中華絨螯蟹致病性弗氏檸檬酸桿菌的分離鑒定及其藥敏特性

黃曉東 周慧華 安健 楊先樂 曹海鵬

摘要：【目的】明確中華絨螯蟹黑鰓病的病原菌及其藥敏特性，為該病的臨床診斷和防控提供科學依據。【方法】采用傳統方法從患黑鰓病的中華絨螯蟹肝胰腺組織中分離病原菌，通過人工回歸感染試驗確定病原菌的致病性，利用API 20E細菌鑒定系統和16S rRNA序列分析對病原菌進行鑒定，并以K-B藥敏紙片擴散法測定其藥敏特性。【結果】從患黑鰓病的中華絨螯蟹肝胰腺中共分離獲得4株疑似病原菌株（C1、C2、C3和C4），人工回歸感染試驗結果表明，僅C1菌株感染中華絨螯蟹后出現死亡，死亡率達90%，且試驗中華絨螯蟹出現黑鰓、肝胰腺呈淺黃色的病癥，與自然發病的癥狀基本一致。依據C1菌株的生理生化特性及16S rRNA序列分析結果，可確定C1菌株為弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii），其對健康中華絨螯蟹的半數致死劑量（LD50）為2.85×105 CFU/mL。藥敏試驗結果表明，C1菌株對新霉素、阿米卡星、慶大霉素、鏈霉素、多西環素、四環素、復方新諾明、氧氟沙星和恩諾沙星等9種抗生素高度敏感，對多粘菌素B中度敏感，對氨芐西林、羧芐青霉素和萬古霉素3種抗生素已產生耐藥性（不敏感）。【結論】弗氏檸檬酸桿菌感染可引起中華絨螯蟹黑鰓病，且對中華絨螯蟹具有較強毒力，實際養殖生產中可選用新霉素、多西環素等漁用抗生素進行防治。

關鍵詞： 中華絨螯蟹;黑鰓病;弗氏檸檬酸桿菌;分離鑒定;藥敏特性

0 引言

【研究意義】中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）俗稱河蟹、大閘蟹，廣泛分布在我國沿海和湖泊地區，是江蘇、安徽、湖北、浙江和遼寧等地區的重要特種水產養殖品種（付龍龍等，2017）。近年來，隨著中華絨螯蟹市場需求量的不斷增加，其養殖業迅猛發展，年產量已超過81萬t（農業部漁業漁政管理局，2017）。但隨著中華絨螯蟹養殖密度及規模的不斷擴大，加上殺蟲劑和除藻劑的大量使用，導致其養殖環境惡化，各種病害頻發，尤其是弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）引起的細菌性病害給中華絨螯蟹養殖造成巨大經濟損失（唐玉華和胡賓，2015）。因此，加快中華絨螯蟹源弗氏檸檬酸桿菌的鑒定及藥敏特性檢測，對確保中華絨螯蟹養殖業的持續健康發展具有重要意義。【前人研究進展】弗氏檸檬酸桿菌隸屬于腸桿菌科（Enterobacteriaceae）檸檬酸桿菌屬（Citrobacter），可引起多種水產動物感染發病，嚴重制約水產業的健康發展，如紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）暴發性死亡（沈錦玉等，2005）、施氏鱘（Acipenser schrenckii）腫嘴病（楊移斌等，2013）、中華鱉（Pelodiscus sinensis）腮腺炎（毛爍君等，2015）、中華絨螯蟹敗血癥（姜光明等，2016）、棘腹蛙（Paa boulengeri）水腫病（李曉英等，2016）、克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）暴發性死亡（肖寧等，2016）和羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）黑鰓病（馮藝等，2017）等均由弗氏檸檬酸桿菌引起。弗氏檸檬酸桿菌具有鞭毛和菌毛，二者均為細菌的黏附素，有助于細菌侵入機體后黏附于細胞表面，經定居、繁殖及釋放大量內毒素而引起宿主發病甚至死亡（郭志燕等，2014）。關于弗氏檸檬酸桿菌引起中華絨螯蟹發病的研究已有報道，在遼寧（盤錦）、河北等地養殖的中華絨螯蟹曾先后暴發過弗氏檸檬酸桿菌病，但對比發現這些地區發生的中華絨螯蟹弗氏檸檬酸桿菌病癥狀完全不同，有的患病中華絨螯蟹表現為肝胰腺、鰓和肌肉輕度水腫，且部分肝胰腺和鰓組織呈腐爛狀（李華等，2001）;有的患病中華絨螯蟹則腹腔內有積水，其鰓組織呈暗灰色、肝胰腺呈淺黃色（陳翠珍等，2006）。因此，有必要明確弗氏檸檬酸桿菌引起中華絨螯蟹發病但表現出不同臨床癥狀的致病機理，并制定出科學的用藥方案及防控措施。【本研究切入點】2017年8月，江蘇省某養殖場的中華絨螯蟹出現嚴重黑鰓病，具體癥狀表現為病蟹行動遲緩，攝食減少或不攝食，鰓呈黑色，肝胰腺呈淺黃色，與已報道的中華絨螯蟹弗氏檸檬酸桿菌病癥狀（李華等，2001;陳翠珍等，2006;姜光明等，2016）有所不同，因此急需鑒定其病原并科學用藥以減少經濟損失。【擬解決的關鍵問題】通過對中華絨螯蟹黑鰓病進行病原菌分離鑒定，并采用K-B藥敏紙片擴散法測定其藥敏特性，以期為該病的臨床診斷和防控提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

