超聲波輔助酸酶法提取碎米抗性淀粉工藝的優化

祝水蘭 周巾英 劉光憲 馮健雄 張燦權 楊平

摘要：【目的】優化超聲波輔助酸酶法提取抗性淀粉工藝條件，為碎米抗性淀粉的提取和高值化利用提供技術支持。【方法】以碎米淀粉為原料，抗性淀粉提取率為評價指標，在單因素試驗基礎上，利用Design-Expert 8.05進行響應面分析，并建立二次多項式數學模型，依據回歸分析確定超聲波輔助酸酶法提取抗性淀粉的最優工藝條件。【結果】建立了抗性淀粉提取率（Y）對鹽酸濃度（A）、酶用量（B）、酸解時間（C）和超聲波時間（D）的二次回歸方程：Y=51.99+1.03A+0.93B+0.88C-0.64D-0.55AB+0.58AC-0.73AD+1.12BC+0.56BD+0.52CD-1.25A2-2.28B2-5.24C2-1.60D2。各因素對碎米抗性淀粉提取率的影響排序為鹽酸濃度>酶用量>酸解時間>超聲波時間;酶用量與酸解時間的交互作用對碎米抗性淀粉提取率影響極顯著（P<0.01），鹽酸濃度與超聲波時間的交互作用影響顯著（P<0.05）。超聲波輔助酸酶法提取抗性淀粉最優工藝條件為：鹽酸濃度0.5 mol/L、酶用量3.5 U/g、酸解時間1.5 h、超聲波時間25 min，在此條件下，抗性淀粉提取率為51.99%，與預測值（52.44%）接近。【結論】通過響應面試驗優化的超聲波輔助酸酶法可有效提取碎米抗性淀粉，建立的回歸模型可用于實際生產預測。

關鍵詞： 碎米;超聲波;酸酶法;抗性淀粉提取率;響應面分析

中圖分類號： S511.2; TS201.21? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）08-1814-08

Optimization of ultrasonic-assisted acid enzymatic extraction of resistant starch from broken rice

ZHU Shui-lan， ZHOU Jin-ying， LIU Guang-xian， FENG Jian-xiong，

ZHANG Can-quan*， YANG Ping*

（Jiangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanchang? 330200， China）

Abstract：【Objective】The presented study aimed to optimize the process conditions of ultrasonic-assisted acid and enzymatic extraction of resistant starch and provide technical support for extraction and high-value utilization of resistant starch from broken rice. 【Method】Broken rice starch was used as raw material， and the resistant starch yield was as the evaluation indicator. Based on the results of single factor experiment， response surface analysis by Design-Expert 8.05 software was conducted to establish mathematical models for the extraction process of resistant starch of broken rice， and the optimal protease conditions were determined by regression equation. 【Result】The quadratic regression equation of yield of resistant starch（Y） to hydrochloric acid concentration（A）， enzyme dosage（B）， acidolysis time（C） and ultraso-nic time（D） was established： Y=51.99+1.03A+0.93B+0.88C-0.64D-0.55AB+0.58AC-0.73AD+1.12BC+0.56BD+0.52CD-1.25A2-2.28B2-5.24C2-1.60D2. The effects of various factors on the extraction rate of the order of resistant starch was as fo-llows：the hydrochloric acid concentration>enzyme dosage>acidolysis time>ultrasonic time. The interaction between enzyme dosage and acid hydrolysis time had extremely significant effects on the extraction rate of resistant starch from broken rice（P<0.01）， and the interaction between hydrochloric acid concentration and ultrasonic time had significant effects（P<0.05）. The optimal resistant starch extraction by ultrasonic-assisted acid and enzymatic extraction method was： hydrochloric acid concentration 0.5 mol/L， enzyme adding was 3.5 U/g， acidolysis time 1.5 h and ultrasonic time 25 min. Under this condition， the extraction rate of resistant starch was 51.99%， which was similar to the theoretical value（52.44%）. 【Conclusion】The ultrasonic-assisted acid and enzymatic extraction process optimized by response surface test can effectively extract the resistant starch from broken rice. The established regression model can be used to predict the actual production.

