響應面法優化糯高粱多糖提取工藝及其抗氧化活性分析

尹學偉 王秋月 李清虎 魯遠源 魏靈 張曉春

摘要：【目的】優化糯高粱多糖提取工藝，并分析其抗氧化活性，為糯高粱食品開發利用提供理論依據。【方法】以國窖紅1號糯高粱籽粒為材料，在單因素試驗的基礎上，采用響應面法優化其多糖提取工藝，并測定所提取多糖清除DPPH自由基和羥基自由基的能力。【結果】建立了料液比（X1）、微波功率（X2）和提取時間（X3）與糯高粱多糖提取率（Y）的回歸模擬方程：Y=6.43277+0.26425X1+0.89398X2+0.35226X3-0.09537X1X2-0.14083X1X3-0.10898X2X3-1.39713X12-1.35532X22-0.26889X32，回歸方程模型極顯著（P<0.01），R2=0.999885，方程擬合程度高。糯高粱多糖提取的最佳工藝條件為：料液比1∶400、微波功率480 W、提取時間110 s，在此條件下，得到多糖平均值為6.48%，與預測值（6.68%）相對誤差為2.91%。糯高粱多糖的DPPH自由基清除率隨多糖質量濃度的增加先增后減，多糖質量濃度為0.4 mg/mL時，清除率最高達54.38%，低于對照2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）的清除率;羥基自由基清除率隨多糖質量濃度的增加而增加，多糖質量濃度為0.10 mg/mL時達最大值（94.70%），高于相同質量濃度對照BHT的清除率。【結論】采用響應面法優化的工藝條件可用于糯高粱多糖提取，且糯高粱多糖具有較強的抗氧化活性，可用于健康食品開發。

關鍵詞： 糯高粱多糖;提取工藝;抗氧化活性;響應面法

0 引言

【研究意義】高粱（Sorghum bicolor L. Moench）亦稱蜀黍，屬禾本科高粱屬一年生草本植物，自古有“五谷之精”“百谷之長”的稱譽，廣泛分布于全國各地，重慶、四川等西南地區因其獨特的氣候條件，是我國糯高粱優勢產區（程慶軍等，2010;尹學偉等，2014）。糯高粱籽粒除了含有豐富的淀粉外，還富含單寧、原花青素、黃酮、多糖等具有較強抗氧化能力和抑菌活性的物質（Waniska，2000;吳麗等，2014）。多糖是一類具有抗氧化、抗疲勞、抗病毒及調節免疫細胞等多種生物活性功能的高分子化合物，作為構成動植物生命基本物質，其還具有抗凝血、抗血栓、降血糖、降血脂、延緩衰老等特性（吳笳笛，2008;吳春華等，2011;許春平等，2014）。糯高粱籽粒是重要的傳統食用雜糧作物，有增強人體免疫、降低人體血糖等功效，隨著人民生活水平的日益提高，以糯高粱為原料深加工制成的健康特色食品具有廣闊的市場和開發前景（段江蓮等，2013）。因此，探討我國南方糯高粱籽粒中多糖的提取工藝及其抗氧化活性對新型食用高粱食品的開發利用具有重要意義。【前人研究進展】關于高粱多糖，Ramesh和Tharanathan（1999）研究表明，溫度對高粱多糖的提取具有較大影響，55或100 ℃有利于多糖提取;Betts等（2015）研究認為，高粱籽粒中除了富含淀粉外，還含有豐富的多糖，且多糖組分間具有明顯差異，基因型是影響高粱組分比例的主要因素。在高粱抗氧化活性方面，前人主要集中在酚類、醇類和原花青素等成分研究，王華等（2007）研究得出高粱籽粒提取物總酚含量范圍為3.87%～38.87%，不同溶劑條件下提取物的抗氧化能力存在明顯差異;張國濤和王華（2011）研究發現，不同種皮顏色高粱的甲醇提取物表現出顯著不同的抗氧化活性;Wu等（2011）研究表明，高粱糠原花青素提取物不僅具有較強的抗氧化活性，還具有一定的抑瘤作用;劉睿等（2013）研究表明，不同提取劑對高粱種皮原花青素的提取及其抗氧化能力有一定影響;劉禹等（2013）研究發現，不同溶劑對高粱米中多酚和黃酮含量及抗氧化活性有明顯影響，80%丙酮提取物中的多酚和黃酮含量最高，表現出較強的抗氧化能力;張慧蕓等（2014）研究發現，高粱提取物中含有豐富的總酚，微生物發酵不僅能增加總酚含量，還使其具有更高的抗氧化活性，并因微生物種類不同而存在差異。【本研究切入點】微波輔助響應面法優化提取工藝技術具有低成本、高效等優點，目前廣泛應用于油菜籽（鞠興榮等，2012）、綠豆（鐘葵等，2013）、燕麥麩（趙慧霞，2015）、藜麥（袁俊杰等，2016）等作物的多糖提取，但未見用于提取高粱多糖的研究報道，且關于高粱籽粒多糖抗氧化活性方面的研究也未見相關報道。【擬解決的關鍵問題】采用響應面法優化微波提取糯高粱籽粒多糖的工藝條件，并測定其抗氧化活性，為南方優質糯高粱食品的綜合開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

