Cx43及其磷酸化蛋白在帕金森病細胞表達

牟斐斐　焦倩　杜希恂　畢明霞　姜宏

[摘要]目的探討縫隙連接蛋白43（Cx43）及其磷酸化蛋白在過表達α-突觸核蛋白（α-Syn）的帕金森病細胞模型表達及其意義。方法分別在SH-SY5Y細胞中過表達空載（空載組）、野生型α-Syn（WT α-Syn組）以及人突變型A53T α-Syn（A53T α-Syn組），應用Western Blot技術檢測各組Cx43蛋白及磷酸化Cx43蛋白（p-Cx43）的表達。結果與空載組相比較，WT α-Syn組以及A53T α-Syn組的細胞內Cx43蛋白表達增加（F=6.37，q=4.04、5.76，P<0.05），p-Cx43/Cx43升高，差異有顯著性（F=23.43，q=5.73、9.65，P<0.01）;與WT α-Syn組相比，A53T α-Syn組的細胞內p-Cx43/Cx43升高（q=3.61，P<0.05）。結論Cx43及p-Cx43蛋白表達水平的改變可能參與了帕金森病的發病過程。

[關鍵詞]縫隙連接蛋白43;帕金森病;α突觸核蛋白

[中圖分類號]R742.5[文獻標志碼]A[文章編號] 2096-5532（2019）04-0379-04

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the expression and significance of connexin 43 （Cx43） and its phosphorylated form （p-Cx43） in Parkinson disease （PD） cell model with overexpression of α-Synuclein （α-Syn）. MethodsOverexpression of empty vector， wild-type α-Syn， and human mutant A53T α-Syn was performed in SH-SY5Y cells （named empty vector group， WT α-Syn group， and A53T α-Syn group， respectively）. Western Blot was used to determine the expression of Cx43 and p-Cx43 proteins. ResultsCompared with the empty vector group， the WT α-Syn group and A53T α-Syn group had significantly higher Cx43 expression and p-Cx43/Cx43 ratio （F=6.37，q=4.04-5.76，P<0.05;F=23.43，q=5.73-9.65，P<0.01）; the A53T α-Syn group had a significantly higher p-Cx43/Cx43 ratio than the WT α-Syn group （q=3.61，P<0.05）. ConclusionThe changes in Cx43 and p-Cx43 levels may be involved in the development of PD.

[KEY WORDS]connexin 43; Parkinson disease; alpha-synuclein

帕金森病（PD）是一種好發于中老年人的神經退行性疾病[1-2]，其主要病理改變是中腦黑質致密部（SNpc）多巴胺（DA）能神經元的選擇性丟失，及殘存的神經元內形成α-突觸核蛋白（α-Syn）聚集為主的路易小體[3-4]。到目前為止，PD的病因尚未完全明確，但是α-Syn異常聚集參與了PD中DA能神經元退行性病變過程[5-6]。縫隙連接（GJ）是將相鄰的兩個細胞的細胞膜上的連接小體對接形成的直徑約為1.5 nm的細胞通道，每個連接小體由6個相同或不同的桿狀的連接蛋白（Cx）構成[7-9]。迄今為止，已經發現的在人類中表達的Cx有20余種，其中在中樞神經系統中表達的有13種[10]。大多數的Cx為磷蛋白并且處于不同的磷酸化水平，根據其分子質量的差異而命名為Cx31、Cx32、Cx36、Cx37、Cx40、Cx43、Cx45、Cx46、Cx50和Cx56等[11-12]，其中細胞間分布最廣泛的是Cx43[13]。Cx43的磷酸化影響廣泛，它能夠影響GJ的通透性及門控特性等，從而對細胞間連接產生作用，進而在體內外影響生理或者病理過程[14-15]。大量研究表明，Cx43及其磷酸化可能參與了諸多疾病的發生及發展[16-17]。但是Cx43作為細胞間通訊的重要調節蛋白，對PD的作用尚未明確。本文研究選取具有DA能神經元特性的SH-SY5Y細胞，過表達野生型α-Syn以及人突變型A53T α-Syn，通過檢測Cx43蛋白及磷酸化Cx43蛋白（p-Cx43）的表達，探討Cx43及p-Cx43在PD中的作用，從而闡明PD的發病機制，為藥物干預治療提供可能的作用靶點。

