刺猬紫檀HPLC指紋圖譜研究

魏建華 紀玲珍 吳劍光 魏霜

摘要 利用反相高效液相色譜法分析了8批刺猬紫檀樣品，采用相似度分析軟件“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”計算處理，相似度均在0.9以上;建立了由6個共有特征峰組成的刺猬紫檀指紋圖譜，同時對該指紋圖譜檢測方法進行方法學考察。該方法結果準確、重復性好，所建立的指紋圖譜可作為刺猬紫檀的輔助鑒定，鑒定指標客觀，鑒定方法簡便，為刺猬紫檀的無損真偽鑒別提供了新方法。

關鍵詞 液相色譜;指紋圖譜;刺猬紫檀;鑒別

中圖分類號：R796.9?文獻標識碼：A?文章編號：2095-3305（2019）06-119-05

DOI： 10.19383/j.cnki.nyzhyj.2019.06.046

Fingerprint Analysis of Pterocarpus erinaceus Poir by HPLC

WEI Jian-huaet al（1.Center of Technology， Shantou EntryExit Inspection and Quarantine Bureau， Shantou，Guangdong515041;2. Shantou Customs District，Shantou，Guangdong515031）

Abstract?Eight batches of Pterocarpus erinaceus Poir were determined by RPHPLC. The similarity analysis software "similarity evaluation system of Chinese traditional medicine chromatogram fingerprint（2012 edition）" was used to calculate and process the eight batches of P. erinaceus and the similarities were above 0.9. The fingerprint of P.erinaceus. was established which was composed of six common characteristic peaks，and the method of fingerprint detection was investigated. The method was accurate with good reproducibility. As a reference，the fingerprint can be used as an auxiliary identification of P. erinaceus，which was characterized by objective identification index，simple identification method and nondamage detection. It provided a new method for the nondestructive identification of P. erinaceus.

Key words HPLC;Fingerprint;Pterocarpus erinaceus Poir; Identification method

紅木作為一類珍貴的木材資源，不是樹木分類學上某個樹種的名稱，而是來源于明清時代的宮廷、王府及不同地區的生產者和經銷商，長期自然形成的經過歸類的木材商品名。由于其具有特征性顏色與良好物理力學性能而備受人們青睞，在不同時代、不同地區，紅木都有著不同的內涵[1]。由于紅木資源非常短缺，隨著人民生活水平的提高，人們對木材質量的追求越來越高，因此紅木價格很高，不同種類的紅木價格差別又極大。由于紅木造假利潤空間極大，于是市場上以次充好、以假亂真的現象較為普遍。

刺猬紫檀（Pterocarpus erinaceus Poir）是紫檀屬花梨木類樹木，主要產地為塞內加爾、幾內亞比紹等熱帶非洲國家。刺猬紫檀是珍貴紅木之一，已經進入《瀕危野生動植物種國際貿易公約》（簡稱CITES公約）目錄，得到管制和保護。其是貴重家具及美術工藝品的原材料，由于成材需時長，加之材質耐用，能散發一定的香氣，具有很高的市場價值和使用價值。刺猬紫檀作為紅木原材，價格相對比較便宜，廣泛用于紅木家具制造產業。市場所售刺猬紫檀常常會出現摻假現象，一方面常被不法分子用來冒充價格相對較高的紅木，如巴里黃檀;另一方面也有不是紅木的膠漆樹、木莢豆被用來冒充刺猬紫檀，因此對其進行真偽鑒別極有必要。

1?紅木鑒定方法概述

木材識別是一種實踐性和專業性都很強的工作，需要從業者具有較強的木材構造專業知識和豐富的鑒定經驗。傳統木材鑒定主要是以簡便實用的宏觀特征（如密度、材色、重量、結構和紋理）為依據來確定，輔以必要的木材解剖特征與觀察記載相比較，從而實現對木材的鑒定[2-3]。但這種方法往往只能將紅木鑒定到類，鑒定到種就比較困難，存在一定的人為因素。而同屬同類的不同樹種間價格差異懸殊，因此不能很好地滿足木材交易市場、木材經銷商和消費者的實際需求。