具有典型黑鰓病癥狀的中華絨螯蟹由江蘇省某養殖場提供，平均體重49.8 g/只，共16只;健康中華絨螯蟹由上海崇明某養殖場提供，平均體重28.3 g/只，共150只。藥敏紙片購自杭州濱河微生物試劑有限公司;營養瓊脂培養基和無菌生理鹽水由國家水生動物病原庫（上海海洋大學）自制。

1. 2 病原菌分離

選取具有典型發病癥狀的瀕死中華絨螯蟹，病蟹以75%酒精表面消毒后無菌采取其肝胰腺組織，再用無菌接種環取樣在營養瓊脂培養基上進行劃線接種，30 ℃恒溫培養18～24 h，待菌落長出后進行菌株純化，最后將純化菌株轉接至營養瓊脂斜面培養基上，30 ℃恒溫培養24～48 h后觀察菌落形態特征及革蘭氏染色鏡檢，或4 ℃保存備用。

1. 3 人工回歸感染試驗

選取無病傷、體質健壯、規格均勻的健康中華絨螯蟹進行人工回歸感染試驗。試驗設4個試驗組和1個對照組，每組10只中華絨螯蟹。試驗前用無菌生理鹽水分別洗下營養瓊脂斜面培養基上的菌落，采用稀釋涂布平板法測定并以無菌生理鹽水調節菌懸液濃度至5.0×106 CFU/mL。試驗組中華絨螯蟹分別在第三步足基部注射0.1 mL菌懸液（徐海圣等，2002），對照組注射等量無菌生理鹽水。養殖水溫28 ℃，試驗周期7 d，期間每天記錄試驗中華絨螯蟹的死亡數量，觀察其病癥，及時撈出死蟹并再次進行病原菌分離，確定其致病性。

1. 4 病原菌鑒定

參照Underwood和Avsion（2004）的方法采用API 20E細菌鑒定系統對病原菌株進行生理生化鑒定，然后參照馮藝等（2017）的方法以16S rRNA序列分析對其進行分子鑒定。分離菌株的16S rRNA序列委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成測序，測序結果與GenBank中的已知序列進行同源性比對分析，并通過鄰接法（Neighbour-Joining）構建系統發育進化樹（肖艷翼等，2015）。

1. 5 病原菌毒力測定

試驗設4個試驗組和1個對照組，每組10只中華絨螯蟹。試驗前用無菌生理鹽水將分離菌株制備成2.0×104～2.0×107 CFU/mL的菌懸液，試驗組中華絨螯蟹分別在第三步足基部注射0.1 mL菌懸液（徐海圣等，2002），對照組注射等量無菌生理鹽水。試驗周期7 d，期間每天記錄試驗中華絨螯蟹的死亡數量，及時撈出死蟹進行病原菌分離鑒定，并根據概率單位圖解法測定分離菌株對中華絨螯蟹的半數致死劑量（LD50）。