1材料和方法

1.1實驗細胞

本實驗選用的SH-SY5Y細胞購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，其來自于人神經母細胞瘤細胞，具有DA能神經元特性。將其置于溫度37 ℃、含體積分數0.05 CO2的培養箱中，使用含RPMI-1640（1∶1）、體積分數0.2胎牛血清、10 g/L青霉素和鏈霉素混合液的完全培養液進行培養。

1.2試劑

RPMI-1640（1∶1）培養液、胎牛血清和Opti-MEM Ⅰ培養液均購于Gibco公司，LipotamineTM2000、BCA蛋白試劑盒均購于Thermo公司，兔源 β-tubulin、Cx43、p-Cx43抗體均購于CST公司，兔源α-Syn抗體購于Abcam公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗購于Absin公司，RIPA （strong） 裂解液、分離膠緩沖液、濃縮膠緩沖液和丙烯酰胺均購于康為公司，ECL試劑盒購于美國Millipore公司。

1.3實驗儀器

CO2培養箱購于Thermo Electron Corporation公司，倒置熒光顯微鏡購于Olympus公司，臺式低溫離心機（5417R）購于Eppendorf公司，電泳槽、電泳儀、電轉儀（濕轉）均購于BIO-RAD公司。

1.4過表達α-Syn的細胞模型制備

待培養瓶中細胞生長良好，將細胞以1×108/L的密度接種至6孔板中，待板中的細胞融合度達到70%～90%時進行轉染。取5 μL LipotamineTM2000溶于150 μL Opti-MEM Ⅰ無血清培養基中，同時取2 μg含有綠色熒光標簽質粒GV230-EGFP（對照組，A組）、GV230-EGFP-WT-α-Syn（WT α-Syn組，B組）、GV230-EGFP-A53T-α-Syn（A53T α-Syn組，C組）溶于150 μL Opti-MEM Ⅰ無血清培養基中，分別混勻后，室溫靜置5 min。將質粒和 LipotamineTM2000混合均勻，在無菌操作臺中靜置30 min。置于培養箱中培養4 h后，棄去含 LipofectamineTM2000-DNA 混合物的Opti-MEM Ⅰ無血清培養液，換為含血清、抗生素的完全培養基培養24 h。使用倒置熒光顯微鏡觀察質粒轉染效率。

1.5Western Blot檢測α-Syn、 Cx43及p-Cx43蛋白表達水平

待細胞處理完畢后吸除培養基，用預冷的 PBS洗細胞3次，完全去除培養基，向每孔加入120 μL細胞裂解液，在冰上進行裂解，靜置30 min后將細胞刮下轉移至冰上預冷的EP管中， 4 ℃、12 000 r/min離心20 min，吸取上清置于新的EP管中，采用BCA法測蛋白濃度。按每孔25 μg蛋白上樣，經SDS-PAGE電泳后，電轉移到PVDF膜上，室溫下使用100 g/L脫脂奶粉封閉2 h，加入相應的一抗（Cx43、p-Cx4 及α-Syn稀釋滴度均為1∶1 000;β-tubulin稀釋滴度為1∶10 000），4 ℃搖床孵育過夜后，使用TBST洗脫3次，用1∶10 000稀釋辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗于室溫孵育1 h，TBST洗脫3次后，ECL發光液顯影，UVP凝膠成像系統成像，Image J軟件讀取目的條帶的灰度值，對α-Syn、Cx43及p-Cx43蛋白表達水平進行分析。

