啶氧菌酯降解菌的分離鑒定及其降解特性研究

祝騰輝 羅香文 李聰 張德詠 劉勇

摘要：【目的】篩選可高效降解啶氧菌酯的微生物資源，并研究其降解特性，為啶氧菌酯等甲氧基丙烯酸酯類農藥殘留的微生物修復提供新資源。【方法】采用富集培養法分離啶氧菌酯降解菌，以生理生化特征結合16S rRNA序列系統發育分析鑒定降解菌;利用氣相色譜儀（HPLC）測定啶氧菌酯殘留量，分析其降解特性;采用氣相色譜質譜聯用儀（GCMS）測定降解菌降解啶氧菌酯的中間代謝產物，分析降解菌降解啶氧菌酯的代謝途徑。【結果】分離獲得一株能以啶氧菌酯為唯一碳源的降解菌株（PY3），其生理生化特征結合16S rRNA序列系統發育分析結果表明，PY3菌株屬沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris）。PY3菌株最佳生長條件測定和降解特性分析結果表明，PY3菌株生長和降解啶氧菌酯的最佳條件為pH 6.0、35 ℃，在最佳降解條件下培養11 d，對50 mg/L啶氧菌酯的降解率可達72.0%。PY3菌株降解啶氧菌酯的途徑包括苯環和N雜環間氧橋鍵斷裂后酯化，以及苯環和N雜環開環反應。【結論】沼澤紅假單胞菌PY3菌株具有高效降解啶氧菌酯的活性和較廣的pH和溫度耐受性，且具有應用于農田生態環境中啶氧菌酯等甲氧基丙烯酸酯類農藥殘留物微生物修復的潛力。

關鍵詞： 啶氧菌酯;分離;鑒定;沼澤紅假單胞菌;降解特性

中圖分類號： S481.8;X592? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）06-1256-07

Abstract：【Objective】The microorganisms which could effectively degrade picoxystrobin were selected and their degrading characteristics were analyzed. It would provide new resources for microbial remediation of methoxy acrylates pesticide residue such as picoxystrobin. 【Method】Picoxystrobin degrading strains were isolated by enrichment culture， and the degrading strains were analyzed and identified through physiological， biochemical characteristics and phylogenetic analysis of 16S rRNA gene sequences. Residue of picoxystrobin was quantified by gas chromatograph（HPLC）， and the degrading characteristics were also studied. Metabolics of picoxystrobin in degrading process were identified by gas chromatograph-mass spectrometer（GCMS）， and metabolic pathways of degrading process of the strain on picoxystrobin were analyzed. 【Result】A degrading strain PY3 which took picoxystrobin as the only carbon source was isolated. Physiological， biochemical characteristics and phylogenetic analysis of 16S rRNA sequences indicated that strain PY3 was Rhodopseudomonas palustris. The optical growth and degrading picoxystrobin conditions of strain PY3 were pH 6.0 and 35 ℃. Under the optimal degradation conditions， up to 72.0% of 50 mg/L picoxystrobin could be degraded by strain PY3 in 11 d. Metabolic pathways of picoxystrobin degraded by strain PY3 included oxygen bridge bond between benzene ring and N-containing heterocyclic ring braking and ring-opening reaction of benzene ring and N-containing heterocyclic ring. 【Conclusion】R. palustris PY3 has excellent picoxystrobin degradation capacity and broad pH and temperature tolerance. It can be applied to repair of methoxy acrylates pesticide residues such as picoxystrobin in field eco-environment.

Key words： picoxystrobin; isolation; identification; Rhodopseudomonas palustris; degrading characteristics

收稿日期：2018-12-19

作者簡介：*為通訊作者，劉勇（1966-），博士，研究員，主要從事植物病害綜合防控技術研究工作，E-mail：haoasliu@163.com。祝騰輝（1993-），研究方向為農藥殘留微生物修復，E-mail：1039711761@qq.com

