桑毛色二孢根腐病菌遺傳多樣性的ISSR分析

謝紅輝 王麗 萍黃顯雅 李菊馨

摘要：【目的】明確來(lái)源于廣西各地桑樹(shù)根腐病病原菌可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae Pat.）的遺傳多樣性特征，為桑樹(shù)抗病育種提供參考依據(jù)。【方法】以從廣西各桑樹(shù)種植區(qū)采集、分離的44株L. theobromae菌株為材料，利用真菌基因組DNA提取試劑盒提取參試菌株的基因組DNA;從加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的ISSR引物序列中隨機(jī)選擇60條引物先對(duì)8株菌株的DNA進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，選用擴(kuò)增條帶數(shù)量多、條帶清晰的引物對(duì)所有參試菌株的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，統(tǒng)計(jì)每條引物的擴(kuò)增條帶數(shù)形成0、1矩陣;利用NTSYSpc（Version 2.10e）計(jì)算不同菌株間的遺傳相似系數(shù)，采用非加權(quán)組平均法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育聚類圖，并進(jìn)行聚類相關(guān)分析;利用PopGene（Version 1.32）分析不同地理來(lái)源和寄主來(lái)源菌株的遺傳分化程度。【結(jié)果】ISSR分子標(biāo)記結(jié)果顯示，44株參試菌株（7個(gè)居群）的多態(tài)位點(diǎn)百分率在92.00%以上;7個(gè)居群的平均遺傳一致度（IN）和平均遺傳距離（D）分別為0.7363和0.3108;44株參試菌株的平均基因多樣性指數(shù)（H）和Shannon’s信息指數(shù)（I）分別為0.3263和0.4841，均高于7個(gè)居群的平均值（0.1256和0.1796）;對(duì)應(yīng)的遺傳分化系數(shù)（Gst）、基因流值（Nm）分別為0.6142和0.3141。【結(jié)論】廣西地區(qū)桑毛色二孢根腐病菌菌株具有較高的多態(tài)性，菌株間的遺傳多樣性高于居群，遺傳多樣性與菌株的地理來(lái)源有關(guān)。