1. 6 病原菌藥敏特性測定

參照陳永亮等（2015）的K-B藥敏紙片擴散法測定分離菌株的藥敏特性，并根據杭州濱河微生物試劑有限公司的《紙片法藥敏試驗抑菌圈直徑判斷標準》判定其對各種抗生素的敏感度。

2 結果與分析

2. 1 病原菌分離結果

從患黑鰓病的中華絨螯蟹肝胰腺中共分離獲得4株疑似病原菌株，暫命名為C1、C2、C3和C4。人工回歸感染試驗結果（表1）表明，僅C1菌株感染中華絨螯蟹后出現死亡，死亡率達90%，且試驗中華絨螯蟹出現黑鰓、肝胰腺呈淺黃色的病癥（圖1），與自然發病的癥狀基本一致;從人工感染的發病中華絨螯蟹肝胰腺中可再次分離獲得與C1菌株生理生化特性一致的菌株，因此判定C1菌株是引起中華絨螯蟹黑鰓病的病原菌。C1菌株在營養瓊脂培養基上生長形成的菌落呈圓形，灰白色，表面光滑濕潤、半透明;革蘭氏染色呈陰性，菌體短桿狀（圖2）。

2. 2 病原菌鑒定結果

采用API 20E細菌鑒定系統對C1菌株進行生理生化鑒定，結果（表2）表明，C1菌株為弗氏檸檬酸桿菌（C. freundii），其鑒定結果的可信度為99.3%;與弗氏檸檬酸桿菌參考菌株（楊移斌等，2013）的生理生化特性一致，且C1菌株16S rRNA序列（GenBank登錄號MK069596）與GenBank中已有弗氏檸檬酸桿菌參考菌株16S rRNA序列的同源性達99%（表3）。由基于16S rRNA序列同源性構建的系統發育進化樹（圖3）也可看出，C1菌株與弗氏檸檬酸桿菌I-T-1-3株（GenBank登錄號KU570303）的親緣關系最近。因此，依據C1菌株的生理生化特性及16S rRNA序列分析結果，可確定C1菌株為弗氏檸檬酸桿菌。

2. 3 病原菌毒力檢測結果

以不同濃度（2.0×104～2.0×107 CFU/mL）的菌懸液分別對健康中華絨螯蟹進行注射感染，導致中華絨螯蟹的死亡率達20%～100%（表4）;而注射無菌生理鹽水的中華絨螯蟹未出現任何病癥及死亡現象，說明試驗中華絨螯蟹的死亡為C1菌株感染所致。根據概率單位圖解法建立的死亡概率（y）與懸液菌濃度對數（x）關系曲線方程為y=0.683x+1.274（R2=0.9823），即C1菌株對健康中華絨螯蟹的LD50為2.85×105 CFU/mL。

2. 4 病原菌的藥敏特性

由表5可知，C1菌株對新霉素、阿米卡星、慶大霉素、鏈霉素、多西環素、四環素、復方新諾明、氧氟沙星和恩諾沙星等9種抗生素高度敏感，對多粘菌素B中度敏感，對氨芐西林、羧芐青霉素和萬古霉素3種抗生素已產生耐藥性（不敏感）。

