伊維菌素對人胃癌細胞BGC—823、MGC—803遷移和侵襲的影響及機制研究

謝燕嬌 鄺少軼 鄧慧鳴 虞道銳 樊好飛 賈皓 劉嬙

中圖分類號 R735.2；R361+.3 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）05-0621-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.05.09

摘 要 目的：研究伊維菌素對人胃癌細胞BGC-823、MGC-803遷移和侵襲能力的影響及其作用機制。方法：0、2.5、5、10、20、40 μmol/L伊維菌素分別作用于BGC-823、MGC-803細胞24 h后用MTT法檢測細胞抑制率，再采用Transwell小室侵襲實驗觀察5 μmol/L伊維菌素和含0.67‰二甲基亞砜的磷酸鹽緩沖液（對照組）作用24 h對BGC-823、MGC-803細胞遷移和侵襲的影響，Western blot法分別檢測5、10 μmol/L伊維菌素和含0.67‰二甲基亞砜的磷酸鹽緩沖液（對照組）作用于BGC-823、MGC-803細胞24 h后上皮-間質轉化（EMT）標記物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail和EMT轉導通路轉化生長因子β（TGF-β）/Smad中TGF-β1、TGF-βR、Smad2、Smad3 蛋白的表達水平。結果：伊維菌素對BGC-823、MGC-803細胞生長均有抑制作用，其細胞抑制率與其濃度呈正相關。與對照組比較，5 μmol/L伊維菌素作用后BGC-823、MGC-803細胞的遷移數(shù)和侵襲數(shù)均明顯減少（P<0.01或P<0.001）；5、10 μmol/L伊維菌素作用后BGC-823、MGC-803細胞中E-cadherin蛋白表達明顯增強（P<0.05或P<0.01或P<0.001），N-cadherin、Vimentin、Snail、TGF-βR、Smad2、Smad3蛋白表達均明顯減弱（P<0.05或P<0.01或P<0.001），TGF-β1蛋白僅在10 μmol/L伊維菌素作用后明顯減弱（P<0.05）。結論：伊維菌素能顯著抑制BGC-823、MGC-803細胞的遷移和侵襲，其可能與抑制TGF-β/Smad活性從而影響EMT過程有關。

關鍵詞 伊維菌素；人胃癌細胞BGC-823；人胃癌細胞MGC-803；轉化生長因子β/Smad；細胞遷移；細胞侵襲

Effects of Ivermectin on Migration and Invasion of Human Gastric Cancer Cells BGC-823 and MGC-803 and Its Mechanism

XIE Yanjiao1，KUANG Shaoyi2，DENG Huiming3，YU Daorui2，F(xiàn)AN Haofei2，JIA Hao2，LIU Qiang2（1.Dept. of Pharmacy， Hainan Provincial People’s Hospital， Haikou 570311， China；2.Dept. of Pharmacology， Hainan Medical College， Haikou 571199， China；3.Dept. of Gastrointestinal Tumor Surgery， the First Affiliated Hospital of Hainan Medical College， Haikou 570102， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of ivermectin on the migration and invasion of human gastric cancer cell lines BGC-823 and MGC-803 and its mechanism. METHODS： After treated with 0， 2.5， 5， 10， 20， 40 μmol/L ivermectin for 24 h， inhibitory rate of human gastric cancer cell lines BGC-823 and MGC-803 were detected by MTT assay. Effects of 5 μmol/L ivermectin and phosphate buffercontaining 0.67‰ dimethyl sulfoxide （control group） for 24 h on the migration and invasion of` gastric cancer cells BGC-823 and MGC-803 were observed by Transwell chamber invasion assay.Western blot assay was used to detect the protein expression of TGF-β1， TGF-βR， Smad2 and Smad3 in epithelial-mesenchymal transition （EMT） markers E-cadherin， N-cadherin， Vimentin， Snail and EMT transduction pathway TGF-β/smad of BGC-823 and MGC-803 cells after treated with 5， 10 μmol/L ivermectin and phosphate buffercontaining 0.67‰ dimethyl sulfoxide （control group） for 24 h. RESULTS： Ivermectin could inhibit the growth of BGC-823 and MGC-803， inhibitory rate of it was positively correlated with its concentration. Compared with control group， the number of migration and invasion BGC-823 and MGC-803 cells were decreased significantly after treated with 5 μmol/L ivermectin （P<0.01 or P<0.001）； the expression of E-cadherin protein was enhanced significantly in BGC-823 and MGC-803 cells after treated with 5 and 10 μmol/L ivermectin （P<0.05 or P<0.01 or P<0.001）； the protein expression of N-cadherin， Vimentin， Snail， TGF-βR， Smad2 and Smad3 were decreased significantly （P<0.05， P<0.01 or P<0.001）； protein expression of TGF-β1 was decreased significantly after treated with 10 μmol/L ivermectin （P<0.05）. CONCLUSIONS： Ivermectin can significantly inhibit the migration and invasion of gastric cancer cells BGC-823 and MGC-803， and inhibiting the biological activity of EMT by reducing the expression of TGF-β/smad pathway is one of the mechanisms that inhibit the migration and invasion of gastric cancer cells.