0 引言

【研究意義】啶氧菌酯是一種高效甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，其作用機理是通過抑制病原菌細胞色素b和C1間的電子轉移，從而抑制線粒體的呼吸作用，即線粒體呼吸抑制劑（Guan et al.，2011）。啶氧菌酯的內吸活性很強，對銹病和葉斑病具有優異的防控效果（趙平等，2011）。目前，啶氧菌酯在我國的登記范圍正逐步擴大，已登記用于水稻稻曲病等病害的防控（阮宏椿等，2013）。隨著啶氧菌酯應用范圍的擴展和使用量的上升，其對環境中非靶標的潛在毒性及生態環境安全風險成為業界關注的熱點。最新研究表明，啶氧菌酯對非靶標生物蚯蚓具有中等毒性（Wang et al.，2012）;高劑量啶氧菌酯對家蠶具有記性毒性和發育毒性（謝道燕等，2014）。除了對非靶標具有急性毒性外，更嚴重的是，長期暴露下啶氧菌酯對非靶標生物還具有潛在的慢性毒性。啶氧菌酯對蟾蜍蝌蚪具有致畸性，48 h的半致畸性濃度低至61.00～84.13 μg/L（Li et al.，2016）。但啶氧菌酯對非靶標的慢性毒性機制目前尚不明確，因此，啶氧菌酯殘留的生態風險，以及如何消除啶氧菌酯在農田生態環境中的殘留污染已成為當前急需解決的環境問題。【前人研究進展】在自然環境中，甲氧基丙烯酸酯類農藥的降解方式主要有光分解、水解和微生物分解等（孫建光等，2008）。關于甲氧基丙烯酸酯類農藥的微生物降解研究中，Hocinatab和Boudemagha（2016）從活性淤泥中篩選到可高效降解多種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的芽孢桿菌屬（Bacillus）菌株。Wo?ejko等（2016）從土壤中篩選到能夠降解啶氧菌酯及其他多種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的復合微生物菌群，從復合微生物菌群中還篩選獲得一株高效降解酵母菌;相比復合微生物菌群，單個微生物菌株的降解效率更高。此外，采用選擇性培養基篩選到的降解菌還包括假單胞菌屬（Pseudomonas）和蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）等，這些降解菌均能降解包括啶氧菌酯在內的多種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑（Howell et al.，2014）。深入的降解機理研究表明，啶氧菌酯微生物降解的初始步驟為酯鍵斷裂，相應的降解酶基因鑒定為甲氧基丙烯酸酯甲基酯酶基因（Clinton et al.，2011）;吳龍飛等（2016）研究也得到相似的結果，紅假單胞菌降解啶氧菌酯的初始步驟為斷裂其酯鍵。然而，啶氧菌酯降解初始步驟之后的降解步驟尚需進一步探究。【本研究切入點】已報道許多降解菌資源本身可能具有環境風險，如假單胞菌屬降解菌的生物安全性需進一步試驗研究，才能應用于啶氧菌酯污染的生物修復。因此，篩選更多優異的降解菌資源，將有助于啶氧菌酯等甲氧基丙烯酸酯類農藥微生物修復的產業化應用。此外，對啶氧菌酯降解初始步驟之后的代謝產物目前研究較少，限制了降解微生物應用的環境安全性分析。【擬解決的關鍵問題】采用富集培養法篩選能以啶氧菌酯為唯一碳源的啶氧菌酯降解菌，以生理生化特征結合16S rRNA序列系統發育分析鑒定降解菌;利用高效液相色譜儀（HPLC）測定啶氧菌酯殘留量，分析降解菌的降解特性;采用氣相色譜質譜聯用儀（GCMS）測定降解菌降解啶氧菌酯的中間代謝產物，分析降解菌降解啶氧菌酯的代謝途徑，為農田啶氧菌酯殘留的微生物修復提供新資源。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 主要培養基 篩選和分離培養基（無碳源MSM培養基）：NH4NO3 1.0 g/L、NaCl 0.5 g/L、（NH4）2SO4 0.5 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、K2HPO4 1.5 g/L、pH 7.0;選擇培養基：在MSM培養基（無碳源）中分別加入質量濃度為50、100和150 mg/L的啶氧菌酯;相應的固體培養基為對應的培養基中添加1.5%瓊脂糖。

1. 1. 2 主要試劑及儀器設備 啶氧菌酯原藥（有效成分含量96%，武漢鴻睿康試劑有限公司）;農藥殘留萃取及檢測所用試劑均為色譜純。HPLC（e2695，Waters，美國），GCMS（Agilent 6890N，美國）。

1. 2 啶氧菌酯降解菌富集培養及分離純化

從位于湖南長沙縣春華基地農田排水渠采集底泥，取2.0 g底泥添加到120 mL的MSM培養基中，并添加啶氧菌酯使其終濃度為50 mg/L，于35 ℃、3000 lx光照培養至渾濁或有明顯顏色變化，取0.5%菌液接種至終濃度為100 mg/L啶氧菌酯的MSM培養基中，培養條件同上，重復以上步驟至啶氧菌酯濃度為150 mg/L。使用終濃度為150 mg/L啶氧菌酯的雙層MSM固體培養基，劃線法分離降解菌。挑取形態不同的菌落至含150 mg/L啶氧菌酯的MSM液體培養基中，培養至菌液濃度為109 CFU/mL，作為后續試驗的接種液。

1. 3 分離菌株鑒定

1. 3. 1 生理生化特征鑒定 分離菌株的生理生化特征鑒定參照《常見細菌系統鑒定》（蔡妙英和東秀珠，2001）。

1. 3. 2 分離菌株活細胞吸收光譜測定 低速離心分離菌株培養液，取沉淀用0.9%生理鹽水洗滌3次，然后用0.9%生理鹽水重懸浮，用分光光度計測定分離菌株細胞在波長300～900 nm的吸收值。

