微孔板改良法評價多種國內外單花蜜的體外抑菌活性

王晶波 秦文 楊倬 王麗媛 卓勤 宮照龍 沈葹

摘 要：目的：開展國內外多種單花蜜體外抑菌活性差異的系統評價。方法：以無菌Mueller-Hinton Broth培養基稀釋得到3.75%～90%（w/v）不同濃度的單花蜜，采用96微孔板改良法，用空白無菌培養基和標準菌株作對照孔，測定18種單花蜜對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸埃希氏菌的最低抑菌濃度、最低殺菌濃度、遲緩期持續時間、對數期持續時間和最大細菌密度5個抑菌活性指標。結果：18種單花蜜均具有不同程度的抑菌活性，且抑菌生長曲線均優于標準菌株對照孔，延長了3種致病菌的遲緩期持續時間、縮短了對數期持續時間和降低了最大細菌密度，其中小茴香蜂蜜最低抑菌濃度為7.5%，最低殺菌濃度為15%，均優于麥盧卡蜂蜜。結論：96微孔板改良法靈敏、快速、客觀、可直觀顯示不同的單花蜜具有抑菌活性差異，其中小茴香蜂蜜、葵花蜂蜜、椴樹蜂蜜活性最為顯著，本文為蜂蜜的功能評價與市場開發提供了科學依據。

關鍵詞：微孔板改良法;體外抑菌;小茴香蜂蜜;單花蜜

我國是世界養蜂大國，2016年我國蜂蜜產量高達48.14 萬t，出口數量占世界蜂蜜出口量的12.32%[1]，且我國地域遼闊，蜜源植物群落和種類名目繁多，分布極為廣泛。現代醫學發現，蜂蜜對革蘭氏陽性菌和陰性菌都有不同程度的抑制作用[2-5]，可加速創傷組織修復及對胃潰瘍和胃炎具有治療作用，國內外研究多發現尤以新西蘭的麥盧卡蜂蜜抗菌功效突出，被認為是一種特殊藥物，成為蜂蜜抑菌活性評價的標志性產品[6-7]。我國蜂蜜應用歷史悠久且蜂蜜種類繁多，數千年前蜂蜜就有被用來外敷傷口防治感染和消化道治療的記載[8-11]，但目前缺乏對于我國不同蜜源植物的單花蜜系統抑菌活性評價。因此，系統評價我國不同蜜源植物蜂蜜的抑菌特性，且與國外蜂蜜做對比研究，提升我國蜂蜜的功效價值與市場開發勢在必行。

目前，蜂蜜的體外抑菌評價方法多采用瓊脂擴散法[12-14]或營養肉湯梯度稀釋法[15]，瓊脂擴散法通常通過測定抑菌圈直徑的大小來定性抑菌活性，該法經典、簡單、易掌握，但精確度不高;營養肉湯梯度稀釋法常用來定量最小抑菌濃度，結果比瓊脂擴散法精確，但操作較為復雜，試劑耗費多，人為誤差大，不適用于樣品的高通量檢測。近年來，有報道96微孔板法[3，16]，其操作過程比較簡單，試劑耗費少，結果精確直觀，重復性好，但報道的文獻方法缺乏對抑菌遲緩期持續時間和對數期持續時間的評價，因此，本文將96微孔板法與抑菌生長曲線[17]方法結合建立了96微孔板改良法，可靈敏、快速、客觀地評價單花蜜的抑菌活性。采用96微孔板改良法，通過最低抑菌濃度、最低殺菌濃度、遲緩期持續時間、對數期持續時間和最大細菌密度等5 個抑菌指標，對12種國產單花蜜（洋槐、棗花、荊條、椴樹、葵花、小茴香、蕎麥、五味子、枸杞、黃連、土黃連、荔枝）和6種國外單花蜜（麥盧卡、薰衣草、紅桉樹、向日葵、橙花）的抑菌活性進行了系統評價。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

Mueller-Hinton Broth培養基（MHB），北京索萊寶科技有限公司;營養瓊脂、營養肉湯、腦心浸出液肉湯（BHI）、細菌瓊脂粉和血瓊脂平板，北京陸橋技術股份有限公司。

酶標儀SpectraMax i3x，基因有限公司;生化培養箱MMM Incucell 222，德國MMM公司;電熱恒溫水槽DK-450B，上海森信實驗儀器有限公司。