Key words： broken rice; ultrasonic; acid and enzyme method; resistant starch yield; response surface

0 引言

【研究意義】大米抗性淀粉是以大米淀粉為基質的天然存在或人工制備的抗性淀粉。抗性淀粉（Resistant starch，RS）是一種抗消化性淀粉，健康者小腸中不吸收的淀粉及降解物（張志英和沈建福，2005）。其具有特殊生理功能，可控制體重、抗癌、預防糖尿病、調節血脂、促進礦物質吸收及提高膳食纖維成分等（Topping and Clifton，2001;蔣展，2014），并廣泛應用于主食制品、焙烤食品、蒸煮食品、保健食品、發酵制品及飲料中。因此，研究碎米抗性淀粉的提取工藝，對改善膳食纖維對產品口感、外觀等影響和提高大米加工產品的附加值及經濟效益均具有重要意義。【前人研究進展】國內外學者對大米抗性淀粉提取方法進行了不少研究，劉一洋（2010）利用酸酶結合沸水浴提取抗性淀粉，獲得最高提取率為24.31%;周穎等（2014）以大米淀粉為原料、α-淀粉酶和普魯蘭酶為酶制劑，利用單因素試驗研究得到大米抗性淀粉制備條件：pH 5.5、溫度80 ℃、反應時間40 min、酶用量4 U/g，抗性淀粉得率為45.2%;許詩堯（2016）以大米粉為原料，考察了壓熱法、濕熱法和韌化法處理對大米粉抗性淀粉含量的影響，結果表明，3種處理均能提高大米粉中的抗性淀粉含量，其中壓熱處理大米粉的抗性淀粉含量最高，可達12.70%;楊帆等（2018）研究超聲波—濕熱法結合酸水解制備大米RS3型抗性淀粉的最佳工藝條件，結果表明，大米淀粉含水量30%、處理溫度130 ℃、處理時間10 h，RS3型抗性淀粉得率為32.173%，在此基礎上結合酸水解的最佳工藝條件（檸檬酸濃度0.15 mol/L、加熱時間20 min、老化時間24 h），RS3型抗性淀粉得率為40.672%;Jeong和Shin（2018）通過酸水解法從糯米淀粉中提取獲得抗性淀粉。【本研究切入點】目前利用響應面優化超聲波—酸酶水浴結合提取碎米抗性淀粉工藝的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】通過單因素試驗和響應面試驗優化碎米抗性淀粉的提取工藝，為碎米抗性淀粉的提取利用提供技術支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

碎米淀粉為自制，純度高，淀粉含量88%;普魯蘭酶（1000 ASPU/g）購自江蘇銳陽生物科技有限公司，鹽酸、冰乙酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀和二水合氯化鈣等均為國產分析純。主要儀器設備：FS1000Y-3搖擺式粉碎機（廣州雷邁機械設備有限公司）、UP250型超聲波細胞粉碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）、B-260型恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）、SHA-B型水浴恒溫振蕩器（常州潤華電器有限公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 碎米抗性淀粉制備 準確稱取碎米淀粉20 g，加入一定濃度的鹽酸溶液，調成固液比1∶4（g/mL），用超聲波細胞粉碎儀輔助振蕩一定時間，在水溫30 ℃時鹽酸酸解一定時間，加入4%氫氧化鈉溶液，調pH至7，再加0.1%檸檬酸調pH至5，加入普魯蘭酶，在60 ℃水浴條件下水解4 h，取出加入4%氫氧化鈉溶液5 mL終止反應，離心，自然冷卻，放入4 ℃冰箱回生24 h，之后取出置于50 ℃烘箱烘干，粉碎制得抗性淀粉。

1. 2. 2 抗性淀粉提取單因素試驗

1. 2. 2. 1 鹽酸濃度 固定水浴時間4 h、酶解溫度60 ℃和酶解時間3 h，控制超聲波時間20 min、酸解時間1.5 h和普魯蘭酶用量4.0 U/g，調控鹽酸濃度分別為0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 mol/L，考察鹽酸濃度對碎米抗性淀粉提取率的影響。