1. 3. 3 分離菌株16S rRNA序列測定及系統發育分析 采用CTAB法提取分離菌株基因組DNA;以細菌總DNA為模板，用細菌16S rRNA序列通用引物（27F：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAg-3';1492R：5'-

GGTACCTTGTTACGACTT-3'）進行PCR擴增。PCR反應體系（20.0 μL）：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP（10 μmol/L）0.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA聚合酶 0.5 μL，ddH2O 15.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性2 min;94 ℃ 50 s，52 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，進行30個循環;72 ℃延伸10 min。PCR產物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的條帶，參照全式金至pEASY-T1 Cloning Kit使用說明將目的片段連接gcffpEASY-T1克隆載體并轉化大腸桿菌，挑取單菌落進行PCR驗證，陽性菌落送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。所得基因序列在GenBank進行BLAST比對分析。運用ClastW進行序列聯配分析，采用MEGA 7.0構建Neighbor-Joining系統發育進化樹。

1. 4 分離菌株最佳生長條件測定

在120 mL的MSM培養基（pH 7.0）中，接種0.5%的分離菌菌液，分別置于15、25、35、45和50 ℃下進行光照培養，5 d后測定菌液在波長660 nm處的吸光值。分別在pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的MSM培養基中接種0.5%的分離菌菌液，35 ℃下光照培養，5 d后測定菌液在波長660 nm處的吸光值。每處理3個重復。

1. 5 不同初始條件啶氧菌酯降解試驗

于120 mL的MSM培養基（pH 7.0）中添加啶氧菌酯至終濃度為50 mg/L，再接種0.5%的分離菌菌液，分別于15、25、35、45和50 ℃光照條件下培養，5 d后萃取啶氧菌酯，采用HPLC檢測啶氧菌酯殘留量。分別在pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的MSM培養基中接種0.5%的分離菌菌液，然后添加啶氧菌酯至終濃度為50 mg/L，35 ℃光照條件下培養，5 d后萃取啶氧菌酯，采用HPLC檢測啶氧菌酯殘留量。每處理3個重復。

1. 6 啶氧菌酯最佳條件下降解動態

于MSM培養基（pH 7.0）中接種0.5%分離菌菌液，添加啶氧菌酯至終濃度為50 mg/L，35 ℃光照條件下培養，分別于培養1、3、5、7、9 和11 d取樣，采用HPLC檢測啶氧菌酯殘留量。

1. 7 啶氧菌酯殘留量測定

采用正己烷萃取凈化啶氧菌酯，HPLC測定啶氧菌酯殘留量（羅香文等，2016）。柱溫30 ℃，檢測波長225 nm，上樣量10 μL，流速1 mL/min，流動相30∶70=水∶乙腈。以啶氧菌酯標準品定性定量，所有試驗重復3次。

1. 8 啶氧菌酯降解中間代謝產物測定

定期取樣，采用正己烷萃取中間代謝產物，用GCMS進行掃描鑒定（吳龍飛等，2016）。儀器鑒定條件：色譜柱為HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;采用全掃描方式，質量范圍50～550 eV;電子轟擊能70 eV;進樣口溫度220 ℃，氦氣流量1.0 mL/min。升溫程序：初始溫度120 ℃，保持3 min，以10 ℃/min的速度升溫至200 ℃，再以5 ℃/min速度升溫，終止溫度250 ℃，保持5 min;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃。

2 結果與分析

2. 1 菌株的分離和鑒定結果

2. 1. 1 菌株分離及形態和生理生化特征 采用啶氧菌酯為唯一碳源的選擇性培養基篩選獲得一株菌落為紅色的菌株，命名為PY3。革蘭氏染色結果顯示，PY3菌株為革蘭氏陰性、短桿狀;生理生化鑒定結果顯示，PY3菌株的甲基紅反應和V-P反應呈陰性，檸檬酸鹽反應和過氧化氫酶反應呈陽性，吲哚試驗呈陰性，不能水解淀粉。

2. 1. 2 菌體色素掃描結果 PY3菌株菌體色素掃描結果如圖1所示，菌體色素在波長360、590、820和880 nm處有明顯的吸收峰，表明PY3菌株的菌體中存在類胡蘿卜素和菌綠素（Yin et al.，2012）。

2. 1. 3 PY3菌株16S rRNA序列系統發育分析? PY3菌株測定獲得的16S rRNA序列長度為1374 bp（GenBank登錄號MH997434），與沼澤紅假單胞菌（KF926677）的同源性最高，達100%。進一步的系統發育進化樹分析結果（圖2）表明，PY3菌株與Rhodopseudomonas palustris（KF926677）的親緣關系較近，聚為一個亞簇。