1.2 樣本采集及處理

單花蜜樣本，均購買自森蜂園、汪氏蜜蜂園、同仁堂、農科院等知名品牌，包括A洋槐蜂蜜（產地山東沂蒙）、B棗花蜂蜜（產地江西南昌）、C荊條蜂蜜（產地北京昌平）、D椴樹蜂蜜（產地長白山）、 E葵花蜂蜜（產地內蒙古臨河）、F小茴香蜂蜜（產地玉門）、G蕎麥蜂蜜（產地北京）、H五味子蜂蜜（產地北京）、I枸杞蜂蜜（產地浙江衢州）、J黃連蜂蜜（產地上海奉賢）、K土黃連蜜（產地江西南昌）、L荔枝蜂蜜（產地北京）、M薰衣草蜂蜜（產地西班牙）、N紅桉樹蜂蜜（TA 20+）（產地澳大利亞）、O向日葵蜂蜜（產地德國）、P橙花蜂蜜（產地法國）、Q麥盧卡蜂蜜（UMF 5+）（產地新西蘭）、R麥盧卡蜂蜜（UMF 15+）（產地新西蘭），均室溫避光保存。單花蜜樣品各取9g，加入10 mL無菌MHB培養基，以37℃水浴輔助溶解、混勻，然后用無菌MHB培養基逐級稀釋得到3.75%、7.5%、15%、30%、45%、60%、75%、90%（w/v）不同濃度的蜂蜜溶液，4℃冰箱保存，1周內使用。

1.3 菌種信息

金黃色葡萄球菌CICC 21600、沙門氏菌CICC 21513、大腸埃希氏菌CICC 21530，均為中國工業微生物菌種保藏中心提供。用BHI復蘇標準菌株，于營養瓊脂平板上37℃、24h進行復蘇傳代備用。實驗時取24h細菌，用無菌MHB培養基調整菌濃度為0.5 麥氏濁度（1×108CFU/mL），并用MHB培養基稀釋500倍作為實驗用細菌原液（2×105CFU/mL）。

1.4 最低抑菌濃度的測定

本實驗采用96微孔板法[16]測定最低抑菌濃度（MIC），樣品組每孔依次加入細菌原液10μL和不同濃度的蜂蜜溶液190μL，重復測定3 次，以無菌MHB培養基作為空白組，以細菌原液10μL加入無菌MHB培養基菌株190μL作為對照組。用酶標儀于600 nm測定培養前和37℃培養24h后的吸光度值，分別記為OD0和OD24，空白組調零，蜂蜜對細菌的抑制率按式（1）計算，抑制率為100%對應的最小蜂蜜濃度為該單花蜜的最低抑菌濃度（MIC）。

抑制率（%）=（1-樣品組OD24-樣品組OD0對照組OD24-對照組OD0）×100%（1）

1.5 最低殺菌濃度的測定

分別吸取1.4實驗中所有抑制率為100%相應孔的蜂蜜稀釋液各10μL到血瓊脂平板，均勻涂布后37℃培養24h，以允許小于0.1%的細菌生長，即血瓊脂平板上菌落數≤10對應的最小蜂蜜濃度，確定為該單花蜜的最低殺菌濃度（MBC）。

1.6 抑菌生長曲線

本實驗以96微孔板法為基礎，結合48h蜂蜜抑菌生長曲線的測定[17]形成96微孔板改良法，來測定蜂蜜對3種致病菌的抑菌活性，具體方法為：樣品組每孔依次加入細菌原液10μL和30%（w/v）的蜂蜜溶液190μL，重復測定3 次，以無菌MHB培養基作為空白組，以細菌原液10μL加入無菌MHB培養基菌株190μL作為對照組。采用酶標儀37℃孵育并于600nm連續測定吸光度值，每間隔10min振動5s，每30min測定1次吸光度值，持續測定48h，以持續時間為橫坐標、以吸光度值為縱坐標繪得3種致病菌在不同單花蜜的作用下48h內的生長曲線，計算出遲緩期持續時間、對數期持續時間和最大細菌密度等指標，結果以平均值±標準差表示（n=3）。

