黑尾葉蟬RNAi途徑關鍵蛋白AGO2多克隆抗體制備及應用

李歌 董旭 危婉婷 葉彥杰 蘭漢紅

摘要：【目的】制備效價高且特異性強的黑尾葉蟬RNAi途徑關鍵蛋白Argonaute 2（AGO2）多克隆抗體，為進一步研究AGO2蛋白在葉蟬RNAi免疫途徑中的調控功能及作用機制提供技術支持。【方法】通過RT-PCR從黑尾葉蟬基因組擴增出AGO2基因的功能片段，與原核表達質粒pET-28a重組構建重組質粒，然后轉化大腸桿菌BL21感受態細胞進行誘導表達;以純化的AGO2融合蛋白免疫雄性新西蘭大白兔獲得高效價的多克隆抗體，并以多克隆抗體為一抗，采用Western blotting檢測AGO2蛋白在健康和帶毒黑尾葉蟬中的表達情況。【結果】RT-PCR擴增獲得的黑尾葉蟬AGO2基因片段為1635 bp，構建的pET-AGO2重組質粒能在BL21感受態細胞中成功表達出AGO2融合蛋白，其最適表達條件：溫度28 ℃，IPTG濃度0.5 mmol/L，誘導時間5 h，搖床轉速220 r/min。以純化AGO2融合蛋白免疫雄性新西蘭大白兔獲得的多克隆抗體效價為1∶106，抗體濃度約350 μg/mL。Western blotting檢測結果表明，AGO2蛋白在健康和水稻矮縮病毒（RDV）感染黑尾葉蟬中均有表達，但與健康黑尾葉蟬相比，AGO2蛋白在RDV感染黑尾葉蟬中的表達水平更高，即RDV侵染能提高AGO2蛋白的表達水平。【結論】制備獲得的黑尾葉蟬RNAi途徑關鍵蛋白AGO2多克隆抗體具有高純度和高效價，且特異性強，可用于檢測AGO2蛋白在病毒感染黑尾葉蟬中的表達水平，進而揭示AGO2蛋白在介體昆蟲RNAi途徑中的功能機制。