3 討論

黑鰓病是中華絨螯蟹常見的細菌性疾病之一，其病原菌有氣單胞菌（曹海鵬，2015）、產吲哚黃金桿菌（鄭世雄，2013）等，但關于弗氏檸檬酸桿菌引起中華絨螯蟹黑鰓病的研究鮮見報道。弗氏檸檬酸桿菌是一種人—畜—水生動物共患致病菌（薛巧等，2015），能產生多種毒力因子，不僅具有蛋白酶活性、溶血活性和形成生物膜的能力，還有鞭毛和菌毛等黏附素，有助于侵入機體后黏附于細胞表面形成生物膜，通過定居、繁殖及釋放大量毒素引起溶血和細胞壞死，進而導致機體損傷（郭志燕等，2014;Heo et al.，2017），說明弗氏檸檬酸桿菌對水產動物的致病力與這些毒力因子密切相關。陳紅蓮等（2014）研究表明克氏原螯蝦源弗氏檸檬酸桿菌X120523株的LD50為3.16×107 CFU/mL，馮藝等（2017）研究發現羅氏沼蝦源弗氏檸檬酸桿菌CF9527株的LD50為1.68×106 CFU/mL。本研究從患黑鰓病的中華絨螯蟹肝胰腺中分離獲得1株弗氏檸檬酸桿菌（C1菌株），人工感染健康中華絨螯蟹后表現出黑鰓、肝胰腺呈淺黃色的病癥，與自然發病的癥狀基本一致，對應的LD50為2.85×105 CFU/mL，其毒力高于弗氏檸檬酸桿菌X120523株（陳紅蓮等，2014）和CF9527株（馮藝等，2017），可能與弗氏檸檬酸桿菌不同菌株攜帶的毒力因子種類和數量不同有關。此外，養殖環境突變可促使中華絨螯蟹產生應激反應，消耗大量能量而降低抵抗力（李華等，2001）。因此，弗氏檸檬酸桿菌對中華絨螯蟹的致病性與養殖環境惡化也有一定關系。

弗氏檸檬酸桿菌不同菌株通常也存在理化特性差異。李華等（2001）分離獲得的中華絨螯蟹源弗氏檸檬酸桿菌9773株與陳翠珍等（2006）分離獲得的中華絨螯蟹源弗氏檸檬酸桿菌HQ010516B-1株在肌醇發酵特性方面存在明顯差異。因此，弗氏檸檬酸桿菌的鑒定需要以生理生化鑒定結合16S rRNA序列分析為依據。本研究依據C1菌株的生理生化特征及16S rRNA序列分析結果，最終判定C1菌株為弗氏檸檬酸桿菌，即弗氏檸檬酸桿菌可感染引起中華絨螯蟹黑鰓病，且對中華絨螯蟹具有較強毒力。此外，本研究發現C1菌株與李華等（2001）分離獲得的中華絨螯蟹源弗氏檸檬酸桿菌9773株在檸檬酸鹽利用、肌醇發酵等生化特性方面存在差異，與陳翠珍等（2006）分離獲得的中華絨螯蟹源弗氏檸檬酸桿菌HQ010516B-1株在β-半乳糖苷酶、脲酶等生化特性方面存在差異，可能與地區、氣候和水質條件等因素有關（李小波和黃文芳，2003），但具體原因有待進一步探究。

近年來，雖然基于中藥、益生菌等新型抗生素替代品的疾病防控技術研究取得顯著進展，但由于這些抗生素替代品尚存在應用效果不穩定、成本較高、基礎理論研究不完善等問題（王熙濤等，2015），因此，合理使用和選擇有效抗生素仍是防控細菌性疾病的主要手段。本研究的藥敏試驗結果表明，C1菌株對多西環素、新霉素和恩諾沙星等漁用抗生素高度敏感，可作為防治中華絨螯蟹黑鰓病的首選藥物;但C1菌株對四環素類抗生素的敏感性與中華絨螯蟹源弗氏檸檬酸桿菌9773株（李華等，2001）和HQ010516B-1株（陳翠珍等，2006）存在差異，說明中華絨螯蟹源弗氏檸檬酸桿菌不同菌株間也存在藥敏特性差異。因此，臨床用藥時必須依據藥敏試驗結果有針對性地選擇最有效的藥物進行治療，以減輕病原菌的耐藥性和提高病害防控效果。C1菌株對氨芐西林和羧芐青霉素等青霉素類抗生素已產生耐藥性，與陳翠珍等（2006）、Heo等（2017）對弗氏檸檬酸桿菌耐藥性的研究結果相同，可能與弗氏檸檬酸桿菌普遍攜帶β-內酰胺酶耐藥基因有關（吳榮輝等，2013）。

4 結論

弗氏檸檬酸桿菌感染可引起中華絨螯蟹黑鰓病，且對中華絨螯蟹具有較強毒力，實際養殖生產中可選用新霉素、多西環素等漁用抗生素進行防治。

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（責任編輯 蘭宗寶）