糯高粱品種為南方主栽品種國窖紅1號（四川省農業科學院水稻高粱研究所選育），選取糯高粱籽粒50 g，粉碎，過80目篩，烘干保存備用。主要儀器設備：CEM MARS 6微波消解/萃取系統（美國CEM公司）、SB-5200 DTD超聲波清洗機（寧波生物科技有限公司）、MAPADA V-1100D紫外可見分光光度計（上海美普達儀器有限公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 糯高粱多糖提取 精確稱取試樣2 g置于提取容器中，加入20.0 mL 80%乙醇微波提取30 min;過濾掉溶液，用80%乙醇清洗濾渣3～5次，將濾渣再置于潔凈的提取容器內，加入一定量純凈水進行微波提取，提取2次，合并濾液待用。

1. 2. 2 單因素試驗 選取料液比[1∶200、1∶300、1∶400、1∶500、1∶600（g/mL，下同）]、微波功率（200、250、300、350、400和450 W）和提取時間（20、40、60、80、100和120 s）進行單因素試驗，采用1.2.1方法進行糯高粱多糖提取，每組重復3次，根據公式計算多糖提取率：

式中，c為提取的樣品液多糖質量濃度（mg/mL），V0為樣品液總體積（mL），n為稀釋倍數，V為樣品測定液體積（mL），m為預處理糯高粱粉質量（g）。

1. 2. 3 響應面試驗設計 在單因素試驗結果的基礎上，采用Box-Behnken試驗設計，以料液比（X1）、微波功率（X2）和提取時間（X3）3個因素為自變量，多糖提取率（Y）為因變量進行響應面分析，優化糯高粱多糖提取工藝。響應面試驗因素水平設計見表1。

1. 2. 4 糯高粱多糖抗氧化活性分析

1. 2. 4. 1 DPPH自由基清除能力測定 參照Atoui等（2005）的方法測定。取1.0 mL不同質量濃度的多糖水溶液，加入3.0 mL 0.005%甲醇DPPH溶液，30 min后于517 nm波長下比色。空白組用蒸餾水代替樣品，對照組用2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）代替，每個樣品重復3次。

1. 3 統計分析

利用Excel 2003和Design-Expert V8.0進行數據處理并制圖。

2 結果與分析

2. 1 單因素試驗結果

2. 1. 1 料液比對糯高粱多糖提取率的影響 由圖1可知，在微波功率300 W、提取時間60 s的條件下，隨著料液比的減小，糯高粱多糖提取率總體呈先升高后降低的變化趨勢，料液比在1∶200～1∶400時多糖提取率增加緩慢，1∶400之后，多糖提取率急劇下降，然后略有增加。在料液比為1∶400時，多糖提取率顯著高于其他料液比的提取率（P<0.05，下同），因此確定最佳料液比為1∶400。