1. 2. 2. 2 超聲波時間 固定水浴時間4 h、酶解溫度60 ℃和酶解時間3 h，控制鹽酸濃度0.5 mol/L、酸解時間1.5 h和普魯蘭酶用量4.0 U/g，調控超聲波時間分別為10、15、20、25和30 min，考察超聲波時間對碎米抗性淀粉提取率的影響。

1. 2. 2. 3 酸解時間 固定水浴時間4 h、酶解溫度60 ℃和酶解時間3 h，控制鹽酸濃度0.5 mol/L、超聲波時間20 min和普魯蘭酶用量4.0 U/g，調控酸解時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h，考察酸解時間對碎米抗性淀粉提取率的影響。

1. 2. 2. 4 酶用量 固定水浴時間4 h、酶解溫度60 ℃和酶解時間3 h，控制鹽酸濃度0.5 mol/L、超聲波時間20 min和酸解時間1.5 h，調控普魯蘭酶用量分別為2.5、3.0、3.5、4.0和4.5 U/g，考察酶用量對碎米抗性淀粉提取率的影響。

1. 2. 3 響應面優化 在單因素試驗的基礎上，通過SPSS 19.0進行方差分析，選擇對抗性淀粉提取率有顯著影響的因素，根據Box-Behnhen中心組合試驗設計原理（陳勝軍等，2018），以抗性淀粉提取率為評價指標進行響應面試驗，進一步優化碎米抗性淀粉提取工藝。響應面因素水平設計如表1所示。

1. 2. 4 抗性淀粉提取率計算 根據NY/T 2638—2014《稻米及制品中抗性淀粉的測定》對抗性淀粉進行測定，計算公式如下：

E=[mM×ω]×100

式中，E為抗性淀粉提取率（%），m為純抗性淀粉樣品質量（g），M為樣品質量（g），ω為總淀粉含量（%）。

1. 3 統計分析

所有試驗均重復3次，數據分析采用平均值。采用Excel 2007作圖，Design-Expert 8.05對試驗數據進行響應曲面分析。

2 結果與分析

2. 1 單因素試驗結果

2. 1. 1 鹽酸濃度對抗性淀粉提取率的影響 由圖1可看出，鹽酸濃度從0.2 mol/L到0.5 mol/L遞變時，碎米抗性淀粉提取率逐漸增加，在0.5 mol/L時達最大值（49.99%）。鹽酸濃度0.4、0.5和0.6 mol/L的抗性淀粉提取率間無顯著差異（P>0.05，下同），但三者均與鹽酸濃度0.2和0.3 mol/L的抗性淀粉提取率存在顯著差異（P<0.05，下同）。這是由于鹽酸濃度增加，水解作用加強，酸可以水解破壞淀粉鏈的結構，淀粉顆粒破裂溶出較多直鏈淀粉，增加分子間距離，有利于結晶，使抗性淀粉提取率增加，但增加至一定程度后會達到平衡。綜合考慮，提取碎米抗性淀粉的最適鹽酸濃度為0.5 mol/L。

2. 1. 2 超聲波時間對抗性淀粉提取率的影響 由圖2可看出，超聲波時間從10 min到30 min遞變時，碎米抗性淀粉提取率逐漸增加，超聲波時間20、25和30 min的抗性淀粉提取率間無顯著差異，但三者與超聲波時間10和15 min存在顯著差異。超聲波通過機械斷裂和空化效應能破壞和改變淀粉的結構及性質（Iida et al.，2008;Luo et al.，2008;Jambrak et al.，2010），促進分子間聚合形成抗性淀粉。超聲波時間對淀粉分子結構也有重要影響，作用時間越長，淀粉顆粒的破壞程度越大（余世鋒等，2013）。由于超聲波可引發聚合物降解，促使淀粉鏈斷裂，導致抗性淀粉提取率增加。但隨作用時間增加，上述作用效應不能無限增加，當作用時間達25 min后，抗性淀粉提取率增加平緩。綜合考慮，提取碎米抗性淀粉的最適超聲波時間為25 min。