1.6統計學方法

應用SPSS 17.0及GraphPad Prism軟件進行統計分析，計量資料結果以±s表示，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1成功構建過表達α-Syn的SH-SY5Y細胞模型

將含GV230-EGFP、GV230-EGFP-WT-α-Syn和GV230-EGFP-A53T-α-Syn的質粒分別轉染至SH-SY5Y細胞24 h后，Western Blot檢測顯示，在過表達WT α-Syn和A53T α-Syn的SH-SY5Y細胞中，α-Syn的蛋白表達明顯增多（F=108.03，q=17.36、20.07，P<0.01）。見圖1、表1。

2.2過表達α-Syn后細胞內Cx43及其磷酸化蛋白水平

Western Blot檢測顯示，與對照組相比，WT α-Syn組和A53T α-Syn組的細胞內Cx43蛋白表達增加（F=6.37，q=4.04、5.76，P<0.05），p-Cx43/Cx43水平明顯升高（F=23.43，q=5.73、9.65，P<0.01）;與WT α-Syn組相比，A53T α-Syn組的細胞內Cx43蛋白表達差異無統計學意義（P>0.05）， p-Cx43/Cx43水平升高，差異有顯著性（q=3.61，P<0.05）。見圖2，表1。

3討論

PD的病理表現為SNpc DA能神經元選擇性缺失，并且形成α-Syn聚集為主的路易小體[3]，α-Syn異常聚集可能參與了DA能神經元退行性病變的過程[5-6，18]。在腦內，各細胞間都存在著GJ，迄今為止發現了3個連接蛋白家族：Cx、pannexin和innexin[19]。其中，以Cx家族研究最為廣泛[9]，在細胞中表達最普遍及研究最多的是Cx43[13]。中樞神經系統中Cx43廣泛分布在神經元以及角質細胞中[20]，它首先在細胞內質網核糖體上合成，隨后被轉運到高爾基體中，最后在細胞膜上聚集形成了GJ[21-22]，從而起到及時清除神經元周圍聚集的各類代謝產物以及減弱代謝產物對細胞自身損傷的作用[23]。正常情況下，細胞間可通過Cx43對DA產生一定的保護支持作用，而在腦卒中、癲癇等病理情況下會出現Cx43的異常表達[17]。Cx43蛋白及其組成的GJ在腦內形成了細胞傳遞信號的重要通道，參與調控離子通道的啟閉，并且參與了多種神經系統疾病的發生[24-25]。在細胞的生命周期中，Cx43發生著不同的磷酸化[22，26]，并且磷酸化是Cx43最主要的共價修飾[27]。Cx43的C端是磷酸化作用的區域，易受到大量絲氨酸（S）和酪氨酸激酶和磷酸酶的調節，其中包括蛋白激酶A（PKA）、蛋白激酶C（PKC）、酪蛋白激酶1（CK1）以促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）等[28-31]，這些激酶和磷酸酶在其生命周期的所有階段產生多種作用，包括從內質網到高爾基體及質膜的轉運、GJ的組裝及門控、GJ的降解和細胞周期調節[14，32-34]，影響Cx43正常生理功能及細胞間通訊，進而影響各種疾病的發生與發展。

本文研究結果顯示，與空載組相比，WT α-Syn組以及A53T α-Syn組SH-SY5Y細胞的Cx43蛋白以及p-Cx43/Cx43水平均明顯升高，且A53T α-Syn組p-Cx43/Cx43水平與WT α-Syn組相比明顯升高，說明Cx43及p-Cx43/Cx43水平隨著PD病情進展而增加，Cx43作為一種重要的調節蛋白，可能參與了PD的發病過程，為闡明PD的發病機制提供了實驗依據，進而為藥物干預PD病程提供可能的作用靶點。

綜上所述，隨著PD病程的發展，Cx43蛋白及其磷酸化蛋白的表達水平發生異常，但是Cx43蛋白磷酸化對PD病程的影響還需進一步研究。

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（本文編輯 黃建鄉）