黃沙鱉抗菌肽cathelicidin基因克隆及表達特征分析

馬沙 盛雪晴 許飄尹

摘要：【目的】克隆黃沙鱉cathelicidin基因并分析其組織分布特征及在攻毒后的表達變化，為深入研究cathelicidin功能及在黃沙鱉先天免疫中的潛在作用提供基礎數據。【方法】采用RT-PCR結合RACE克隆黃沙鱉cathelicidin基因cDNA全長序列，利用生物信息學分析軟件對黃沙鱉cathelicidin基因及其推導氨基酸序列進行結構特征分析，并采用實時熒光定量PCR檢測黃沙鱉cathelicidin基因在不同組織中的表達特征及攻毒后的表達變化。【結果】黃沙鱉cathelicidin基因cDNA序列全長1026 bp（GenBank登錄號MK250818），包括483 bp的開放閱讀框（ORF）、315 bp的5'非編碼區（5'UTR）和228 bp的3'非編碼區（3'UTR）。黃沙鱉cathelicidin基因cDNA序列編碼160個氨基酸，包括氨基端的信號肽區域、含有4個保守半胱氨酸（Cys）殘基的cathelin區域及羧基端的成熟肽區域。黃沙鱉cathelicidin基因推導氨基酸序列與中華鱉cathelicidin基因推導氨基酸序列（KY948708.1）的相似性最高，為97.5%;基于cathelicidin基因推導氨基酸序列相似性構建的系統發育進化樹也顯示黃沙鱉與中華鱉的親緣關系最近。黃沙鱉cathelicidin基因在脾臟和肝臟中的相對表達量相對較高，其次是心臟，在腦組織、腎臟、腸道、肌肉、表皮和背甲的相對表達量較低。以溫和氣單胞菌攻毒后，黃沙鱉脾臟cathelicidin基因相對表達量呈升—降—升—降的波動變化趨勢，出現2個峰值（攻毒后第3和36 h），對應的cathelicidin基因相對表達量分別是對照（注射等量無菌生理鹽水）的23.1和3.5倍。【結論】黃沙鱉cathelicidin基因在脾臟和肝臟中高表達量，且可被溫和氣單胞菌感染誘導，說明cathelicidin基因在黃沙鱉抵抗病原感染過程中發揮重要作用。

關鍵詞： 黃沙鱉;抗菌肽;cathelicidin;基因克隆;表達特征

0 引言

【研究意義】黃沙鱉（Pelodiscus sinensis）為中華鱉（P. sinensis）的地理種群（黃雪貞等，2012;農新聞等，2015），主要分布于我國兩廣的西江流域，為廣西名優養殖品種之一，其養殖業也是廣西水產養殖的重要支柱產業之一（張秋明等，2010）。黃沙鱉味鮮肉嫩、營養豐富，其裙邊富含易被人體吸收的小分子膠原蛋白，單位質量的肌肉粗蛋白含量和必需氨基酸指數均高于中華鱉（賴春華等，2011;周吳萍等，2012），深受廣大消費者喜愛。但近年來由于各種病害的暴發流行，導致黃沙鱉養殖損失慘重（農新聞等，2015）。Cathelicidins是一類由氨基端信號肽、中間cathelin結構域和羧基端成熟肽構成的宿主抗菌肽（張東玲和喻達輝，2015），廣泛分布于各種脊椎動物體內，是宿主防御病毒和細菌等病原入侵的重要屏障，為脊椎動物先天免疫的關鍵組成部分。因此，加強對黃沙鱉cathelicidin基因的研究，有助于進一步認識黃沙鱉的先天免疫系統。【前人研究進展】cathelicidin于20世紀90年代最先在豬中被發現，后來陸續有研究證實該抗菌肽在其他哺乳類、鳥類、魚類、兩棲類和爬行類等脊椎動物中也廣泛存在（Lehrer and Ganz，2002;Zanetti，2005）。cathelicidin在動物體中通常以無活性前體肽的形式存在，需經蛋白酶水解才能釋放出具有活性的成熟肽（廣慧娟，2013）。cathelicidin成熟肽能與帶負電荷的細菌磷脂細胞膜相互作用，從而破壞細菌的細胞膜以達到抑菌效果，具有較強的廣譜抗菌活性，且不易產生耐藥性（Saleem et al.，2010;Tajbakhsh et al.，2018）。于海寧等（2014，2015）研究表明，采用化學方法合成的中華鱉cathelicidin成熟肽Ps-CATH4具有很強的抗菌活性，不易產生耐藥性，細胞毒性低，且具有抑制炎癥細胞因子釋放等作用。cathelicidin除了具有抗微生物活性外，還參與宿主的抗炎癥、結合內毒素、趨化作用、抑制組織損傷、促血管生成及傷口修復等各種防御性生理進程中（王晨等，2017;Chen et al.，2018）。例如豬cathelicidin PR-39可減輕由自由基引起的組織損傷，具有促血管生成及促創傷愈合等功能作用（Zanetti，2005）;人源cathelicidin LL-37除了能誘導單核細胞和中性粒細胞等白細胞發生趨化運動外，還可調節先天性免疫和獲得性免疫等（Chen et al.，2018）。【本研究切入點】目前，已有關于中華鱉cathelicidin基因序列的研究報道（于海寧等，2014），但針對黃沙鱉cathelicidin基因克隆及相關表達特征至今未見報道。【擬解決的關鍵問題】克隆黃沙鱉cathelicidin基因并采用實時熒光定量PCR檢測其組織分布特征及在攻毒后的表達變化，為深入研究cathelicidin功能及在黃沙鱉先天免疫的潛在作用提供基礎數據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