2. 1. 2 微波功率對糯高粱多糖提取率的影響 由圖2可知，在料液比1∶400、提取時間60 s的條件下，隨著微波功率的增加，糯高粱多糖提取率呈先升高后趨于平穩的變化趨勢;當微波功率在200～300 W時，多糖提取率的變化幅度不大，300 W后多糖提取率急劇升高，300 W的多糖提取率與微波功率350和400 W的多糖提取率之間差異達顯著水平，400 W后保持平穩，450 W的多糖提取率與400 W間差異不顯著（P>0.05）。因此，確定400 W為糯高粱多糖的最佳微波提取功率。

2. 1. 3 提取時間對糯高粱多糖提取率的影響 如圖3所示，在料液比1∶400、微波功率400 W的條件下，不同提取時間的糯高粱多糖提取率差異顯著，隨提取時間的延長呈先升高后降低的變化趨勢，提取時間在40 s后多糖提取率急劇增加，100 s后緩慢下降，可能由于提取時間過長引起部分多糖降解（和法濤等，2015）。因此，確定最佳提取時間為100 s。

2. 2 糯高粱多糖提取條件的響應面優化結果

2. 2. 1 回歸模型的建立及其顯著性檢驗 采用Box-Behnken設計方法對糯高粱多糖的提取條件進行優化，結果見表2。通過對表2試驗數據進行多元回歸擬合，建立料液比（X1）、微波功率（X2）和提取時間（X3）與糯高粱籽粒多糖提取率（Y）的二次回歸模擬方程：Y=6.43277+0.26425X1+0.89398X2+0.35226X3-0.09537X1X2-0.14083X1X3-0.10898X2X3-1.39713X12-1.35532X22-0.26889X32。由表3可知，糯高粱多糖提取率與各自變量間的線性關系顯著，回歸方程模型極顯著（P<0.01，下同），復合相關系數R2=0.999885，說明該試驗誤差小，預測值與實測值間有較好的相關性，方程擬合程度高，可用該回歸方程對糯高粱多糖提取率進行預測。從回歸方程的偏相關系數可知，各因素對糯高粱多糖提取率的影響排序為X2（微波功率）>X3（提取時間）>X1（料液比），且均為正效應。

2. 2. 2 響應面分析及優化 響應面圖是各試驗因素交互作用下得到的一個三維空間曲面，從二元線性回歸方程結果可知，3個因素中的任意兩個因素間交互作用均達極顯著水平。從圖4～圖6可知，料液比與提取時間的曲線最陡，說明這兩個因素間的交互作用對糯高粱多糖提取率影響最大;料液比與微波功率的曲張最平滑，響應值變化差異較小，對多糖提取率的影響較小。上述結果與方差分析結果（表3）表現一致。

2. 2. 3 驗證試驗結果 通過對試驗數據分析優化可知，糯高粱多糖提取的最佳工藝條件為：料液比1∶400.56、微波功率480.46 W、提取時間111.59 s，在此條件下，預測糯高粱多糖提取率最大值為6.68%。為進一步驗證該響應面結果的可靠性，在料液比1∶400、微波功率480 W、提取時間110 s條件下進行試驗，所得糯高粱多糖的平均值為6.48%，相對標準偏差為0.11%，與預測值的相對誤差為2.91%，說明該響應面結果可靠。

2. 3 糯高粱多糖的抗氧化能力分析結果

2. 3. 1 糯高粱多糖對DPPH自由基的清除能力

糯高粱多糖對DPPH自由基的清除效果見圖7，當糯高粱多糖質量濃度在0.2～0.4 mg/mL時，隨著質量濃度的增加，其對DPPH自由基的清除率逐漸升高，當多糖質量濃度為0.4 mg/mL時，DPPH自由基清除率達最大值（54.38%），之后繼續增加多糖質量濃度，DPPH自由基清除率呈下降趨勢;在同一質量濃度下，糯高粱多糖的DPPH自由基清除率均低于對照BHT的清除率，表明糯高粱多糖具有一定的DPPH自由基清除能力，但弱于BHT。