2. 2 PY3菌株最佳生長條件測定結果

PY3菌株在不同pH和溫度條件下的生長結果（圖3和圖4）表明，PY3菌株在25～35 ℃、pH 6～8內生長良好，其最佳生長條件為pH 6、35 ℃。

2. 3 PY3菌株的降解特性

2. 4 最適條件下啶氧菌酯降解動態

如圖5所示，在最佳降解條件下（pH 6、35 ℃）培養1～5 d時，PY3菌株的生物量累積較慢，其降解啶氧菌酯的效率較低;培養7 d后，隨PY3菌株的生物量快速增加，其降解啶氧菌酯的效率快速上升;培養11 d時，接種PY3菌株處理的啶氧菌酯殘留量為12 mg/L，降解率為72%。

2. 5 PY3菌株降解啶氧菌酯的機制

2. 5. 1 PY3菌株降解啶氧菌酯中間代謝產物分析 采用GCMS掃描鑒定PY3菌株降解啶氧菌酯的中間代謝產物，結果（圖6）顯示，培養1 d時，啶氧菌酯快速降解為中間產物峰2，隨后中間產物峰2快速降解，產生中間產物峰3和峰4;與培養1 d相比，培養5 d時啶氧菌酯的殘留量下降約20%（峰1）。培養5 d時，GSMS掃描圖上有一些峰的豐度上升，表明這些中間代謝產物的生成量上升。

譜庫檢索結果（圖7～圖9）表明，PY3菌株降解啶氧菌酯的中間產物分別為：啶氧菌酯（峰1）、9，12，15-Octadecatrienoic acid（保留時間10.9363 min，峰2）、Dibutyl phthalate（保留時間8.711 min，峰3）和3，4-Methylene dioxy-β-nitrostyrene（保留時間9.902 min，峰4）。

2. 5. 2 推導的降解途徑 依據GCMS鑒定的中間代謝產物，PY3菌株降解啶氧菌酯推導的降解途徑包括苯環和N雜環間氧橋鍵斷裂后酯化，生成產物A;苯環和N雜環開環反應，產生中間代謝B和C;中間產物A也可能降解為產物C（圖10）。

3 討論

啶氧菌酯是甲氧基丙烯酸酯類殺蟲劑，目前在我國的登記范圍和使用量正逐步上升（趙平等，2011），而殘留于農田生態環境中的啶氧菌酯量也隨之增加，其對生態環境的潛在威脅日益成為業界關注的熱點。本研究利用富集培養法分離到一株能以啶氧菌酯為唯一碳源生長的PY3菌株，鑒定為沼澤紅假單胞菌（R. palustris）。沼澤紅假單胞菌是典型的光合細菌，現有研究表明，光合細菌是一類益生菌，在農業部微生物肥料登記的微生物分類中被定義為A.1菌株，無需進行毒理學試驗。光合細菌在環境污染物（Haritash and Kaushik，2009）和殺蟲劑（Luo et al.，2018）等修復方面具有較好的應用前景。

本研究結果表明，PY3菌株生長和降解啶氧菌酯具有較好的pH和溫度耐受性，與已報道的降解菌降解特性類似（Howell et al.，2014; Hocinatab and Boudemagha，2016;Wo?ejko et al.，2016;李兵和張博，2017），表明該菌株具有較好的環境適應性，具有應用于我國大部分地區農田生態環境中啶氧菌酯殘留微生物修復的潛力。

對甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的降解機理研究表明，微生物降解甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的基因為甲氧基丙烯酸酯甲基酯酶基因（Strobilurin me-thyl esterase），酯化啶氧菌酯的-O-鍵（Clinton et al.，2011）。吳龍飛等（2016）研究表明，紅假單胞菌PID-1降解啶氧菌酯的降解途徑包含啶氧菌酯的-O-鍵斷裂和苯環測鏈氧化，以及苯環開環反應等降解步驟。本研究中，PY3菌株降解啶氧菌酯的降解途徑除酯化啶氧菌酯的-O-鍵外，還能將啶氧菌酯的N雜環打開，表明PY3菌株可能編碼降解啶氧菌酯的新基因，這些新降解基因的克隆與定性研究將是下一步的研究重點，其研究結果有助于解析PY3菌株降解啶氧菌酯的機制，也為構建高效降解甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留物的工程菌提供科學依據。

4 結論

運用富集培養法分離到一株能以啶氧菌酯為唯一碳源生長的光合細菌PY3菌株，鑒定為沼澤紅假單胞菌。PY3菌株具有高效降解啶氧菌酯的活性和較廣的pH和溫度耐受性，且具有應用于農田生態環境中啶氧菌酯等甲氧基丙烯酸酯類農藥殘留物微生物修復的潛力。

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（責任編輯 麻小燕）