KEYWORDS Ivermectin； Human gastric cancer cell BGC- 823； Human gastric cancer cell MGC-803； TGF-β/Smad； Cell migration； Cell invasion

胃癌是全球最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率在惡性腫瘤疾病中位居前列[1]。Lancet發(fā)布的2000-2014年全球癌癥生存率變化趨勢監(jiān)測研究報告顯示，我國胃癌的5年生存率僅為35.9%，明顯低于韓國（68.9%）、日本（60.3%）等發(fā)達國家[2]。由于胃癌的早期臨床癥狀不明顯，當確診時多數(shù)已為中、晚期并伴有遠處轉移[3]。雖然有研究表明，腹腔鏡微創(chuàng)切除術結合亞葉酸鈣、奧沙利鉑、氟尿嘧啶新輔助化療方案用于進展期胃癌具有顯著療效，但患者的遠期存活率仍然很低，而胃癌細胞向鄰近器官侵襲和遠處轉移是影響胃癌患者生存期的主要因素之一[4-5]。目前轉移性胃癌的治療方式主要是以手術和放化療為主，但手術清除率低、放化療副作用大一直影響著轉移性胃癌的治療效果[6]。因此，尋找新的轉移性胃癌的治療方式已成為亟待解決的醫(yī)學問題。

伊維菌素（Ivermectin）是在日本Kitasato研究所發(fā)現(xiàn)由放線菌阿維鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的16元大環(huán)內(nèi)酯化合物，屬于阿維菌素類，是新型抗寄生蟲藥，還廣泛用于農(nóng)業(yè)、獸醫(yī)和水產(chǎn)養(yǎng)殖等行業(yè)，具有高效、廣譜、低毒等特點[7-9]。有研究表明，伊維菌素可作為線粒體功能障礙和氧化損傷的誘導物從而具有抑制腎癌細胞生長的作用[10]，也能夠誘導乳腺癌細胞自噬增加進而抑制細胞的生長[11]，還可以作為腫瘤細胞多藥耐藥的抑制劑[12]。由此可見，伊維菌素不僅有望作為抗腫瘤藥物在臨床上推廣應用，還可作為“老藥新用”節(jié)約抗腫瘤新藥的研發(fā)成本。上皮-間質轉化（Epithelial mesenchymal transitions，EMT）是腫瘤細胞向周圍浸潤和遠處轉移的重要機制，當腫瘤發(fā)生EMT后，腫瘤細胞間黏附能力下降，浸潤和轉移能力增強，從而突破基底膜侵入腫瘤周圍組織或進入血液循環(huán)向遠處轉移[13]。已有多項研究表明，EMT與結腸癌、胃癌、肺癌細胞的轉移和侵襲密切相關[14-16]。因此，本文結合國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀，探討伊維菌素是否能夠抑制人胃癌細胞BGC-823、MGC-803的遷移和侵襲以及其作用機制，以期為伊維菌素的合理應用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