在紅木識別中，對紅木家具或工藝品的識別比原木識別更具有實際價值。然而傳統木材鑒定過程中截取樣品要滿足徒手切片或切片機切片的要求，木樣長、寬、高的尺寸有一定的要求，長度紋理方向與樹干方向平行，寬度和高度紋理方向與樹干方向垂直，但由于一套紅木家具或工藝品價值很高，紅木所有者難以接受傳統木材識別方法對樣品造成的破壞。另外，受樹木立地條件的影響，木材構造存在差異，即使是同一株樹，不同的樹高和樹徑部分的微觀構造有一定的差異[4-5]，而且截取的樣品并沒有包含一個完整的生長輪，在觀察其切面微觀構造特征時存在一定的局限性，影響鑒定結果的準確性。

研究人員也嘗試將分子生物學DNA鑒定技術引入紅木鑒定[6]，但是紅木樣品無論是家具還是木材往往保存時間已經很長，由于紅木是心木，心木的細胞均死亡很久，DNA受到很大程度的破壞，DNA的提取受到很大限制，所以很難應用于實際。

近幾十年，色譜指紋圖譜技術已經越來越多地被用于蜂蜜、中藥材、茶葉等，特別是在中藥材地道性上應用最為廣泛，具有非常重要的應用價值。近年來，色譜指紋圖譜技術也逐漸被運用于紅木輔助鑒定。紅木由于生長的立地條件不同，同一樹種木材的密度、材色、管孔分布類型（生長輪類型）、紋理、結構等都有不同程度的變異，即使同一樹株，在不同的樹高和樹徑部位的木材也有差異。但是作為同一樹種的木材，特別是心木，一個基本假設就是總會含有一些共同的化學物質，化學物質量之間的比例有一定的規律，不同種紅木樣品含有不同的化學物質。HPLC指紋圖譜技術就是提取同樹種心木的共有特征，相同的保留時間代表有相同的化學物質，峰面積之間的比例關系代表化學物質之間量的關系，從而印證和利用這個基本假設進行木材鑒定。沈明月等[7]應用HPLC技術構建了印度紫檀、大果紫檀、東非黑黃檀、盧氏黑黃檀的指紋圖譜，可用于這些紅木的輔助鑒定。羅莎[8]利用GC-MS技術構建了大果紫檀、交趾黃檀、微凹黃檀、盧氏黑黃檀的指紋圖譜，并結合木材構造特征探索了指紋圖譜信息對木材分類與鑒別的作用。以上研究說明了色譜指紋圖譜技術用于紅木鑒定是可行的，是一種人為因素較小、分辨率高、特異性強的輔助傳統方法的木材識別方法。

該文利用汕頭出入境檢驗檢疫局多年來從事紅木進出口檢驗檢疫業務積累的、經廣東出入境檢驗檢疫局技術中心國家木制品檢測重點實驗室復核鑒定的標本，改進紅木色譜指紋圖譜技術，采用相似度分析軟件“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”計算處理，建立了由6個共有特征峰組成的刺猬紫檀指紋圖譜并應用于刺猬紫檀的真偽鑒定。該方法突出特點是無損、快速和客觀，由于取樣量僅為0.2 g，對于成品家具或藝術品實現一定意義上的無損傷檢測;操作簡便，耗時短，做到快速鑒別;由于避免了人為的主觀判斷，因此是一種客觀的鑒定方法，對于木材交易市場、木材經銷商、消費者、公安機關、海關和科研機構等具有很強的應用價值。

2?試驗設計

2.1?試驗材料

試驗材料來自汕頭出入境檢驗檢疫局多年來積累的從非洲尼日利亞等原產地進口的刺猬紫檀標本，所有的樣品都通過木材鑒定人員的鑒定，結合原產地資料正確定名的樹種樣品，并經廣東出入境檢驗檢疫局技術中心國家木制品檢測重點實驗室復核鑒定。

2.2?儀器與試劑

選用Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國）：DAD檢測器，四元梯度泵;Millipore Advantage A10超純水系統（美國）;梅特勒-托利多AL204IC電子分析天平（瑞士）;CBL photoelectron TECHNOLOGY Model C9860A型超聲波清洗器。液相用乙腈為色譜純;液相用水為超純水;其余試劑均為分析純。