關(guān)鍵詞： 桑樹(shù);根腐病;可可毛色二孢;ISSR;廣西

0 引言

【研究意義】目前廣西的桑樹(shù)種植面積達(dá)20.06萬(wàn)ha，是我國(guó)蠶繭生產(chǎn)第一大省（區(qū)）和世界重要原料繭生產(chǎn)基地（何雪梅等，2017）。真菌類病害是我國(guó)桑樹(shù)的主要病害，其中與子囊菌亞門真菌有關(guān)的真菌病害有50多種（蒲冠勤等，2012;謝紅輝，2016）。可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae Pat.）是一種多型性土傳真菌，在全世界廣泛分布（Sreerama and Singh，2009）。L. theobromae的寄主植物有500多種，在相同或不同植物上引起的病害癥狀多種多樣（胡美姣等，2012;Safdar et al.，2015）。2014年，我國(guó)首次報(bào)道L. theobromae在廣西橫縣侵染桑樹(shù)根部引起根腐病（Xie et al.，2014），目前生產(chǎn)上尚缺乏防治桑毛色二孢根腐病的有效藥劑。抗病育種是防治植物病害的一種有效途徑，而研究病原菌的遺傳多樣性對(duì)于開(kāi)展抗病育種工作具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】Nghia等（2012）利用ISSR分子標(biāo)記研究來(lái)自橡膠樹(shù)的20株Botryodiplodia theobromae（L. theobromae的異名）菌株的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)參試菌株的ISSR類群劃分與菌株的地理來(lái)源有關(guān)。Tan等（2012）利用篩選出的4條ISSR引物對(duì)20株L. theobromae菌株進(jìn)行分子標(biāo)記，共擴(kuò)增出483條DNA條帶，其中126條為多態(tài)性條帶，多態(tài)率為29.9%;聚類分析結(jié)果顯示，所有菌株被分為9個(gè)類群，基因型與地理來(lái)源無(wú)關(guān)。陳小莉（2015）研究了芒果蒂腐病菌的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)群體間遺傳多樣性豐富，菌株的聚類與菌株的地理來(lái)源和致病力無(wú)關(guān)聯(lián)。Qiu等（2015）利用ISSR分子標(biāo)記研究了葡萄座腔菌科Diplodia seriata、Neofusicoccum parvum、Botryosphaeria dothidea和L. theobromae 4個(gè)種不同地理來(lái)源的171株菌株的遺傳多樣性和遺傳分化，結(jié)果表明同一地理來(lái)源的菌株遺傳差異明顯。【本研究切入點(diǎn)】前人研究結(jié)果顯示，L. theobromae菌株的遺傳多樣性或與菌株的地理來(lái)源有關(guān)。桑毛色二孢根腐病作為我國(guó)桑樹(shù)生產(chǎn)上一種嚴(yán)重發(fā)生的新病害，但其病原菌的遺傳多樣性和遺傳分化規(guī)律是否與菌株的地理來(lái)源有關(guān)尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用ISSR分子標(biāo)記分析來(lái)自廣西不同桑樹(shù)種植區(qū)的根腐病病菌L. theobromae菌株的遺傳多樣性，利用NTSYSpc和PopGene分析計(jì)算菌株的遺傳相似系數(shù)和遺傳分化相關(guān)參數(shù)值，采用非加權(quán)組平均法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育聚類圖，并進(jìn)行聚類相關(guān)分析，以明確菌株間的遺傳分化情況及其與菌株地理來(lái)源間的關(guān)系，為開(kāi)展桑樹(shù)抗病育種等病害防治研究提供參考。

1 材料與方法

1. 1 供試菌株

菌株由本課題組從廣西橫縣、鹿寨和宜州等地的桑毛色二孢根腐病病株根部組織分離，并通過(guò)柯赫氏法則驗(yàn)證、測(cè)定菌株的ITS序列和EF1-α序列鑒定所得（表1）。表1中L. theobromae菌株的ITS和EF1-α序列均已在NCBI中注冊(cè)提交，且分別與已發(fā)表的L. theobromae代表菌株CBS 164.96（Phillips et al.，2005）的ITS序列（登錄號(hào)AY640255）和EF1-α序列（登錄號(hào)AY640258）同源性達(dá)99%。

1. 2 菌株DNA提取與檢測(cè)

利用真菌基因組DNA提取試劑盒（E.Z.N.A.? Fungal DNA Min Kit，OMEGA公司生產(chǎn)）提取參試菌株的基因組DNA，按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行提取。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取的菌株基因組DNA質(zhì)量，并用核酸濃度測(cè)試儀測(cè)定其濃度后貯存于-20 ℃冰箱，備用。

1. 3 ISSR遺傳多樣性分析

1. 3. 1 ISSR引物篩選 從加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的ISSR引物序列中隨機(jī)選取60條引物（周延清，2005），并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。先用60條ISSR引物對(duì)不同地理來(lái)源和不同寄主的8株菌株DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，以篩選出有較多條帶、條帶多態(tài)性及重復(fù)性好的引物。再用篩選出的引物對(duì)44株供試菌株進(jìn)行ISSR PCR指紋圖譜分析。

1. 3. 2 ISSR PCR反應(yīng)及電泳 反應(yīng)體系25.0 μL：30 ng/μL DNA模板1.0 μL，10 μmol/L引物1.0 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，Taq Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 2.0 μL，5 U/μL Taq酶0.2 μL，ddH2O 17.8 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 30 s，退火溫度42～48 ℃（退火溫度根據(jù)引物設(shè)定），退火時(shí)間45 s，72 ℃ 2 min，進(jìn)行45個(gè)循環(huán);72 ℃延伸15 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)：配制1.8%瓊脂糖膠，待瓊脂糖膠的溫度冷卻至60 ℃左右時(shí)，根據(jù)瓊脂糖膠的體積按比例加入一定量的核酸染料，輕輕搖勻后倒入制膠板內(nèi)。待膠板完全凝固后，取5.0 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物點(diǎn)樣。電泳（100 V，80 mA）3.5 h后，將膠板移至UVItec?凝膠成像系統(tǒng)上觀察PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果并拍照。