2 結果與分析

2.1 MIC和MBC測定結果

所有單花蜜樣本對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸埃希氏菌均有不同程度的抑菌活性，其中對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC分別為7.5%～75%和15%～90%，對沙門氏菌的MIC和MBC均為30%～60%，對大腸埃希氏菌的MIC和MBC分別為15%～60%和30%～75%;此外，不同蜜源的單花蜜抑菌差異顯著，其中E（葵花蜂蜜）、F（小茴香蜂蜜）對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC分別低達7.5%、15%，R（麥盧卡蜂蜜UMF 15+）對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC分別為15%、30%，F（小茴香蜂蜜）、R（麥盧卡蜂蜜UMF 15+）對沙門氏菌的MIC和MBC均為30%，對大腸埃希氏菌的MIC和MBC分別為15%、30%。結果顯示，葵花蜂蜜和小茴香蜂蜜對金黃色葡萄球菌的抑制效果優于麥盧卡蜂蜜UMF 15+，小茴香蜂蜜對沙門氏菌和大腸埃希氏菌的抑菌活性和麥盧卡蜂蜜相同（圖1）。

2.2 抑菌生長曲線結果

根據不同蜜源單花蜜（30% w/v濃度）對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸埃希氏菌的抑菌生長曲線（圖2），可以得出遲緩期持續時間、對數期持續時間和最大細菌密度。由附表可知，與標準菌株對照組對比，18種單花蜜均延長了對3種致病菌的遲緩期持續時間、縮短了對數期持續時間和降低了最大細菌密度，其中對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸埃希氏菌的遲緩期持續時間分別為≥6.7±0.3h、≥7.6±0.3h、≥7.3±0.3h;對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸埃希氏菌的對數期持續時間分別為0～9.3h、0～5.3h和0～5.8h;對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸埃希氏菌的最大細菌密度以最大吸光度值表示，分別為0～0.64、0～0.50和0～0.66。研究發現，D（椴樹蜜）對金黃色葡萄球菌的生長曲線具有明顯抑制作用，E（葵花蜜）、F（小茴香蜂蜜）、N（紅桉樹蜜）、O（向日葵蜜）和R（麥盧卡蜂蜜UMF 15+）在48h內未見3種致病菌生長，對致病菌具有顯著的完全抑制活性，抑菌生長曲線均為吸光度值為零的直線。

3 結論

本研究采用96微孔板改良法，測定了不同蜜源單花蜜的最低抑菌濃度、最低殺菌濃度、遲緩期持續時間、對數期持續時間和最大細菌密度5個指標，該方法靈敏、快速、客觀，可直觀對比國內外18種單花蜜的抑菌活性及差異。所有樣本均具有差異顯著的抑菌活性，且抑菌生長曲線均優于標準菌株對照孔，延長了3種致病菌的遲緩期持續時間、縮短了對數期持續時間和降低了最大細菌密度，其中D（椴樹蜜）、E（葵花蜜）、F（小茴香蜂蜜）、N（紅桉樹蜜）、O（向日葵蜜）和R（麥盧卡蜂蜜UMF 15+）活性顯著，尤以葵花蜂蜜和小茴香蜂蜜的抑菌活性優于麥盧卡蜂蜜，本文的研究結果為提升我國蜂蜜的功效價值與小眾蜂蜜的市場開發提供了科學依據。蜂蜜化學成分復雜，富含多種氨基酸、維生素、礦物質、微量元素等營養成分，同時還含有多種酚酸類、黃酮類、過氧化氫等活性物質[18]，因此，可進一步開展蜂蜜的抑菌成分與功效相關性研究，為蜂蜜在臨床用藥和食物保健等方面提供科學依據，為蜂蜜的多元化應用開辟更加廣闊的前景。

參考文獻

[1]Shen S，Wang J，Zhuo Q，et al.Quantitative and discriminative evaluation of contents of phenolic and flavonoid and antioxidant competence for Chinese honeys from different botanical origins[J].Molecules，2018，23（5）：1110.

[2]黃東萍，蔣貴發，周文譽，等.幾種蜂蜜對幽門螺旋桿菌的體外抗菌作用[J].時珍國醫國藥，2006，17（1）：1989-1990.

[3]Nishio E K，Ribeiro J M，Oliveira A G，et al.Antibacterial synergic effect of honey from two stingless bees：Scaptotrigona bipunctata Lepeletier，1836，and S.postica Latreille，1807[J].Scientific Reports，2016（6）：21641.

