌的拮抗能力稍有下降，其抑菌率為85.02%，MHT0308菌株一直繼代培養至20代時仍有較強的拮抗能力，抑菌率為84.92%。試驗結果表明，雖然MHT0308菌株隨著繼代數的增加，其拮抗能力稍有下降，但對獼猴桃軟腐病菌的拮抗能力總體趨于穩定，故可判定MHT0308菌株對獼猴桃軟腐病的拮抗能力遺傳較穩定，有利于菌株的進一步研究和生產實踐應用。

2. 3 MHT0308菌株發酵液的抑菌特性

菌落直徑法測定結果（表2、圖4-a和圖4-b）顯示，MHT0308菌株的含菌和無菌發酵液對獼猴桃軟腐病菌均具有抑制作用，其中含菌發酵液的抑菌效果較好，獼猴桃軟腐病菌受到明顯抑制，其抑菌率為88.13%，而無菌發酵液對獼猴桃軟腐病菌的抑制率也在80.00%以上。表明MHT0308菌株發酵液中產生的某些次生代謝產物具有主要抑菌活性，此特性有利于該菌株的下一步應用研發。

2. 4 MHT0308菌株發酵液對獼猴桃軟腐病的離體防效

MHT0308菌株發酵液對獼猴桃軟腐病的離體防效試驗結果（表3和圖5）表明，其發酵液對獼猴桃軟腐病有明顯的防治效果，噴霧MHT0308菌株發酵液后再接種獼猴桃軟腐病菌處理的發病程度很輕，而未噴霧MHT0308菌株發酵液處理第3 d開始顯癥時，其針刺處仍然光潔無顯癥;第10 d未噴霧MHT0308菌株發酵液處理的病情指數達78.90，且獼猴桃果實開始從里向外軟爛變色，而經MHT0308菌株發酵液處理的獼猴桃果實只有輕微顯癥，其病情指數僅為10.30，對獼猴桃軟腐病的防效達87.00%，且經發酵液處理過的獼猴桃果實連續存放15 d以上不腐爛。可見，MHT0308菌株發酵液對獼猴桃果實軟腐病有防效，可進一步研發作為獼猴桃儲藏期病害的有效生防菌劑。

2. 5 MHT0308菌株鑒定結果

2. 5. 1 形態特征鑒定結果 MHT0308菌株在PDA培養基上菌絲呈放射狀生長，其生長速度快，3 d即可長滿整個培養皿，隨后形成分生孢子且開始產生色素，7 d左右形成正面淺綠色至綠色的菌落，菌落背面顏色較淺，若遇脅迫可產生黃色或黃綠色色素（圖6-a）。菌絲無色，有隔，可生長形成無色分生孢子梗（圖6-b）;其上產生產孢小梗，產孢小梗常對生或輪生形成輪枝狀結構（圖6-c）;上著生大量分生孢子，橢圓形或卵圓形大小，2.2～3.5 μm×2.5～3.2 μm，產生初期無色，后期淺欖黃色或淺欖綠色（圖6-d）。綜上所述，MHT0308菌株的培養性狀及形態學特征與哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）一致。

2. 5. 2 分子生物學鑒定結果 PCR擴增MHT0308菌株的ITS全長序列，大小為580 bp。將測序結果與GenBank中的ITS序列進行BLAST比對分析，結果表明，與其同源性最高的為木霉屬的哈茨木霉真菌及其有性態（Hypocrea lixii），相似性均在99%以上。再根據ITS序列利用MEGA 5.0對同源性較高的序列進行序列分析并構建木霉屬的系統發育進化樹，結果（圖7）顯示，MHT0308菌株與哈茨木霉在同一分支。因此，根據形態學觀察和分子鑒定結果可確定MHT0308菌株為哈茨木霉菌（T. harzianum）。

3 討論

篩選有益微生物對水果等果實類采后病害進行生物防治是國內外近年來的新研究領域。研究表明，酵母菌（Pichia）對梨灰霉病（Botytis cinerea）、桃子根霉腐爛（Rhizopus oryzae）、柑橘和蘋果青霉病（Penicillium sp.）等有很好的防治效果（Lu et al.，2013;Lutc et al.，2013;Xu et al.，2013）;芽孢桿菌（Bacillus）對柑橘的7種不同病原真菌具有抗菌活性，且從中提取出伊草枯菌素A對柑橘采后病害有抑制效果（Arrebola et al.，2009），另外，芽孢桿菌對果實采后炭疽病和擬莖點霉軟腐病、青曲霉病等有防效（Hao et al.，2011;Mohamed et al.，2011）。在前人的研究報道中，針對水果果實采后病害的生防菌資源主要集中在酵母菌和芽孢桿菌等方面，可用于果實采后病害防控的真菌類菌株資源報道相對較少。本研究以西南地區致獼猴桃軟腐病的主要為害病原菌擬莖點霉菌作為靶標病原菌所篩選獲得的MHT0308菌株屬于哈茨木霉真菌，對豐富獼猴桃軟腐病生防菌資源庫及利用木霉菌防治獼猴桃軟腐病具有重要意義。但介于該病害在全國范圍內的致病菌差異較明顯，因此下一步將開展MHT0308菌株對其他地區獼猴桃軟腐致病菌的廣譜拮抗試驗，或在擴大所篩靶標病原菌范圍的基礎上找尋適用范圍更廣的高效生防菌株。

木霉不僅對植物病原真菌具有廣譜拮抗活性，部分還兼具促進植物生長的作用（Altomare et al.，1999），同時可產生許多次生代謝產物如酶類、抗生素或抗菌肽、水溶性化合物等，對病原菌起生防作用（Howell，2002），是一類具有應用價值的有益微生物。本研究的平板對峙中MHT0308菌株對獼猴桃軟腐病病原菌有明顯的競爭和拮抗作用，且其含菌和無菌發酵液對獼猴桃軟腐病菌均有抑制作用，說明該菌株可產生具有抑菌活性的物質。張承等（2016）發現采前噴施殼聚糖與生防菌代謝產物抗菌肽等制成的復合膜對獼猴桃軟腐病的防效達69.23%，提高了果實的抗病性，從而提高了獼猴桃耐貯性。結合MHT0308菌株可產生有效次生代謝產物這一特征，后續將進一步重點研究該菌株的抗菌活性物質，并對抑菌活性物質的有效應用及果實綠色保鮮技術進行探索，從而為利用該菌開發新的生物農藥提供理論指導。

4 結論

篩選出一株對擬莖點霉菌引起的獼猴桃軟腐病有較強抑制作用的菌株MHT0308，根據其形態學特征結合分子生物學鑒定結果，確定MHT0308菌株為哈茨木霉菌（T. harzianum），該菌株對獼猴桃軟腐病有較好的防治效果，可作為一種重要的生防資源菌用于獼猴桃軟腐病防治研究，具有一定的開發潛力。

致謝： 本文在獼猴桃軟腐病病原菌材料方面得到貴州省農業科學院植物保護研究所吳石平老師和黃露老師的大力支持，特此致謝！

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（責任編輯 麻小燕）