2. 1. 3 酸解時間對抗性淀粉提取率的影響 由圖3可看出，酸解時間從0.5 h到2.5 h遞變時，抗性淀粉提取率逐漸增加，酸解時間在1.5、2.0和2.5 h時，抗性淀粉提取率間無顯著差異，但三者與酸解時間0.5和1.0 h存在顯著差異。在酸解過程中，酸解時間能提高抗性淀粉提取率，隨著酸解時間的延長，淀粉分子鏈被充分水解，直鏈淀粉被游離出來，碎米淀粉能更充分發生脫支化反應，提高碎米抗性淀粉的形成（劉一洋，2010）。但酸解到一定時間后增加平緩，所以選擇酸解時間為1.5 h。

2. 1. 4 酶用量對抗性淀粉提取率的影響 從圖4可看出，酶用量從2.5 U/g到3.5 U/g遞變時，碎米抗性淀粉提取率逐漸增加，在酶用量3.5 U/g時達最大值（50.32%），酶用量從3.5 U/g到4.5 U/g遞變時抗性淀粉提取率逐漸降低。酶用量3.0～4.5 U/g的抗性淀粉提取率間無顯著差異，但酶用量3.5 U/g的抗性淀粉提取率與酶用量2.5 U/g存在顯著差異。由于普魯蘭酶具有很強的脫支活性，能同時在淀粉分子內部和外部隨機切開α-1，6糖苷鍵（余世鋒等，2015），當酶用量少時，淀粉切斷不完全，黏度大，不利于直鏈淀粉結晶;酶用量增加，直鏈淀粉分子數量會增加;普魯蘭酶添加量過高，則因脫支過度而形成過短的直鏈淀粉，在回生過程中較難聚集重結晶形成抗性淀粉。因此，選擇酶用量3.5 U/g為宜。

2. 2 響應面結果分析

2. 2. 1 回歸方程及參數分析 從圖1～圖4可發現，上述4個因素對碎米抗性淀粉的提取率均有顯著影響。因此，選擇這4個因素為自變量，以抗性淀粉提取率（Y）為考察指標進行響應面試驗，結果見表2。通過Design-Expert 8.05對表2的試驗結果進行擬合分析，得到二次回歸方程：Y=51.99+1.03A+0.93B+0.88C-0.64D-0.55AB+0.58AC-0.73AD+1.12BC+0.56BD+0.52CD-1.25A2-2.28B2-5.24C2-1.60D2。

對回歸方程進行方差分析，結果（表3）表明，該回歸模型P<0.01，表明二次方程擬合極顯著，失擬項P=0.9732>0.05不顯著，說明該回歸方程對試驗擬合情況好，對試驗干擾少。根據F大小，各因素對碎米抗性淀粉提取率影響順序為鹽酸濃度（A）>酶用量（B）>酸解時間（C）>超聲波時間（D）;根據P變化可知，A、B、C、D、A2、B2、C2、D2和BC對抗性淀粉提取率影響極顯著（P<0.01），AD對抗性淀粉提取率影響顯著。

2. 2. 2 響應曲面三維圖和等高線分析 采用Design-Expert 8.05對表2數據進行回歸擬合，并繪制響應面圖和等高線圖，其結果如圖5～圖10所示，反映了任意兩個變量取零水平時，其他兩個自變量之間交互作用對碎米抗性淀粉提取率的影響程度。從擬合的響應面可直觀看出各因素間的交互作用，曲面圖的陡峭程度代表各因素對抗性淀粉提取率的影響程度;響應面坡度越陡，說明該因素影響較大。從圖5～圖10可看出，AD和BC響應面坡度較陡，而AB、AC、BD和CD響應面坡度較平緩，說明鹽酸濃度與超聲波時間、酶用量與酸解時間的交互作用對碎米抗性淀粉提取率影響顯著，而鹽酸濃度與酶用量、鹽酸濃度與酸解時間、酶用量與超聲波時間、酸解時間與超聲波時間的交互作用對抗性淀粉提取率影響不顯著;鹽酸濃度響應面的陡峭程度大于酶用量、酸解時間和超聲波時間，酶用量的陡峭程度大于酸解時間和超聲波時間，酸解時間的陡峭程度大于超聲波時間，說明鹽酸濃度對抗性淀粉提取率的影響最大，其次為酶用量和酸解時間，超聲波時間對抗性淀粉提取率的影響最小，與表3的方差分析結果一致，表明回歸模型的可靠性與真實性。