1. 4 數(shù)據(jù)處理

觀察各引物對(duì)每株菌株的擴(kuò)增電泳圖譜，統(tǒng)計(jì)每條引物的擴(kuò)增條帶數(shù)，記錄條帶（有條帶的記為1，無(wú)條帶的記為0），形成0、1矩陣。利用NTSYSpc （Version 2.10e）計(jì)算不同菌株間的遺傳相似系數(shù)，采用非加權(quán)組平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育聚類圖，并進(jìn)行聚類相關(guān)分析。利用PopGene（Version 1.32）分析不同地理來(lái)源和寄主來(lái)源菌株的遺傳分化程度。多態(tài)率計(jì)算公式：

多態(tài)率（%）=多態(tài)性條帶數(shù)擴(kuò)增條帶數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2. 1 引物篩選結(jié)果

利用60條ISSR引物擴(kuò)增8株菌株的DNA模板，從中篩選出10條擴(kuò)增條帶清晰、條帶數(shù)多、重復(fù)性好的引物（表2）。

2. 2 ISSR擴(kuò)增結(jié)果

利用篩選出的10條引物對(duì)44株菌株DNA目標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增，共標(biāo)記出109條DNA條帶，條帶大小介于250～3000 bp，其中多態(tài)性條帶有101條，多態(tài)率為83.33%～100.00%，平均多態(tài)率為92.66%。其中，以引物HBH（AG）7擴(kuò)增的條帶數(shù)最多（圖1），達(dá)13條，多態(tài)性條帶為12條，多態(tài)率92.31%。

2. 3 ISSR標(biāo)記的菌株聚類分析結(jié)果

采用NTSYSpc 2.10e統(tǒng)計(jì)ISSR標(biāo)記的數(shù)據(jù)，計(jì)算遺傳相似系數(shù)，并用UPGMA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育聚類圖（圖2）。聚類圖中，遺傳相似系數(shù)越小，表明菌株間親緣關(guān)系越遠(yuǎn);遺傳相似系數(shù)越大，表明菌株間親緣關(guān)系越近。圖2顯示，來(lái)源于不同地理來(lái)源的44株L. theobromae菌株被劃分為7個(gè)居群（表1），遺傳相似系數(shù)在0.65～1.00，平均為0.83。當(dāng)聚類圖以遺傳相似系數(shù)0.77（L虛線）為閾值時(shí)，所有菌株分別處在6個(gè)分支上。其中，來(lái)自融安（LR）和蒙山（WM）的菌株聚在一起，其他居群的菌株分別獨(dú)立聚在一個(gè)分支上。44株L. theobromae菌株的ISSR標(biāo)記聚類結(jié)果表明，參試菌株的遺傳多樣性水平與菌株的地理來(lái)源有很大的相關(guān)性，不同地理來(lái)源的菌株，其遺傳相似性低，遺傳分化程度高。

2. 4 基于ISSR標(biāo)記的菌株群體遺傳分化分析結(jié)果

利用PopGene計(jì)算各居群的遺傳距離（D）和Nei’s遺傳一致度（IN），結(jié)果（表3）顯示，7個(gè)居群的遺傳一致度為0.5702～0.8239，平均為0.7363;遺傳距離為0.1938～0.5618，平均為0.3108。7個(gè)居群中，宜州（HY）居群的L. theobromae菌株群體和蒙山（WM）居群的L. theobromae菌株群體的遺傳距離最遠(yuǎn)（D為0.5618），遺傳一致度最低（IN為0.5702），說(shuō)明這2個(gè)居群間的遺傳分化程度最高，親緣關(guān)系較遠(yuǎn);而橫縣（NH）居群的L. theobromae菌株群體和象州（LX）居群的L. theobromae菌株群體遺傳一致度最高（IN為0.8239），遺傳距離最短（D為0.1938），說(shuō)明這2個(gè)居群間的遺傳分化程度低，親緣關(guān)系較近。