關鍵詞： 水稻矮縮病毒（RDV）;黑尾葉蟬;RNAi;AGO2蛋白;多克隆抗體;效價

0 引言

【研究意義】黑尾葉蟬（Nephotetlix cincticeps）是熱帶亞熱帶地區的主要水稻害蟲之一，通過刺吸植物韌皮部而導致水稻枯萎及葉片褪綠（戴仁懷和倪琳，2011），除了影響水稻生長發育外，還通過持久增殖型方式傳播水稻矮縮病毒（Rice dwarf vrirus，RDV）（Chen et al.，2011），但至今尚未研發出防治該蟲害的特效藥劑及有效策略。已有研究運用深度測序技術從水稻黑條矮縮病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）和水稻條紋病毒（Rice stripe virus，RSV）侵染的灰飛虱（Xu et al.，2012;Li et al.，2013）、南方水稻黑條矮縮病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV）侵染的白背飛虱或灰飛虱（蘭漢紅等，2015;Lan et al.，2015，2016）及水稻瘤矮病毒（Rice gall dwarf virus，RGDV）侵染的電光葉蟬（Lan et al.，2016）中檢測出大量病毒來源的siRNA（small interference RNA），并證實通過干擾Argonaute 2基因（AGO2）的表達能顯著提高病毒在介體昆蟲內的增殖水平，即AGO2蛋白組分在RNA干擾（RNA interference，RNAi）抗病毒免疫過程中發揮重要作用。因此，加強介體昆蟲黑尾葉蟬RNAi免疫反應及其與水稻病毒互作方面的研究將有助于制定有效的防治措施。【前人研究進展】由small RNA介導的RNAi是生物體內保守且重要的抗病毒免疫反應。根據small RNA生成機制可將RNAi途徑分為small interference RNA（siRNA）、microRNA（miRNA）和PIWI-interacting RNA（piRNA）3種通路類型（Karlikow et al.，2014）。在siRNA途徑中，Dicer2（DCR2）識別并切割長的雙鏈RNA（dsRNA）為21 nt siRNA，而siRNA與AGO2結合形成RNA誘導的沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC），最終沉默外源病毒等病原物基因的表達（Ding，2010）。在miRNA途徑中，Dicer1（DCR1）切割單鏈RNA（ssRNA）形成的莖環結構雙鏈區，生成的22 nt miRNA與Argonaute 1（AGO1）結合形成RISC，通過沉默內源基因表達而調節生物機體的生長發育過程（Lee et al.，2004）。piRNA途徑發現于果蠅和小鼠等的生殖細胞中，在該途徑中，非Dicer依賴生成的piRNA與Argonaute亞家族蛋白Piwi結合形成RISC，從而抑制轉座子移動（Bronkhorst and van Rij，2014）。可見，siRNAs、miRNAs和piRNAs 3種small RNA均需與AGO蛋白結合形成RISC復合物后才能進行目標基因沉默，即AGO蛋白是RNAi的核心成分之一。AGO蛋白家族較大，且其功能較復雜。現已發現果蠅有5種AGO蛋白，秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）有27種AGO蛋白，人類有8種AGO蛋白，水稻有18種AGO蛋白，擬南芥（Arabidopsis thaliana）有10種AGO蛋白（Vaucheret，2008）。其中，果蠅的AGO2蛋白、擬南芥的AGO1和AGO7蛋白及栗疫病菌的AGO2蛋白功能缺失后，其抗病毒免疫活性喪失（van Rij et al.，2006;Qu et al.，2008），說明在昆蟲、植物和真菌中AGO蛋白介導的沉默對于抗病毒免疫起關鍵作用。至今，在血吸蟲（Schistosoma japonicum）、家蠶（Bombyx mori）、綠僵菌（Metarhizium anisopliae）和水稻等物種中已有AGO蛋白抗體制備及檢測應用的研究報道（楊燕萍等，2010;汪章勛等，2013;程小玲和楊加偉，2014;朱兵等，2018）。【本研究切入點】葉蟬和飛虱是引發水稻病害的主要介體昆蟲，但由于缺乏針對葉蟬或飛虱AGO2蛋白的適當抗體，進而阻礙了介體昆蟲AGO2蛋白在RNAi天然免疫途徑中的功能及機制研究。【擬解決的關鍵問題】克隆黑尾葉蟬RNAi途徑中的AGO2基因，經大腸桿菌BL21原核表達獲得黑尾葉蟬AGO2融合蛋白并免疫新西蘭大白兔以獲得效價高且特異性強的多克隆抗體，為進一步研究AGO2蛋白在葉蟬RNAi免疫途徑中的調控功能及作用機制提供技術支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α和BL21感受態細胞及原核表達質粒pET-28a由閩南師范大學生物科學與技術學院保存提供;總RNA、質粒和核酸抽提純化試劑盒、DNA Marker和蛋白分子量標準品等購自天根生化科技（北京）有限公司;限制性內切酶、T4連接酶、反轉錄試劑盒和Taq DNA聚合酶均購自美國Thermo Fisher Scientific公司;弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑購自美國Sigma-Aldrich公司;鼠源6×His單抗購自美國Proteintech Group公司;HRP標記羊抗兔免疫球蛋白和TMB底物顯色試劑購自天根生化科技（北京）有限公司;聚偏二氟乙烯膜購自美國Millipore公司。

1. 2 載體構建

根據黑尾葉蟬AGO2基因序列，以Primer Premier 5.0設計特異性引物（AGO2-F：5'-TTTTGGATC CATGAACACTCGGCGAATCTAC-3';AGO2-R：5'-TTTTGCGGCCGCTTACTCCAAATAGACTCTTCC-3'）進行RT-PCR。RT反應體系20.0 μL：RNA 0.1 μg，AGO2-R 2.0 μL，RT Buffer 4.0 μL，M-MLV反轉錄酶1.0 μL，ddH2O補足至20.0 μL。反轉錄程序：70 ℃ 10 min，42 ℃ 1 h，70 ℃ 10 min。PCR反應體系50.0 μL：cDNA模板2.0 μL，AGO2-F和AGO2-R各2.0 μL，dNTPs 5.0 μL，Taq DNA聚合酶1.0 μL，ddH2O補足至50.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性3 min;94 ℃ 60 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，進行35個循環;72 ℃延伸60 s。RT-PCR產物與表達載體pET-28a分別用BamH ?和Not I進行雙酶切，酶切產物凝膠回收后以T4連接酶連接，然后轉化DH5α感受態細胞。提取重組質粒，以引物AGO2-F/AGO2-R進行PCR驗證并測序，陽性重組質粒命名為pET-AGO2。