3111二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；BX43正置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；SW-CJ-2D 超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；SpectraMax plus384全波長酶標儀（美國MD公司）；TGL-16M臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；TDZ6B-WS臺式低速離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；ChemiDoc XRS+System凝膠成像儀和 Mini-Protein Tetra System電泳轉印系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

伊維菌素對照品（上海麥克林生化科技有限公司，批號：I854556，純度：≥98%）；RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（Trypsin-EDTA）、青鏈雙抗、胎牛血清（FBS）均購于美國Gibco公司；MTT試劑盒（批號：022817170401）、二辛可寧酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（批號：112416170410）均購于上海碧云天生物技術有限公司；Transwell小室和基質膠均購自美國Corning公司；兔抗E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、神經(jīng)鈣黏附蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、編碼鋅指蛋白轉錄因子（Snail）、1型轉化生長因子β（TGF-β1）、轉化生長因子β受體（TGF-βR）、Smad2、Smad3、β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體和山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）抗體均購自美國Abcam公司。

1.3 細胞

人胃癌細胞BGC-823、MGC-803均購自中國科學院上海細胞庫。

2 方法

2.1 MTT法檢測胃癌細胞抑制率

選取處于對數(shù)生長期的BGC-823、MGC-803細胞，0.25%胰蛋白酶消化后，用含10% FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基懸浮制成單細胞懸液，計數(shù)后調整細胞密度，按每孔 5×103個/100 μL接種于96孔板，待細胞貼壁后，加入伊維菌素濃度分別為2.5、5、10、20、40 μmol/L的含0.67‰二甲基亞砜（DMSO）的磷酸鹽緩沖液（PBS）（后文均稱為伊維菌素溶液），同時設置對照組加入含0.67‰ DMSO的PBS（由于DMSO含量極少，后文均稱為PBS），每組設5個復孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，于終止培養(yǎng)前4 h加入10 μL MTT（5 mg/mL），繼續(xù)37 ℃孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入 150 μL DMSO，用全波長酶標儀在570 nm下測定吸光度（A值），計算細胞抑制率（%）=1-給藥組A值/對照組A值×100%。

2.2 Transwell小室試驗檢測細胞的遷移和侵襲

2.2.1 遷移 選取處于對數(shù)生長期的BGC-823、MGC-803細胞，0.25%胰蛋白酶消化細胞，用PBS洗2遍，無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，調整細胞密度至5×105 mL-1。上室均勻加入200 μL細胞懸液，試驗組再加入伊維菌素溶液5 μmol/L，對照組加入相應體積的PBS；下室加入含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基600 μL，每組設5個復孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出上室，用棉簽擦去上室細胞，PBS漂洗后用多聚甲醛固定15 min，棄固定液，0.1%結晶紫染液染色10 min，PBS洗3遍，每次10 min，顯微鏡下攝片并計數(shù)結晶紫染色的細胞遷移數(shù)。

2.2.2 侵襲 將Transwell 小室置于24孔板內(nèi)，每孔鋪基質膠50 μL，再按“2.2.1”項下條件加入細胞和藥液，每組設5個復孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，刮除上室中的基質膠和細胞，按“2.2.1”項下方法固定、染色，顯微鏡下攝片并計數(shù)結晶紫染色的細胞侵襲數(shù)。