2. 5 基于ISSR標(biāo)記的菌株群體多樣性分析結(jié)果

利用PopGene對(duì)7個(gè)居群的遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果（表4）顯示，7個(gè)居群的平均多態(tài)位點(diǎn)數(shù)（Pl）為25.57個(gè)，平均多態(tài)位點(diǎn)百分率（Ppl）為28.73%，平均觀察等位基因數(shù)（Na）為1.2873，平均有效等位基因數(shù)（Ne）為1.2325，平均基因多樣性指數(shù)（H）為0.1256，平均Shannon’s信息指數(shù)（I）為0.1796。其中，NH居群的Pl最多，達(dá)42.00個(gè)，Ppl為47.19%;WM居群的Pl和Ppl最低。居群內(nèi)的遺傳多樣性以LL居群的菌株最高，其I為0.2973，LR居群的I最低，為0.0618。

由表5可知，參試的44株L. theobromae菌株在種級(jí)水平的Na為1.8989，Ne為1.5689，H為0.3263，I為0.4841，菌株的總雜合度（Ht）平均為0.3255，種水平遺傳雜合度（Hs）為0.1256，遺傳分化系數(shù)（Gst）平均為0.6142，基因流（Nm）為0.3141。

對(duì)經(jīng)比表4和表5中各項(xiàng)遺傳多樣性參數(shù)可知，居群內(nèi)菌株的平均H（0.3263）和I（0.4841）均高于居群間的平均H（0.1256）和I（0.1796），說(shuō)明居群內(nèi)的遺傳豐富多樣，遺傳分化程度高于7個(gè)居群間的遺傳分化程度，菌株的遺傳多樣性程度較高。

3 討論

研究表明，部分真菌菌株的遺傳多樣性與菌株的地理來(lái)源無(wú)相關(guān)性，也有部分真菌的遺傳多樣性與菌株的地理來(lái)源間存在一定聯(lián)系。Shah等（2010）研究了來(lái)源于印度梨樹(shù)的30株L. theobromae菌株遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)來(lái)自不同地理來(lái)源的菌株間遺傳多樣性豐富，而來(lái)自同一地理來(lái)源的菌株遺傳相似性高。Nghia等（2012）利用ISSR分子標(biāo)記分析了來(lái)自橡膠樹(shù)的20株B. theobromae菌株的遺傳多樣性，16條引物共標(biāo)記出214條DNA條帶，多態(tài)性條帶為164條，平均多態(tài)率為76.6%;UPGMA聚類結(jié)果顯示，20株菌株被分為4個(gè)不同類群，類群劃分與菌株的地理來(lái)源有關(guān)。Prajapati和Patil（2015）的研究表明，9株來(lái)自印度不同麻風(fēng)樹(shù)栽培地區(qū)的L. theobromae菌株被分為兩個(gè)類群，該類群劃分與菌株的地理來(lái)源無(wú)顯著聯(lián)系。Qiu等（2015）利用ISSR分子標(biāo)記研究了葡萄座腔菌科Diplodia seriata、Neofusicoccum parvum、B. dothidea和L. theobromae 4個(gè)種不同地理來(lái)源的171株菌株遺傳多樣性和遺傳分化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同一地理來(lái)源的L. theobromae菌株間存在明顯遺傳變異。本研究中來(lái)源于廣西不同桑樹(shù)種植區(qū)的44株L. theobromae菌株被劃分為7個(gè)居群，UPGMA聚類顯示居群劃分與地理來(lái)源有關(guān)，與Nghia等（2012）的研究結(jié)果相似;本研究ISSR分子標(biāo)記結(jié)果顯示菌株間的遺傳多樣性豐富，菌株間的遺傳分化水平顯著高于居群的遺傳分化水平，與Qiu等（2015）的研究結(jié)果相似。