健康黃沙鱉購自廣西武宣縣某養鱉場，個體均重約45 g。經20 d的檢疫飼養觀察，確定無異常后用于細菌攻毒試驗。攻毒試驗采用的溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）WMG2菌株為廣西水生動物病害診斷實驗室于2015年分離自南寧市武鳴區患病黃沙鱉，攻毒試驗前先進行生化鑒定和分子鑒定確認。TRIzol試劑購自Introvigen公司;TIANgel Midi Purification Kit試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司;MgC12、dNTPs、Taq DNA聚合酶、10×PCR緩沖液、DL1000 DNA Marker、pMD18-T載體Cloning Kit試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態細胞、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒、SYBR Premix Ex Taq試劑盒和SMARTer RACE 5'/3' Kit試劑盒均購自TaKaRa公司;普通營養瓊脂培養基購自北京陸橋技術股份有限公司。

1. 2 RNA提取及cDNA合成

按TRIzol試劑說明提取各樣品總RNA，采用OD-1000分光光度計測定總RNA的純度和濃度，-80 ℃保存備用。或以cDNA反轉錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉錄合成cDNA。

1. 3 黃沙鱉cathelicidin基因克隆

以RT-PCR克隆黃沙鱉cathelicidin基因的中間片段。參考NCBI上已公布中華鱉等相近物種的cathelicidin基因序列，設計其中間片段的擴增引物cath-p-F和cath-p-R（表1），反應體系和擴增程序參照Taq DNA聚合酶說明書。同時采用RACE對黃沙鱉cathelicidin基因的5'端和3'端序列進行克隆。以已獲得的黃沙鱉cathelicidin基因中間序列為基礎，分別設計5'-RACE和3'-RACE特異性引物（表1），按SMARTer RACE 5'/3' Kit試劑盒說明克隆黃沙鱉cathelicidin基因的5'端和3'端序列。所有PCR產物經切膠回收純化后，分別連接至pMD18-T載體上，再轉化DH5α感受態細胞，經菌液PCR驗證呈陽性的克隆送至廣州華大生物科技有限公司測序。

將中間片段、5'端和3'端序列進行拼接后即獲得黃沙鱉cathelicidin基因cDNA序列。利用ORF Finder找到黃沙鱉cathelicidin基因的開放閱讀框（ORF）編碼區。以1.2反轉錄合成的cDNA為模板、ORF-F和ORF-R（表1）為引物對黃沙鱉cathelicidin基因ORF進行擴增驗證。