1. 3 AGO2基因原核表達、鑒定及純化

pET-AGO2重組質粒測序正確后轉化BL21感受態細胞并涂布LB培養基上進行培養，挑取單克隆接種到LB液體培養基（含50 μg/mL Kan）中，28 ℃振蕩培養12 h。第2 d按1%稀釋后置于28 ℃搖床擴培至對數期，OD600為0.6～0.8，添加適量誘導劑IPTG（0、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 mmol/L），28 ℃振蕩培養5 h。誘導表達產物離心收集菌體，用超聲波裂解后進行SDS-PAGE電泳（分離膠濃度12%，濃縮膠濃度5%），確定最佳IPTG誘導濃度。

pET-AGO2重組質粒帶有6×His標簽，因此可用His抗體鑒定融合蛋白是否表達。pET-AGO2重組質粒經IPTG誘導表達后離心收集菌體，以超聲波破碎細胞，收集蛋白進行Western blotting檢測。Western blotting檢測是以抗6×His抗體為一抗、辣根過氧化物酶HRP標記抗體為二抗，鑒定AGO2蛋白是否融合組氨酸標簽。誘導表達的融合蛋白經純化系統AKTA Prime 100的Ni2+-NTA瓊脂糖親和層析純化后，采用SDS-PAGE電泳檢測收集蛋白的純度。

1. 4 抗血清制備、純化及效價測定

誘導表達的AGO2融合蛋白純化后以適量弗氏完全佐劑進行乳化（1.0 mg），蛋白乳化后注射5月齡雄性新西蘭大白兔1次;加強免疫注射時以不完全佐劑乳化蛋白且蛋白量減半，每隔15 d加強免疫1次，共加強免疫5次。采集血樣室溫靜置2 h后4 ℃冰箱保存過夜，待血液凝塊收縮，5000 r/min離心15 min，收集血清，-80 ℃保存備用。

取適量CNBr-activated Sepharase 4B干粉制備純化柱后，4 ℃下解凍血清，并將凍存管中的Beads轉移至純化柱內。按照說明取適量血清，4 ℃下3500 r/min離心20 min，吸出油脂;將處理好的血清與對應的蛋白Beads一起孵育，室溫孵育2 h或4 ℃孵育過夜;孵育完成后用PBS洗滌3次;再以預冷的洗脫液（pH 2.5）洗脫，每次收集1.0 mL，EP管中預先加入50.0 μL中和液;將收集的低濃度抗體用PrA濃縮;純化好的抗體加入10%甘油，-20 ℃保存。

采用ELISA檢測純化前后抗血清的抗體效價。將抗血清按照 1∶500、1∶2000、1∶5000、1∶104、1∶105和1∶106進行稀釋，室溫下一抗孵育1 h、二抗孵育45 min，顯色反應20 min，以酶標儀于450 nm處測量吸光值。其中，陰性對照為AGO2融合蛋白免疫大白兔前所采血。

1. 5 AGO2蛋白在健康和帶毒黑尾葉蟬中的表達情況

取健康和RDV感染的黑尾葉蟬各200頭，用液氮研磨后，添加1.0 mL蛋白提取液;混勻后4 ℃下振蕩提取20 min;然后4 ℃下12000 r/min離心15 min，收集上清液即獲得昆蟲總蛋白，分裝后-80 ℃保存備用。提取的昆蟲蛋白樣品經SDS-PAGE電泳后轉移至PVDF膜，以1∶106倍比稀釋的AGO2免疫球蛋白為一抗、辣根過氧化物酶HRP標記抗體為二抗，采用Western blotting檢測AGO2蛋白在健康和RDV感染黑尾葉蟬中的表達情況。

2 結果與分析

2. 1 黑尾葉蟬AGO2基因擴增及表達載體構建

以黑尾葉蟬總RNA為模板、AGO2-F/AGO2-R為引物，RT-PCR擴增黑尾葉蟬AGO2基因，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示擴增獲得的目的片段約1600 bp（圖1），與預期結果一致。RT-PCR產物與表達載體pET-28a經BamH I和Not I雙酶切后重組獲得pET-AGO2重組質粒，以其轉化DH5α感受態細胞，隨機挑取PCR鑒定呈陽性的單菌落提取質粒，采用BamH I和Not I進行雙酶切驗證，結果顯示pET-AGO2重組質粒可酶切獲得與RT-PCR擴增產物大小一致的目的條帶（圖1），約1600 bp。pET-AGO2重組質粒送至深圳華大基因股份有限公司測序，測序結果表明黑尾葉蟬AGO2基因為1635 bp，進一步驗證表達載體構建成功。