2.3?色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDBC18，填料粒徑5 μm，柱長250 mm，柱內徑4.6 mm;流動相：以水為流動相A，乙腈為流動相B，按照表1進行梯度洗脫;檢測波長：290 nm;柱溫：30℃;流速：1.0 ml/min。

2.4?供試品制備

稱取刺猬紫檀樣品（已經通過傳統木材形態學鑒定，被正確定名的樣品）心材部分木屑0.2 g（精確至0.001 g），置于50 ml離心管中，加入5 ml甲醇、5 ml高純水，震搖5 min，超聲提取5 min，濾紙過濾，再以0.2 μm的微孔濾膜過濾后備用[7]。

2.5?樣品測定

吸取上述步驟所得供試品溶液，注入高效液相色譜儀中進行高效液相色譜檢測，進樣量為20 μl。按照上述色譜條件分析測定，采集103 min色譜數據。

2.6?數據分析

將經過高效液相采集的木材圖譜，導入色譜指紋圖譜相似度評價軟件中進行指紋圖譜共有峰、強峰、特征峰確證和相似度分析，通過多個同種紅木樣品，建立該珍貴木材的對照圖譜，并建立譜庫。

對于每個收集到的刺猬紫檀樹種的高效液相采集圖譜，將其導入國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”，選取時間窗寬度為0.1～0.2 min，以中位數生成對照圖譜，經過多點校正后自動匹配，生成其指紋圖譜對照圖譜，并計算所比對批次樣品的指紋圖譜與該對照圖譜的相似度。在多批刺猬紫檀的共有峰中篩選出峰比高的且穩定出現的峰作為刺猬紫檀標準指紋圖譜的特征峰，從而建立刺猬紫檀的標準指紋圖譜。

3?結果與分析

3.1?刺猬紫檀的HPLC標準指紋圖譜

選定8批刺猬紫檀樣品，將其導入國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”，選取時間窗寬度為0.2 min，以中位數生成對照圖譜，經過多點校正后自動匹配，生成刺猬紫檀指紋圖譜共有模式，并計算8批樣品的指紋圖譜與該共有模式的相似度（表2）。8批刺猬紫檀與標準指紋圖譜相似度計算結果分別為：0.998、 0.995、 0.984、 0.999、 1、0.998、0.999、0.999、8批樣品的相似度在0.984以上。

該共有模式含有6個共有峰，經驗證這6個共有峰的性噪比S/N都大于10，說明峰信號穩定，在8批次的刺猬紫檀里都穩定出現，故確定該共有峰即為特征峰，保留時間分別為31.862、35.231、 46.415、 58.021、 63.243、 84.681 min，RSD<0.5%（表3）。

不同的樣本在進行后續數據處理時，需要同一組分在不同樣本中的保留時間一致，因此要對色譜保留時間和保留面積數據進行標準化，求得相對值，以避免色譜峰漂移對分析結果的影響。6號峰峰面積最大，以其為參照確定6個共有峰（即特征峰）為構成刺猬紫檀指紋圖譜的特征峰，樣品共有峰的相對保留時間和峰面積分別見表4、5。共有指紋峰相對保留時間的RSD值均小于0.3%，由于紅木立地條件的差異較大，1號峰相對峰面積的RSD值小于0.5%，2號峰相對峰面積的RSD值小于0.8%，3號峰相對峰面積的RSD值小于0.7%，4號峰相對峰面積的RSD值小于0.5%，5號峰相對峰面積的RSD值小于1.5%。6個共有峰相對保留時間的tg分別為：0.376、0.416、0.548、0.685、0.837、

1.000、RSD<0.3%。

測定8批刺猬紫檀HPLC指紋圖譜，并進行分析比較，得到由其共有特征峰構成的刺猬紫檀HPLC的標準指紋圖譜（圖1、2）。

3.2?方法學考察

3.2.1?精密度試驗?取同一供試品溶液（C3），依據2.3色譜條件和2.5樣品測定方法，連續進樣5次。采用中藥色譜指紋圖譜評價分析系統（2012版）對其指紋圖譜進行分析，與生成的對照指紋圖譜對比，各圖譜的相似度均大于0.984。以6號峰為參照峰，計算出1～6號共有指紋峰相對保留時間的RSD值均小于3%，相對峰面積的RSD值均小于0.5%，表明儀器穩定，精密度良好。