2. 3. 2 糯高粱多糖對羥基自由基的清除能力 從圖8可看出，糯高粱多糖的羥基自由基清除率隨多糖質量濃度的增加而升高，質量濃度在0.02～0.06 mg/mL時，多糖對羥基自由基的清除率升高較快，當質量濃度為0.10 mg/mL時達最大值（94.70%），高于相同質量濃度條件下對照BHT的羥基自由基清除率，表明糯高粱多糖對羥基自由基的清除能力較強。

3 討論

目前，常用的多糖提取方法有煎煮法、浸提法、回流提取法等，但這些方法均存在提取成本高、提取率低、提取時間長及提取溫度高等問題。因此，發展一種快速、有效提取多糖的方法成為必要。在近20年間研究者們提出了“綠色化學”的觀點，對環保型提取技術越來越重視，而微波輔助提取是近幾年新發展起來的技術，在天然化學產物提取方面的應用逐漸增多（鞠興榮等，2012;袁俊杰等，2016;王永立等，2017）。微波可使多糖的鏈構象形成更均勻分布的網絡結構，增強多糖溶液的穩定性，具有效率高、耗時短、消耗提取溶劑少、溫度和耗能低等優點，在實際大規模生產中也可行，是很有應用前景的多糖提取方法（王勝男等，2019）。響應面試驗設計是一種正交優化試驗設計方法，可分析多個自變量對因變量的影響及自變量間的相互作用，已廣泛應用于優化提取條件（趙慧霞等，2015;李靜等，2017;王波等，2018）。本研究采用響應面法優化微波提取糯高粱多糖的工藝條件，結果表明，糯高粱籽粒含有豐富的多糖，在料液比1：400、微波功率480 W、提取時間110 s的優化條件下，獲得多糖提取率達6.48%。Ramesh和Tharanathan（1999）通過高溫方式（55或100 ℃溫度）對糯高粱籽粒中的淀粉進行酶解、清除，從而得到多糖。本研究的提取方法用時較短，提取率較高，是提取糯高粱多糖的高效方法。

DPPH自由基是一種十分穩定的自由基，其穩定性來自共振穩定作用及3個苯環的空間障礙;羥基自由基是一種重要的活性氧，具有極強的氧化性，其可與大多數有機物發生反應而氧化分解為二氧化碳和水。因而，不同的自由基反應體系中多糖抗氧化作用不同（張燕等，2019）。本研究結果顯示，糯高粱多糖對DPPH自由基的清除率為54.38%，對羥基自由基的清除率為94.70%，表明糯高粱多糖具有較強的抗氧化活性。糯高粱多糖質量濃度在0.4 mg/mL時，DPPH自由基清除率達最大值，濃度大于0.4 mg/mL后，清除率下降，可能由于高粱多糖中含有豐富的X鏈（85%～86%的β-葡聚糖殘基連接支點）和Y鏈（93%～94%的β-葡聚糖殘基連接支點）β-葡聚糖，該物質在其酸解和酶解過程產生結晶顆粒（Onwurah，2001），隨著糯高粱多糖質量濃度的增加，反應液出現混濁，透光率輕微下降，導致其活性趨于降低。本研究明確了糯高粱籽粒含有豐富的多糖并具有較強的抗氧化能力，但一種天然抗氧化多糖成分復雜，通常具有協同增效作用，因此，關于高粱多糖的成分物質、結構分布、含量等方面還有待進一步研究，以深入了解糯高粱多糖的抗氧化機理。

4 結論

采用響應面法優化的工藝條件（料液比1∶400、微波功率480 W、提取時間110 s）可用于糯高粱多糖提取，且糯高粱多糖具有較強的抗氧化活性，可用于健康食品開發。

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（責任編輯 羅 麗）