1. 4 生物信息學分析

采用DNASTAR和DNAMAN等生物信息學分析軟件對黃沙鱉cathelicidin基因編碼蛋白進行基本理化性質預測及其氨基酸序列同源性比對分析，使用SignalP 4.1進行蛋白信號肽預測，并以ClustalX和MEGA 5.0構建系統發育進化樹。

1. 5 黃沙鱉cathelicidin基因組織分布特征及攻毒后的表達變化

1. 5. 1 黃沙鱉cathelicidin基因的組織分布特征 隨機從3只健康黃沙鱉的腦組織、心臟、肝臟、腎臟、脾臟、腸道、肌肉、表皮和背甲中取樣，每份取樣0.1 g，加入TRIzol冷凍勻漿，然后提取各組織總RNA。每份樣品取2.0 μL總RNA按照1.2反轉錄合成cDNA。設計實時熒光定量PCR引物cath-qPCR-F和cath-qPCR-R（表1），并以18S-F和18S-R作為內參基因18S rRNA的實時熒光定量PCR擴增引物（劉文婷等，2017）。根據SYBR Premix Ex Taq試劑說明進行實時熒光定量PCR檢測，采用2-△△Ct法計算黃沙鱉cathelicidin基因的相對表達量（設腦組織中的cathelicidin基因相對表達量為1.00），并以SPSS 18.0中的Duncan’s新復極差法對黃沙鱉cathelicidin基因組織分布差異進行分析。

1. 5. 2 黃沙鱉cathelicidin基因攻毒后的表達變化

將WMG2菌株劃線接種于普通營養瓊脂培養基上，30 ℃培養18 h后用無菌生理鹽水洗下菌落并稀釋成菌懸液。根據預試驗結果，采用麥氏比濁管結合活菌計數的方法將細菌濃度調整為106 CFU/mL。通過腹腔注射對健康黃沙鱉進行攻毒，試驗組注射菌懸液（0.2 mL/只），對照組注射等量無菌生理鹽水。攻毒后將不同處理組黃沙鱉置于不同養殖箱中，于注射后不同時間節點（0、3、6、12、24、36、48和72 h）分別隨機取樣（3只）進行剖解，取其脾臟置于液氮中保存或直接進行實時熒光定量PCR檢測。采用 t 檢驗進行攻毒前后黃沙鱉cathelicidin基因表達變化差異分析。

2 結果與分析

2. 1 黃沙鱉cathelicidin基因克隆及序列分析結果

測序結果顯示，黃沙鱉cathelicidin基因的中間序列長度為369 bp，5'端序列長度為805 bp，3'端序列長度為597 bp。經拼接后獲得的cDNA序列全長為1026 bp。將黃沙鱉cathelicidin基因cDNA序列提交至GenBank，其登錄號為MK250818。

黃沙鱉cathelicidin基因cDNA序列含有起始密碼子ATG及3'端多聚腺苷酸化信號AATAAA和poly（A）尾結構，表明克隆得到的黃沙鱉cathelicidin基因核苷酸序列信息完整。黃沙鱉cathelicidin基因的ORF全長483 bp（圖1），編碼160個氨基酸，5'非編碼區（5'UTR）長度為315 bp，3'非編碼區（3'UTR）長度為228 bp（圖2）。DNASTAR預測分析結果顯示，cathelicidin成熟肽理論分子量為3913.63 Da，理論等電點（pI）為13.003。

DNAMAN分析結果顯示，黃沙鱉cathelicidin基因推導氨基酸序列與中華鱉cathelicidin基因推導氨基酸序列（KY948708.1）的相似性很高，具有相似的結構特征（圖3），包括氨基端的信號肽區域、含有4個保守半胱氨酸（Cys）殘基的cathelin區域及羧基端的成熟肽區域，進一步說明克隆得到的黃沙鱉cathelicidin基因屬于Cathelicidins基因家族。