2. 2 AGO2融合蛋白的表達、鑒定及純化

預試驗結果表明，AGO2融合蛋白在BL21感受態細胞中表達的適合溫度約28 ℃、誘導時間約5 h、搖床轉速220 r/min。為進一步明確AGO2融合蛋白在BL21感受態細胞中表達的最適IPTG濃度，分別在0（對照）、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 mmol/L 6個IPTG濃度下進行誘導表達，結果（圖2）顯示，IPTG濃度為0.5 mmol/L時AGO2融合蛋白表達量最高。即AGO2融合蛋白在大腸桿菌中表達的最適條件：溫度28 ℃，IPTG濃度0.5 mmol/L，誘導時間5 h，搖床轉速220 r/min。此外，Western blotting檢測結果顯示，鼠源6×His單抗能特異結合His標簽（圖3），表明AGO2融合蛋白在BL21感受態細胞中正確表達。

AGO2融合蛋白主要以可溶性的形式進行表達，經超聲波破碎后的上清液經Ni2+-NTA瓊脂糖親和層析純化，收集洗脫液進行SDS-PAGE電泳，結果表明融合蛋白純度約95%（圖4）。純化AGO2融合蛋白再經透析袋透析處理，其終濃度為3.0 mg/mL。

以純化AGO2融合蛋白免疫雄性新西蘭大白兔獲得的多克隆抗血清按不同比例稀釋后作為一抗進行ELISA檢測，結果顯示，陰性對照（免疫前抗血清）無顏色反應，免疫獲得的多克隆抗血清按不同比例稀釋后均有顏色反應（圖5），能檢測到抗原抗體特異結合所呈顏色反應的最大稀釋比為1∶106，即多克隆抗體效價為1∶106。

多克隆抗體經親和配體純化后，以ELISA檢測其抗體效價，結果顯示，陰性對照（純化后的免疫前抗血清）無顏色反應，而純化后按不同比例稀釋的多克隆抗體均有顏色反應，純化多克隆抗體效價也為1∶106。多克隆抗體純化過程中獲得的洗脫液顏色反應較微弱（圖5），表明大部分抗體能與親和配體結合后得以純化，經測定多克隆抗體濃度約350 μg/mL。此外，純化后的多克隆抗體經SDS-PAGE電泳能檢測到抗體免疫球蛋白的單一重鏈，進一步說明制備獲得的多克隆抗體純度較高。

2. 3 多克隆抗體檢測黑尾葉蟬AGO2蛋白表達水平的效果

采用制備的多克隆抗體檢測AGO2蛋白在健康和RDV感染黑尾葉蟬中的表達水平，Western blo-tting檢測結果表明，AGO2蛋白在健康和RDV感染黑尾葉蟬中均有表達（圖6）;但與健康黑尾葉蟬相比，AGO2蛋白在RDV感染黑尾葉蟬中的表達水平更高，即RDV侵染能提高AGO2蛋白的表達水平，也表明AGO2融合蛋白免疫新西蘭大白兔后制備獲得的多克隆抗體特異性強，可用于后續研究。

3 討論

AGO蛋白是RNAi途徑中沉默RISC的核心成分之一（Ding，2010），在RNAi途徑中發揮著不可替代的作用（Guo et al.，2019）。葉蟬和飛虱都是熱帶亞熱帶地區水稻的主要害蟲，但由于受到基因組背景的限制，葉蟬和飛虱究竟具有幾種AGO蛋白尚不清楚。此外，目前雖已有研究報道黑尾葉蟬、灰飛虱和白背飛虱RNAi途徑中AGO2基因在調控水稻病毒侵染時發揮重要作用（蘭漢紅，2015;Lan et al.，2015，2016），但AGO2的相關作用機制也尚未明確。因此，制備黑尾葉蟬AGO2抗體有利于進一步探討AGO蛋白的生物學功能及其在RNAi途徑中發揮的作用，為從分子水平揭示其作用機理打下基礎。

抗體制備是研究目的基因轉錄和表達等特性、蛋白間相互作用、蛋白亞細胞定位及蛋白生物學功能的基礎（Wootla et al.，2014）。目前，利用重組蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體的方法成熟、過程簡單，且制備周期短（賈慧娜和羅海玲，2012），因此已得到推廣應用。成功制備抗體的關鍵在于選擇合適的蛋白抗原區段，而抗原區段的選擇主要以親水性、疏水性、可及性、抗原性、可塑性、二級結構預測和電荷分布等為參考，其中親水性和可及性是形成抗原表位的首要條件（Tiller and Tessier，2015）。本研究通過分析黑尾葉蟬AGO2蛋白分子的抗原指數、可及性、親水性和疏水性等特性，選取抗原指數較高的304～846 aa區段作為抗原，構建原核表達載體并進行高效表達，獲得的AGO2融合蛋白經Ni2+-NTA瓊脂糖親和層析純化后作為抗原免疫雄性新西蘭大白兔，成功制備獲得黑尾葉蟬AGO2多克隆抗體，且證實制備獲得的AGO2多克隆抗體純度較高，其濃度和效價分別為350 μg/mL和1∶106。