Burgess等（2003）研究了來(lái)自桉樹(shù)、松樹(shù)和麻黃屬植物的L. theobromae菌株遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)菌株的SSR類群劃分與寄主具有緊密關(guān)系。廣西是我國(guó)的桑樹(shù)種植大省（區(qū)），各市縣種植的桑樹(shù)品種較多且不盡相同（謝紅輝等，2016）。本研究中的試驗(yàn)菌株主要在冬季采樣分離獲得，采樣時(shí)桑樹(shù)已經(jīng)落葉完畢，很難辨認(rèn)其品種，因此菌株的寄主必然包含有不同的桑樹(shù)品種。但L. theobromae作為桑毛色二孢根腐病的病原菌，其遺傳分化水平是否與不同桑樹(shù)品種有關(guān)尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

群體間的遺傳變異程度用遺傳變異系數(shù)（Gst）表示，當(dāng)遺傳變異系數(shù)值在0.15以上時(shí)，遺傳分化主要表現(xiàn)于群體內(nèi)（Chen et al.，2015）。基因流即基因在群體中運(yùn)動(dòng)，指某群體的部分個(gè)體遷移到另一群體時(shí)會(huì)把某基因帶入新群體，從而產(chǎn)生基因流動(dòng)，基因流越大，群體間的相似性越大;基因流動(dòng)是影響群體與群體、群體內(nèi)部不同個(gè)體間遺傳變異水平的重要因素（曲若竹等，2004）。群體間的Nm小于1，有限的基因流會(huì)促使群體發(fā)生遺傳分化;而Nm大于1，則會(huì)阻止群體間發(fā)生遺傳分化（楊光偉等，2003）。Mohali等（2005）分析了來(lái)自不同地理和寄主的L. theobromae菌株的基因流動(dòng)和種群遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)L. theobromae在針葉樹(shù)和闊葉樹(shù)的不同種寄主間有較強(qiáng)的基因流動(dòng)，說(shuō)明寄主間的菌株遺傳相似性高，而來(lái)源于委內(nèi)瑞拉、墨西哥和南非的L. theobromae種群具有一定遺傳距離。墨西哥、委內(nèi)瑞拉和南非居群的基因流動(dòng)頻繁，可能是由于委內(nèi)瑞拉和南非等亞熱帶國(guó)家的松樹(shù)種子來(lái)源于墨西哥，而墨西哥種子中的一些優(yōu)勢(shì)菌株的基因型在其他國(guó)家或地區(qū)廣泛繁殖。Al-Sadi等（2013）研究了來(lái)自阿曼和阿聯(lián)酋椰棗、柑橘和芒果樹(shù)的64株L. theobromae菌株的遺傳多樣性，AFLP聚類分析結(jié)果顯示所有菌株被分為4個(gè)類群，分子方差（AMOVA）分析結(jié)果顯示來(lái)自芒果、柑橘和椰棗上的L. theobromae遺傳分化程度低。這可能是由于阿曼和阿聯(lián)酋兩國(guó)間頻繁交換種植材料，寄主上的L. theobromae菌隨著種植材料的頻繁交換而不斷發(fā)生基因流動(dòng)。本研究中，44株L. theobromae菌株間的Gst值（0.6142）大于0.15，而Nm（0.3141）小于1，進(jìn)一步說(shuō)明居群間的遺傳變異程度低，而菌株間的遺傳變異程度較高，遺傳分化大，遺傳多樣性豐富。

4 結(jié)論

廣西地區(qū)桑毛色二孢根腐病菌菌株具有較高的多態(tài)性，菌株間的遺傳多樣性高于居群，遺傳多樣性與菌株的地理來(lái)源有關(guān)。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）