3.2.2?重現性試驗?取同一批刺猬紫檀木屑（C3），精密稱取5份，按2.4供試品制備方法平行制備5份供試品溶液，分別依據2.3色譜條件和2.5樣品測定方法進樣。采用相似度軟件對其指紋圖譜進行分析，與生成的對照指紋圖譜相比，5份樣品的相似度均大于0.990。以6號峰為參照峰，計算出1～6號共有指紋峰相對保留時間的RSD值小于2%，由于天然紅木樣品的不均一性，4號峰相對峰面積的RSD值為0.9108%，其他共有峰相對峰面積的RSD值均小于0.5%，表明該方法共有峰保留時間重現性良好。

3.2.3?穩定性試驗?取同一份供試品溶液（C3），依據2.3色譜條件和2.5樣品測定方法，分別于0、3、6、9、15、24 h進樣檢測。采用相似度軟件對其指紋圖譜進行分析，與生成的對照指紋圖譜相比，6份樣品的相似度均大于0.980。以9號峰為參照峰，計算出1～9號共有指紋峰相對保留時間的RSD%值均小于1.5%，相對峰面積的RSD值小于0.3%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

3.3?刺猬紫檀標準指紋圖譜中共有特征峰特異性的考察

3.3.1?與其他紅木指紋圖譜的比較?課題組除了建立刺猬紫檀的HPLC標準指紋圖譜，還研究了印度紫檀、印度小葉紫檀、大果紫檀、非洲紫檀、海南黃花梨油梨、海南黃花梨糠梨、微凹黃檀、東非黑黃檀、賽州黃檀、盧氏黑黃檀、闊葉黃檀、伯利茲黃檀、交趾黃檀、巴里黃檀、奧氏黃檀、白花崖豆木、蘇拉威西烏木等紅木，合計320個樣品，建立了各自相應的標準指紋圖譜。將刺猬紫檀與其他樹種的標準指紋圖譜進行比較，考察刺猬紫檀標準指紋圖譜中6個共有特征峰的特異性。為了避免保留時間漂移引起的誤差，導致漏掉相同的峰，該文規定考察不同樹種是否含有刺猬紫檀所具有的共有特征峰時，對照刺猬紫檀標準指紋圖譜6個共有特征峰的保留時間在±0.250 min的峰視為同一峰，分別計算各紅木樹種標準圖譜中的峰面積與其最大峰面積的百分比（表6）。

從表6可見，第2峰是刺猬紫檀特有的，其他共有特征峰在不同樹種的紅木中也可能含有，但含量百分比不同;刺猬紫檀標準指紋圖譜的6個共有特征峰中，賽州黃檀標準指紋圖譜含有其中4個，但是兩者標準指紋圖譜差別非常大，將兩者數據導入相似度軟件“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”，其相似度僅為0.013，說明兩者完全不同;6個峰只在刺猬紫檀同時出現，可以說明這6個共有特征峰具有足夠的特異性將刺猬紫檀與其他紅木相區別。

3.3.2?近似樹種指紋圖譜的比較?市場上刺猬紫檀摻假現象嚴重，一方面常被不法分子用來冒充價格昂貴的高檔紅木，如巴里黃檀;另一方面也有不是紅木的膠漆樹、木莢豆被用來冒充刺猬紫檀。由表6的對比結果可見，巴里黃檀的HPLC標準指紋圖譜完全沒有包含刺猬紫檀HPLC標準指紋圖譜的共有特征峰，因此該研究建立的針對刺猬紫檀的HPLC標準指紋圖譜具有足夠的特異性用于區別其近似種巴里黃檀。