葉蟬是目前水稻生產中的重大害蟲，但尚缺乏有效的防治措施（Lan et al.，2016）。在家蠶、血吸蟲、綠僵菌、水稻及擬南芥等物種（楊燕萍等，2010;汪章勛等，2013;程小玲和楊加偉，2014;朱兵等，2018）雖有AGO蛋白抗體制備及應用的相關報道，但很少將其應用于AGO蛋白作用機理研究。本課題組前期的研究表明，干擾飛虱或葉蟬AGO2基因表達后，水稻病毒在介體昆蟲內的復制增殖水平顯著提高（Xu et al.，2012;Li et al.，2013;蘭漢紅等，2015），暗示飛虱或葉蟬AGO2蛋白組分在RNAi抗病毒免疫中發揮重要作用。本研究利用制備獲得的高效價AGO2多克隆抗體，通過Western blotting檢測得知AGO2蛋白在健康和RDV感染黑尾葉蟬中均有表達，但在RDV感染黑尾葉蟬中的表達水平更高，與RDV感染能提高AGO2轉錄水平的結論（蘭漢紅，2015）一致。這也進一步證實黑尾葉蟬RNAi免疫途徑中AGO2蛋白在與RDV的互作過程中發揮了重要作用。此外，利用制備獲得的AGO2多克隆抗體將有助于揭示RNAi途徑的具體作用機制，從而找到防治黑尾葉蟬的有效辦法或靶點。

4 結論

制備獲得的黑尾葉蟬RNAi途徑關鍵蛋白AGO2多克隆抗體具有高純度和高效價，且特異性強，可用于檢測AGO2蛋白在病毒感染黑尾葉蟬中的表達水平，進而揭示AGO2蛋白在介體昆蟲RNAi途徑中的功能機制。

參考文獻：

程小玲，楊加偉. 2014. 水稻Argonaute 2蛋白的原核表達與多克隆抗體制備[J]. 西北植物學報，34（10）：1951-1955. [Cheng X L，Yang J W. 2014. Prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation of Argonaute 2 in rice （Oryza sativa L.）[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，34（10）：1951-1955.]

戴仁懷，倪琳. 2011. 黑尾葉蟬對寄主選擇性及機理初步研究[J]. 湖北農業科學，50（17）：3549-3551. [Dai R H，Ni L. 2011. Preliminary study on host selectivity and mechanism of Nephotettix cincticeps（Uhler）[J]. Hubei Agricultural Sciences，50（17）：3549-3551.]

賈慧娜，羅海玲. 2012. 多克隆抗體制備方法的研究進展[J]. 中國草食動物科學，32（S1）：66-69. [Jia H N，Luo H L. 2012. Progress in preparation of polyclonal antibodies[J]. China Herbivore Science，32（S1）：66-69.]

蘭漢紅. 2015. 介體昆蟲RNA干擾途徑調控水稻病毒的侵染[D]. 福州：福建農林大學. [Lan H H. 2015. RNA interference pathway modulates the infection of rice viruses in insect vectors[D]. Fuzhou：Fujian Agriculture and Fo-restry University.]

蘭漢紅，張玲華，劉宇艷，陳紅艷，賈東升，陳倩，魏太云. 2015. RNA干擾途徑調控南方水稻黑條矮縮病毒在介體白背飛虱體內的持久侵染[J]. 科學通報，60（15）：1361-1369. [Lan H H，Zhang L H，Liu Y Y，Chen H Y，Jia D S，Chen Q，Wei T Y. 2015. An RNA interference pathway modulates the persistent infection of Southern rice black-streaked dwarf virus in insect vector，Sogatella furcifera[J]. Chinese Science Bulletin，60（15）：1361-1369.]

汪章勛，孟慧敏，周權. 2013. 綠僵菌Argonaute基因片段原核表達載體的構建及其表達[J]. 安徽科技學院學報，27（6）：39-43. [Wang Z X，Meng H M，Zhou Q. 2013. Construction and expression of the prokaryotic expression vector of argonaute gene related segment from Metarhizium anisopliae[J]. Journal of Anhui Science and Technology University，27（6）：39-43.]