2. 3 提取工藝優化及驗證試驗結果

采用Design-Expert 8.05對回歸模型進行分析，獲得最佳工藝參數為：鹽酸濃度0.55 mol/L、酶用量3.57 U/g、酸解時間1.56 h、超聲波時間23.65 min，碎米抗性淀粉提取率的預測值為52.44%。為實際操作方便，將最佳參數調整為：鹽酸濃度0.5 mol/L、酶用量3.5 U/g、酸解時間1.5 h、超聲波時間25 min，在此條件下提取率為51.99%，與理論預測值相差0.86%，說明該回歸模型用于提取碎米抗性淀粉是可靠的。

3 討論

抗性淀粉的制備方法主要有壓熱處理法、酸解脫支法、螺桿擠壓法、酶解脫支法、微波膨化處理、超聲波輔助法等（楊小玲等，2017）。余世鋒等（2015）以大米淀粉為原料，比較了α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和普魯蘭酶對大米RS3型抗性淀粉得率的影響，結果表明，普魯蘭酶影響最顯著，在普魯蘭酶添加量為40 μL/g淀粉、酶解12 h、淀粉濃度20%的條件下，大米RS3型抗性淀粉得率最高為20.57%，但純酶法提取抗性淀粉的酶用量大，提取成本高，提取率較低。葉文峰和周秀玲（2015）以新鮮腳板薯為主要原料，采用超聲波及酸處理粗淀粉制備抗性淀粉，得出制備抗性淀粉的最佳工藝條件：配制濃度為15%的淀粉乳，加入2 mol/L鹽酸用量1.5%，在超聲波溫度80 ℃、超聲波時間40 min條件下進行酸水解，制備的抗性淀粉得率為25.3%，但此法鹽酸濃度和超聲波溫度高，抗性淀粉得率低;余世鋒等（2013）以大米淀粉為原料，研究了超聲處理對大米RS3型抗性淀粉得率的影響，結果表明，在最佳制備工藝條件（超聲波功率200 W、超聲波時間30 min、淀粉乳濃度60%、糊化溫度120 ℃）下，大米RS3型抗性淀粉產率最高為12.87% ，其使用的超聲設備是JBT/C-YCL400T/3PD超聲波藥品處理機，糊化溫度高，抗性淀粉提取率低。

本研究以碎米淀粉為原料，通過超聲波細胞粉碎儀輔助，采用向淀粉懸浮液中加入普魯蘭酶和鹽酸，以抗性淀粉提取率為考察指標，響應面優化抗性淀粉提取條件，在鹽酸濃度0.5 mol/L、酶用量3.5 U/g、酸解時間1.5 h、超聲波時間25 min條件下得到抗性淀粉提取率為51.99%，較純酶法（余世鋒等，2015）用酶量少，較酸解法（葉文峰和周秀玲，2015）的鹽酸濃度低，用時縮短。這是由于超聲波空化效應加速溶劑與聚合物分子間的摩擦作用，提高脫支酶的酶解速率和無機鹽的降解作用，縮短提取時間，減少酸酶用量，使淀粉水解得到更多游離的直鏈分子，再通過雙螺旋相互締結，形成高抗性晶體結構，從而提高抗性淀粉提取率。本研究獲得的碎米抗性淀粉提取率高于趙力超等（2013）采用壓熱法獲得的抗性淀粉得率（20.1%），說明超聲波細胞粉碎儀提取抗性淀粉比壓熱法優越;相比于姜志杰等（2017）添加磷酸2.0%提取抗性淀粉的得率25.95%高，可能是由于鹽酸水解速率強于磷酸。可見，本研究采用超聲波細胞粉碎儀輔助酸酶法提取碎米抗性淀粉具有明顯優勢，酶用量少，鹽酸濃度低，超聲波時間短，抗性淀粉提取率高等。

4 結論

通過單因素試驗和響應面分析法優化的超聲波輔助酸酶法（鹽酸濃度0.5 mol/L、酶用量3.5 U/g、酸解時間1.5 h、超聲波時間25 min）可有效提取碎米抗性淀粉，酶用量少，用時縮短，提取率較高，建立的回歸模型能較好地預測碎米抗性淀粉提取率。

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（責任編輯 羅 麗）