2.3 Western blot法檢測細胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、TGF-β1、TGF-βR、Smad2、Smad3蛋白的表達

選取處于對數(shù)生長期的BGC-823、MGC-803細胞，按1×105個/孔接種于6孔板，待細胞貼壁后分別給予伊維菌素5、10 μmol/L（伊維菌素低、高濃度組）以及PBS（對照組），置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，提取總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒定量分析蛋白濃度，加入5×十二烷基硫酸鈉（SDS）加樣緩沖液混合，95%變性10 min，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入EMT標志蛋白抗體[兔抗E-cadherin（1 ∶ 1 000）、N-cadherin（1 ∶ 1 000）、Vimentin（1 ∶ 1 000）、Snail（1 ∶ 1 000）單克隆抗體]、TGF-β/Smad通路蛋白抗體[TGF-β1（1 ∶ 1 000）、TGF-βR（1 ∶ 1 000）、Smad2（1 ∶ 1 000）、Smad3（1 ∶ 1 000）單克隆抗體]和內(nèi)參抗體[β-actin（1 ∶ 1 000）單克隆抗體]，4 ℃孵育過夜，洗膜后按 1 ∶ 2 000 加山羊抗兔IgG抗體，室溫孵育2 h，洗膜，采用增強化學發(fā)光試劑盒曝光，Quantity one圖像分析軟件分析目的條帶和內(nèi)參條帶的A值，計算相對表達量。試驗重復3次。

2.4 統(tǒng)計學方法

細胞遷移和侵襲數(shù)量用ImagePro Plus軟件進行計數(shù)，蛋白表達的灰度值用Image J軟件測定，統(tǒng)計圖用GraphPad Prism 6軟件制作，數(shù)據(jù)結果用 x±s表示。采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間差異采用單因素方差分析和Student’s t檢驗，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 細胞抑制率

與對照組比較，2.5、5、10、20、40 μmol/L的伊維菌素對BGC-823細胞的抑制率分別為0.12±0.04、0.25±0.03、0.34±0.06、0.43±0.03、0.55±0.04，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；對MGC-803細胞的抑制率分別為0.09±0.03、0.24±0.04、0.43±0.07、0.62±0.04、0.79±0.03，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結果表明，伊維菌素對BGC-823、MGC-803細胞的生長均有明顯的抑制作用，且伊維菌素濃度越高、抑制作用越強，呈明顯的量效關系。伊維菌素對BGC-823、MGC-803細胞抑制率的影響見圖1。

3.2 遷移和侵襲

3.2.1 遷移 試驗組BGC-823、MGC-803細胞的遷移數(shù)分別為（49.8±17.0）、（37.0±8.1）個（n=5），均明顯少于對照組的（125.2±12.5）、（83.4±13.2）個（n=5），差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01或P<0.001）。2組BGC-823、MGC-803細胞遷移的顯微鏡圖見圖2，測定結果見圖3。

3.2.2 侵襲 試驗組BGC-823、MGC-803細胞的侵襲數(shù)分別為（51.4±15.6）、（34.0±6.5）個（n=5），明顯少于對照組的（130.0±18.0）、（67.0±8.5）個（n=5），差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。2組BGC-823、MGC-803細胞侵襲的顯微鏡圖見圖4，測定結果見圖5。

3.3 EMT標志蛋白表達

與對照組比較，伊維菌素低、高濃度組BGC-823、MGC-803細胞中E-cadherin蛋白的表達明顯升高（P<0.05或P<0.01），N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白表達明顯降低（P<0.05或P<0.01或P<0.001）。表明伊維菌素可能是通過影響胃癌細胞EMT過程從而抑制細胞的遷移和侵襲。3組BGC-823、MGC-803細胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白表達的電泳圖見圖6，測定結果見圖7。

3.4 TGF-β/smad信號通路蛋白表達

與對照組比較，除伊維菌素低濃度組BGC-823細胞中TGF-β1和MGC-803細胞中Smad3外，伊維菌素低、高濃度組BGC-823、MGC-803細胞中TGF-β1、TGF-βR、Smad2、Smad3蛋白的表達均明顯降低（P<0.05或P<0.01）。表明伊維菌素可能通過明顯抑制TGF-β/smad信號通路活性，從而抑制EMT過程，進而減弱胃癌細胞的遷移和侵襲能力。3組BGC-823、MGC-803細胞中TGF-β1、TGF-βR、Smad2、Smad3蛋白表達的電泳圖見圖8，測定結果見圖9。