運用DNASTAR對黃沙鱉cathelicidin基因推導氨基酸序列與GenBank上已發布的其他物種cathelicidin基因推導氨基酸序列進行比對分析，結果顯示黃沙鱉與中華鱉（KY948708.1）的相似性最高，為97.5%;與綠頭鴨（Anas platyrhynchos，KT230679.1）、鵪鶉（Coturnix coturnix，GU232858.1）、金環蛇（Bungarus fasciatus，EU753183.1）、青環海蛇（Hydrophis cyanocinctus，KP202856.1）、人類（Homo sapiens，EAW 64854.1）、小鼠（Mus musculus，EDL09033.1）、棕點湍蛙（Amolops loloensis，JF923766.1）和大西洋鮭（Salmo salar，AY728057.1）的相似性依次為34.5%、30.8%、30.4%、29.7%、29.3%、29.0%、25.8%和19.4%。基于cathelicidin基因推導氨基酸序列相似性構建的系統發育進化樹（圖4）也顯示，黃沙鱉與中華鱉的親緣關系最近，再與綠頭鴨、鵪鶉、人類、小鼠、金環蛇和青環海蛇聚為一簇，在進化關系上相對較近;而與棕點湍蛙和大西洋鮭的進化關系上相對較遠，處于不同的分支上。

2. 2 黃沙鱉cathelicidin基因在不同組織中的表達情況

黃沙鱉cathelicidin基因在不同組織中的表達分布存在明顯差異（圖5），以在肝臟中的相對表達量最高，顯著高于其他組織的相對表達量（P<0.05，下同）;其次是脾臟，其相對表達量顯著低于肝臟，但顯著高于其他組織;在心臟中的相對表達量顯著低于肝臟和脾臟，但顯著高于在腦組織、腎臟、腸道、肌肉、表皮和背甲中的相對表達量;在腦組織、腎臟、腸道、肌肉、表皮和背甲的相對表達量較低，且各組織間差異不顯著（P>0.05，下同）。

2. 3 黃沙鱉cathelicidin基因在攻毒后的表達模式

實時熒光定量PCR檢測結果顯示，對照組黃沙鱉脾臟cathelicidin基因的相對表達量無顯著變化，始終維持在正常水平;試驗組黃沙鱉在以溫和氣單胞菌攻毒后，其脾臟cathelicidin基因相對表達量呈升—降—升—降的波動變化趨勢，出現2個峰值（圖6）。第一個峰值出現在攻毒后第3 h，黃沙鱉cathelicidin基因相對表達量是對照組黃沙鱉的23.1倍，二者差異極顯著（P<0.01）;第二個峰值出現在攻毒后第36 h，對應的cathelicidin基因相對表達量是對照組黃沙鱉的3.5倍，二者差異顯著。其他時間節點則表現為試驗組黃沙鱉脾臟cathelicidin基因相對表達量與對照組黃沙鱉的差異均不顯著。

3 討論

近年來，許多研究證實了先天免疫系統在龜鱉抵抗病原侵襲過程中所發揮的關鍵作用，一些先天免疫因子如抗菌肽等已受到廣泛關注（李思明等，2007;王婧，2018;Shi et al.，2018;Xu et al.，2018）。本研究克隆獲得黃沙鱉cathelicidin基因的cDNA全長序列（GenBank登錄號MK250818），該序列包含完整的ORF，編碼160個氨基酸。黃沙鱉cathelicidin基因推導氨基酸序列與已報道其他物種cathelicidin氨基酸序列具有相似的結構特征，包括信號肽區域、保守的cathelin區和羧基端的成熟肽區域（殷夢光，2015），進一步說明本研究克隆獲得的黃沙鱉cathelicidin基因屬于Cathelicidins基因家族。基于cathelicidin基因推導氨基酸序列相似性構建的系統發育進化樹顯示，黃沙鱉與中華鱉的親緣關系最近，由同一個分支進化而來。由于不同物種的cathelicidin成熟肽具有多樣性，因此黃沙鱉cathelicidin基因與除中華鱉外其他物種間的相似性均不高（19.4%～34.5%），即cathelicidin的進化關系與物種進化順序基本一致（廣慧娟，2013）。