楊燕萍，郭素霞，陳晶，林矯矯，劉宗平，程國鋒. 2010. 編碼日本血吸蟲Argonaute蛋白全長cDNA克隆、表達及初步鑒定[J]. 中國人獸共患病學報，26（9）：830-834. [Yang Y P，Guo S X，Chen J，Lin J J，Liu Z P，Cheng G F. 2010. Cloning，expression and identifying of a full-lenght cDNA encoding argonaute from Schistosoma japonicum[J]. Chinese Journal of Zoonoses，26（9）：830-834.]

朱兵，曹赟潔，周雍，盛清，聶作明. 2018. 家蠶AGO2蛋白的單克隆抗體制備[J]. 蠶業科學，44（3）：376-381. [Zhu B，Cao Y J，Zhou Y，Sheng Q，Nie Z M. 2018. Preparation of monoclonal antibody against BmAGO2 protein of silkworm[J]. Science of Sericulture，44（3）：376-381.]

Bronkhorst A W，van Rij R P. 2014. The long and short of antiviral defense：Small RNA-based immunity in insects[J]. Current Opinion in Virology，7：19-28. doi： 10.1016/j.coviro.2014.03.010.

Chen H，Chen Q，Omura T，Uehara-Ichiki T，Wei T. 2011. Sequential infection of Rice dwarf virus in the internal organs of its insect vector after ingestion of virus[J]. Virus Research，160（1-2）：389-394.

Ding S W. 2010. RNA-based antiviral immunity[J]. Nature Reviews. Immunology，10（9）：632-644. doi：10.1038/nri 2824.

Guo Z，Li Y，Ding S W. 2019. Small RNA-based antimicrobial immunity[J]. Nature Reviews. Immunology，19（1）：31-44. doi： 10.1038/s41577-018-0071-x.

Karlikow M，Goic B，Saleh M C. 2014. RNAi and antiviral defense in Drosophila：Setting up a systemic immune response[J]. Developmental and Comparative Immunology，42（1）：85-92.

Lan H，Chen H，Liu Y，Jiang C，Mao Q，Jia D，Wei T. 2015. Small interfering RNA pathway modulates initial viral infection in the midgut epithelium of insect after ingestion of virus[J]. Journal of Virology，90（2）：917-929.

Lan H，Wang H，Chen Q，Chen H，Jia D，Mao Q，Wei T. 2016. Small interfering RNA pathway modulates persistent infection of a plant virus in its insect vector[J]. Scien-tific Reports，6：20699. doi： 10.1038/srep20699.

Lee Y S，Nakahara K，Pham J W，Kim K，He Z，Sontheimer E J，Carthew R W. 2004. Distinct roles for Drosophila Di-cer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways[J]. Cell，117（1）：69-81.

Li J M，Andika I B，Shen J F，Lv Y，Ji Y，Sun L，Chen J. 2013. Characterization of Rice black-streaked dwarf virus- and Rice stripe virus-derived siRNAs in singly and doubly infected insect vector Laodelphax striatellus[J]. PLoS One，8（6）：e66007.

Qu F，Ye X，Morris T J. 2008. Arabidopsis DRB4，AGO1，AGO7，and RDR6 participate in a DCL4-initiated antiviral RNA silencing pathway negatively regulated by DCL1[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，105（38）：14732-14737.

Tiller K E，Tessier P M. 2015. Advances in antibody design[J].

Annual Review of Biomedical Engineering，17：191-216.

van Rij R P，Saleh M C，Berry B，Foo C，Houk A，Antoniewski C，Andino R. 2006. The RNA silencing endonuclease Argonaute 2 mediates specific antiviral immunity in Drosophila melanogaster[J]. Genes and Development，20 （21）：2985-2995.

Vaucheret H. 2008. Plant Argonautes[J]. Trends in Plant Scien-ce，13（7）：350-358.

Wootla B，Denic A，Rodriguez M. 2014. Polyclonal and monoclonal antibodies in clinic[M]//Human Monoclonal Antibodies. Rochester： Humana Press： 79-110.

Xu Y，Huang L Z，Fu S，Wu J，Zhou X. 2012. Population diversity of rice stripe virus-derived siRNAs in three diffe-rent hosts and RNAi-based antiviral immunity in Laodelphgax striatellus[J]. PLoS One，7（9）：e46238.

（責任編輯 蘭宗寶）