4 討論

近年來多項研究報告表明，“老藥新用”也是發(fā)展藥物抗腫瘤治療的新途徑之一，例如阿司匹林和二甲雙胍能明顯提高結直腸癌患者的生存率[17-18]。因老藥具有眾所周知的藥動學和藥效學概況，所以與新研發(fā)的抗腫瘤藥物相比，老藥具有研究成本低、風險小、成功率高等優(yōu)勢。本研究結果發(fā)現(xiàn)，抗寄生蟲藥伊維菌素也可明顯抑制BGC-823、MGC-803細胞的生長，明顯減弱其遷移和侵襲能力，這與國外Nambara S等[19]學者報道一致，提示伊維菌素具有發(fā)展為抗腫瘤藥物的潛力。

EMT對腫瘤的遷移和侵襲起著重要的調節(jié)作用，在EMT過程中皮標志物E-cadherin的表達會降低，而間充質標志物N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白的表達通常會增強[20-21]。當由上皮組織衍生出來的腫瘤組織中E-cadherin的表達降低或者是缺失時（被認為是EMT的關鍵步驟），E-cadherin向N-cadherin轉化并促進其表達，形態(tài)上由上皮細胞轉化為具有間充質特征，這時具有間質細胞表型的上皮細胞活動性更強且具有較低的極性，進而增強腫瘤細胞的能動性和侵襲性[22-23]。因此當靶向EMT抗腫瘤藥物干預后，腫瘤細胞內(nèi)常伴隨著E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白的表達異常。本研究結果發(fā)現(xiàn)，伊維菌素可升高E-cadherin蛋白的表達，降低N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白的表達，提示伊維菌素可通過調節(jié)EMT 過程從而抑制 BGC-823、MGC- 803細胞的遷移和侵襲能力。

TGF-β對腫瘤細胞有著雙重調節(jié)作用，在腫瘤發(fā)生早期，TGF-β可以促進腫瘤細胞凋亡抑制其生長，但在晚期TGF-β可以促進腫瘤細胞轉移，因此TGF-β也是調節(jié)EMT過程的重要細胞因子[24-25]。Smads蛋白是TGF-β細胞內(nèi)信號傳導的重要蛋白，是將信號由胞漿傳導至細胞核的承接者。轉錄因子Smads家族中Smad2、Smad3是TGF-β轉導通路下游關鍵的蛋白分子，屬受體激活型，活化的TGF-β1與TGF-βR結合后活化Smad2、Smad3的磷酸化，與Smad4結合形成聚合物進入細胞核調節(jié)靶基因轉錄[26]。有研究表明，TGF-β/Smad信號通路可通過調控EMT過程，對胰腺癌細胞和肝癌細胞的轉移和侵襲發(fā)揮正性作用[27-28]。因此筆者也推測伊維菌素可以影響TGF-β/Smad信號通路的表達。本研究結果表明，伊維菌素作用胃癌細胞24 h后，TGF-β1、TGF-βR表達明顯降低，轉錄因子Smad2、Smad3的表達也降低，提示伊維菌素是通過抑制TGF-β/Smad的活性影響EMT過程，從而抑制BGC-823、MGC-803細胞的遷移和侵襲作用。

綜上所述，伊維菌素具有抑制BGC-823、MGC-803細胞的遷移和侵襲作用，其作用機制可能為抑制TGF-β/Smad的活性從而影響EMT過程。但是其如何影響TGF-β/Smad信號通路調控EMT的作用機制尚需進一步研究。

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（收稿日期：2018-09-16 修回日期：2019-01-14）

（編輯：鄒麗娟）