本研究結果表明，黃沙鱉cathelicidin基因在脾臟和肝臟的相對表達量較高，其次是心臟，在腦組織、腎臟、腸道、肌肉、表皮和背甲的相對表達量較低。綜合其他學者的研究結果，發現cathelicidin基因在不同物種的組織表達分布情況具有多樣性。黑眶蟾蜍（Bufo melanostictus）cathelicidin基因在皮膚、肝臟、脾臟、大腸、小腸和卵巢中均有表達，其中在脾臟和大腸中的表達量較高（王梅，2015）;細鱗魚（Brachymystax lenok）cathelicidin基因在各組織中的表達量排序為鰓>脾臟>肝臟>肌肉>小腸（厲政，2013）。關于雞（Gallus gallus）的3種cathelicidins基因（CATH-1、CATH-2和CATH-3），CATH-1在脾臟、輸卵管和大腸的表達量最高，其次是十二指腸、肝臟、心臟、睪丸和腎臟;CATH-2在胃臟、脾臟、輸卵管和大腸表達量最高，其次是十二指腸、心臟、腎臟、睪丸和肝臟;CATH-3在大腸和脾臟表達量最高，其次是心臟和腎臟，其他組織則未檢測到CATH-3的表達（Yacoub et al.，2016）。可見，cathelicidin基因在不同物種的淋巴器官（脾臟）中均具有較高的表達量，即與機體免疫系統密切相關。

經溫和氣單胞菌攻毒后，黃沙鱉脾臟cathelicidin基因相對表達量的2個峰值分別出現在攻毒后第3和36 h。袁旦一（2013）研究表明，以維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）經腹腔注射感染斑點叉尾鮰（Ietalurus punetaus），2 h后即可從其脾臟中檢測到維氏氣單胞菌，且脾臟、腎臟和肝臟為最主要的感染靶器官。因此，推測溫和氣單胞菌經腹腔注射感染黃沙鱉后，可在3 h內通過血液循環入侵脾臟，并迅速誘導脾臟cathelicidin基因上調表達。攻毒后，黃沙鱉脾臟cathelicidin基因相對表達量呈升—降—升—降的波動變化趨勢，出現2個峰值，與Broekman等（2013）關于帝王鮭（Oncorhynchus tshawytscha）cathelicidin基因的研究結果相似。究其原因可能是：（1）cathelicidin基因在攻毒后第3和36 h的表達峰值分別由不同轉錄因子調節誘導所造成;（2）脾臟細胞具有某種負反饋循環調節機制以保護細胞免受高濃度抗菌肽的破壞（Broekman et al.，2013;王慧等，2018）。黃沙鱉脾臟cathelicidin基因的表達能響應溫和氣單胞菌誘導，說明cathelicidin基因在黃沙鱉抵抗病原感染過程中發揮重要作用。

本研究結果表明，黃沙鱉cathelicidin基因推導氨基酸序列的成熟肽區域含有9個精氨酸（Arg）殘基，即含有較多的陽離子氨基酸殘基，由于這些殘基易吸引帶負電荷的細菌細胞膜并與之相互作用而達到抗菌效果（Saleem et al.，2010），據此推測黃沙鱉cathelicidin成熟肽可能是一種活性較強的抗菌肽。至今，已有不少學者通過天然提純、化學合成及生物工程表達等方法獲得cathelicidin成熟肽產物，如金環蛇cathelicidin-BF（Wang et al.，2008）、環頸雉（Phasianus colchicus）cathelicidin（Wang et al.，2011）、脆皮大頭蛙（Limnonectes fragilis）Lf-CATH1a重組成熟肽（廣慧娟，2013）等，且均具有一定抗菌效果。于海寧等（2014，2015）采用化學合成方法獲得的中華鱉cathelicidin成熟肽Ps-CATH4，并證實其具有很強的抗菌活性，不易產生耐藥性，細胞毒性低，還能抑制炎癥因子釋放而具有抗炎癥作用。可見，本研究克隆獲得的黃沙鱉cathelicidin基因cDNA序列可為基因工程表達抗菌肽提供基礎，也將為有效控制黃沙鱉細菌性疾病提供新的途徑。

4 結論

黃沙鱉cathelicidin基因在脾臟和肝臟中高表達量，且可被溫和氣單胞菌感染誘導，說明cathelicidin基因在黃沙鱉抵抗病原感染過程中發揮重要作用。

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（責任編輯 蘭宗寶）