[4]Huttunen S，Riihinen K，Kauhanen J，et al.Antimicrobial activity of different finnish monofloral honeys against human pathogenic bacteria[J].APMIS，2012，121（9）：827-834.

[5]孔祥溢，關健，楊義，等.蜂蜜促進創傷愈合的免疫調控機制研究進展[J].醫學研究雜志，2015，44（10）：18-21.

[6]Oelschlaegel S，Gruner M，Wang P N，et al.Classification and characterization of manuka honeys based on phenolic compounds and methylglyoxal[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2012，60（29）：7229-7237.

[7]Stephens J M，Schlothauer R C，Morris B D，et al.Phenolic compounds and methylglyoxal in some New Zealand manuka and kanuka honeys[J].Food Chemistry，2010（1）：78-86.

[8]Majno G.The healing hand：man and wound in the ancient world[J].Plastic and Reconstructive Surgery，1976（2）：230.

[9]ZumLa A，Lulat A.Honey-a remedy rediscovered[J].Journal of the Royal Society of Medicine，1989，82（7）：384-385.

[10]Israili Z H.Antimicrobial properties of honey[J].American Journal of Therapeutics，2014，21（4）：304-323.

[11]Malone M，Tsai G.Wound healing with apitherapy：a review of the effects of honey[J].Journal of Apitherapy，2016，1（1）：29-32.

[12]Roshan N，Rippers T，Locher C，et al.Antibacterial activity and chemical characteristics of several Western Australian honeys compared to manuka honey and pasture honey[J].Archives of Microbiology，2017，199（2）：347-355.

[13]Irish J，Blair S，Carter DA.The antibacterial activity of honey derived from Australian flora[J].PLoS One，2011，6（3）：e18229.

[14]Motamayel F A，Hendi S S，Alikhani M Y，et al. Antibacterial activity of honey on cariogenic bacteria[J].Journal of Dentistry，2013，10（1）：10-15.

[15]Rezvani M B，Niakan M，Kamalinejad M，et al.The synergistic effect of honey and cinnamon against Streptococcus mutans bacteria[J].Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine，2017，7（4）：314-320.

[16]Deng J，Liu R，Lu Q，et al.Biochemical properties，antibacterial and cellular antioxidant activities of buckwheat honey in comparison to manuka honey[J].Food Chemistry，2018，252（30）：243-249.

[17]Rodríguez B A，Mendoza S，Iturriga M H，et al.Quality parameters and antioxidant and antibacterial properties of some Mexican honeys[J].Journal of Food Science，2012，71（1）：C121-127.

[18]伊作林，楊柳，席芳貴，等.蜂蜜成分及功能活性的研究進展[J].中國蜂業，2018（4）：51-54.

Abstract：Objective To evaluate the antibacterial activities of various domestic and foreign various monofloral honeys in-vitro systematically.Method Using 96-well microplates modified method，monofloral honeys were diluted in sterile Mueller-Hinton Broth medium to obtain different concentrations from 3.75% to 90%（w/v），compared with blank sterile medium and standard strain，5 indicators of antibacterial activities of the 18 monofloral honeys against Staphylococcus aureus， salmonella and Escherichia coli were determined，including minimum inhibitory concentration，minimum bactericidal concentration，lag phase duration，logarithmic duration and maximum bacterial density.Result It was indicated that the 18 monofloral honeys had different antibacterial activities，and were better than the standard strain control well based on the inhibition growth curves.The 18 monofloral honeys prolonged the durations of lag phase，shortened durations of logarithmic duration and reduced the maximum bacterial density against three pathogenic bacteria.The minimum inhibitory concentration and the minimum bactericidal concentration of fennel honey was 7.5% and 15%，which were better than Manuka honey.Conclusion 96-well microplates modified method is sensitive，fast，objective and intuitive to indicate that different monofloral honeys have discrepant antibacterial activities，especially fennel honey，sunflower honey and linden honey can remarkably inhibited the growth of three pathogenic bacteria，which provided the scientific basis for functional evaluation and market development of honeys.

Keywords：Microplates Modified Method;antibacterial activity in vitro;fennel honey;monofloral honey

（責任編輯 李婷婷）