分別將正確定名的膠漆樹、木莢豆各1個樣品的指紋圖譜，與刺猬紫檀和巴里黃檀的HPLC標準指紋圖譜進行對比（圖3）。木莢豆在該研究所建立的色譜條件下出峰數量極少，只有1個色譜峰，極易與刺猬紫檀區分;膠漆樹在該研究所建立的色譜條件下出峰數量較多，大多數峰保留時間在30 min之內，與刺猬紫檀區分特征明顯;巴里黃檀HPLC標準指紋圖譜共有特征峰分別標識峰編號1、2、3，與刺猬紫檀標準指紋圖譜所示的共有特征峰區別特征明顯，并沒有峰保留時間相近或者相同的現象。可見刺猬紫檀HPLC標準指紋圖譜6個共有特征峰，其特異性可滿足刺猬紫檀與其近似種的區分鑒別。

4?討論與結論

對紅木的鑒定，不能照搬中藥材質量控制、道地性和真偽鑒別的指紋圖譜方法。紅木樹種鑒定的相似度判斷指標和相對保留時間、相對峰面積的標準偏差判斷指標要比一般的中藥材等一年生植物的范圍放寬一些，才有實用意義。

保留時間的含義是對應樣品所含的化學成分，峰面積含義是該化學成分含量，為了盡可能減少各種條件造成高效液相保留時間的漂移對指紋圖譜的影響，重點研究相對保留時間和相對峰面積。刺猬紫檀木材分布地理位置非常廣泛，主要是非洲的岡比亞、加納等國家，同一類樹種含有相同的化學成分相對化學成分含量來說，貢獻更大。經木材結構學鑒定后正確定名的8批刺猬紫檀的6個特征峰的相對保留時間的相對標準偏差小于0.3%，相對峰面積相對標準偏差在1.5%以下，因此相對保留時間對刺猬紫檀的鑒定更有現實意義。

用于刺猬紫檀鑒定的高效液相標準指紋圖譜，只保留其相對標準時間的特征，即具有6個特征峰，其中保留時間最長的特征峰的峰面積最大;以該峰面積最大的所述特征峰為參照峰，6個特征峰的相對保留時間tg分別為：0.376、0.416、0.548、0.685、0.837、

1.000、RSD%<0.3%。對疑似刺猬紫檀樣品的HPLC指紋圖譜與刺猬紫檀HPLC標準指紋圖譜采用相同的色譜柱和色譜條件，可以利用指紋圖譜相似度軟件分析相似度，結合共有特征峰相對保留時間的標準偏差進行真偽判斷。通過刺猬紫檀與其他16個標準指紋圖譜的對比，以及與其近似種巴里黃檀、易假冒的非紅木類樹種膠漆樹和木莢豆樣品的指紋圖譜的對比，可見刺猬紫檀HPLC標準指紋圖譜6個共有特征峰，其特異性可滿足刺猬紫檀與其他紅木樹種特別是近似種的區分鑒別。

色譜條件中波長的選擇是指紋圖譜研究的重要參數。一方面，要能較多地檢測出刺猬紫檀木材浸提物中的化學物質，以便呈現其整體特征，但又不能太多，否則色譜峰數量太多將導致后續統計分析工作量巨大;另一方面，刺猬紫檀指紋圖譜研究目的在于區分刺猬紫檀與其他紅木及近似種，而不是研究其所含化學成分，所以需要采用一致的紫外波長，即選擇一個能兼顧多種紅木樹種或摻偽樹種指紋圖譜的研究，以便于比較。該研究參照沈明月[7]的方法，采用290 nm的波長，從研究結果來看，該波長能夠滿足區分刺猬紫檀與其他紅木及近似種的需求。

對于木材識別，由最早的樹木分類科、屬系統根據宏觀的顏色、氣味、氣干密度等特征，發展到根據微觀的木材解剖學角度的顯微結構識別。花梨木類包括5個樹種：安達曼紫檀、刺猬紫檀、印度紫檀、大果紫檀和囊狀紫檀，這5個樹種的花梨木由于不同的稀缺程度和木質特點，價格相差懸殊。HPLC標準指紋圖譜技術具有人為因素較小、分辨率高、特異性強、快速準確的突出特點，作為一種輔助傳統方法的木材識別方法，可以鑒定到樹種，對于木材交易市場、木材經銷商、消費者、公安機關、海關和科研機構等具有很強的應用價值。

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責任編輯：李楊