廣西巴馬小型豬CTGF基因真核表達載體構建及其相關生物信息學分析

黃葉 吳延軍 朱思燃 奉玲麗 瞿秋紅 江雨航 夏琴 崔悅悅 莫家遠 蘭干球

摘要：【目的】構建廣西巴馬小型豬結締組織生長因子（CTGF）基因真核表達載體并鑒定其活性，為深入研究CTGF在癌癥發生中的作用及其分子機制提供參考，也為構建CTGF轉基因廣西巴馬小型豬及研發基于CTGF的癌癥基因治療策略提供理論依據?！痉椒ā坷肦T-PCR從廣西巴馬小型豬肝臟組織中克隆CTGF基因，并將CTGF基因亞克隆到pDsRed-N1載體上，然后通過脂質體轉染小鼠Hep3B細胞，轉染48 h后于熒光顯微鏡下觀察細胞是否表達紅色熒光蛋白，同時利用在線生物信息學軟件對其理化性質進行分析?！窘Y果】成功克隆獲得廣西巴馬小型豬CTGF基因編碼區（CDS）序列，序列全長1050 bp，共編碼349個氨基酸，與NCBI上已公布普通豬參考序列的同源性為99.5%，有5處堿基突變，且均為同義突變。將廣西巴馬小型豬CTGF基因亞克隆到pDsRed-N1載體上成功構建了閱讀框架正確的廣西巴馬小型豬CTGF基因真核表達載體，轉染小鼠Hep3B細胞48 h后有紅色熒光蛋白表達。廣西巴馬小型豬CTGF蛋白具有較強的親水性，其二級結構中α-螺旋、β-折疊、延伸鏈和無規則卷曲各占13.18%、5.73%、17.48%和63.61%。【結論】廣西巴馬小型豬CTGF基因在進化過程中的保守性非常穩定，通過構建的真核表達載體能轉染小鼠Hep3B細胞并成功表達，可用于生產轉基因廣西巴馬小型豬及研發與CTGF基因有關的疾病模型。

關鍵詞： 廣西巴馬小型豬;CTGF基因;小鼠Hep3B細胞;脂質體轉染;生物信息學

中圖分類號： S828.89? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）03-0468-09

0 引言

【研究意義】結締組織生長因子（Connective ti-ssue growth factor，CTGF）是一種新發現可刺激成纖維細胞增殖和膠原沉積的生長因子，是CCN家族的成員之一（包晶晶等，2013）。CTGF合成蛋白為肝素結合型，可分泌含有高水平半胱氨酸的多功能蛋白，其分子量為36～38 kD。CTGF也被認為是TGF-β的下游介質，在人類多種組織器官中廣泛表達，與腫瘤的發生發展相關（Gorlov et al.，2010;Volkomorov et al.，2013）。CTGF的主要作用是刺激成纖維細胞增殖，且是分泌膠原的生長因子（佟仲生等，2010）。近年來的研究結果顯示，CTGF除了在慢性炎癥、血管和纖維化生成方面發揮重要作用外（柏秀玉等，2016），其在調節細胞增殖、腫瘤發生發展等方面也扮演重要角色（Finger et al.，2014;Zhu et al.，2015）。因此，加強CTGF基因研究對研發治療由CTGF引發的癌癥藥物及揭示其治療機制均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】CTGF對信號傳導的調節是通過抑制或促進其他生長因子活性來完成（Inoki et al.，2002）。Deng等（2007）研究表明，CTGF高表達可促進裸鼠食管癌細胞的生長和腫瘤的形成、增長及浸潤。Kwon等（2007）研究證實，CTGF在不同細胞類型中均由TGF-β誘導，且發現在胰腺癌和細胞系中會造成CTGF表達受損。Bennewith等（2009）研究表明，CTGF可保護細胞免受缺氧介導的細胞凋亡，為表達高水平CTGF的腫瘤細胞提供體內選擇。Cawthorn等（2009）研究證實，CTGF在骨骼的發育、塑形、重塑及軟骨的發生過程中也發揮一定作用，并通過旁分泌機制刺激MDA2231癌巢的血管形成，而有助于乳腺癌的侵襲及轉移。Ren等（2013）研究表明，CTGF能促進尤文肉瘤細胞的增殖、遷移和轉移。Tai等（2014）研究發現，CTGF在黑色素瘤和前列腺癌細胞的發育過程中具有抑制功能;賀小玉和田應選（2015）也研究表明CTGF在非小細胞肺癌中可能發揮抑制腫瘤作用;但Ma等（2018）研究顯示，CTGF可誘導腦膠質瘤細胞增殖而發揮其促癌作用。纖維血管膜的形成與視網膜纖維化密切相關，而CTGF是與糖尿病視網膜病變纖維化密切相關的細胞因子（Ma et al.，2018）。Bartanusz和Sayre（2018）研究表明，通過慢病毒介導的CTGF基因沉默可抑制大鼠脊髓損傷模型中神經膠質瘢痕組織的形成?！颈狙芯壳腥朦c】雖然目前已有大量研究證實CTGF基因對癌癥的發生和發展具有促進或抑制作用，但CTGF在某些癌癥發生發展過程中的具體作用及其分子機制尚不明確，仍需進一步探究闡明。近年來，以廣西巴馬小型豬為動物模型開展相關疾病基因的研究已有報道，其中，陳少梅等（2013）研究報道了廣西巴馬小型豬Tau基因存在可變剪接體并進行相關鑒定和功能研究，蘇秀珍等（2013）對廣西巴馬小型豬載脂蛋白E基因（ApoE）進行相關分析并成功構建其真核表達載體。同理，也可充分利用廣西巴馬小型豬的物種優勢對CTGF基因功能進行研究?！緮M解決的關鍵問題】擬構建廣西巴馬小型豬CTGF基因真核表達載體并鑒定其活性，為深入研究CTGF在癌癥發生中的作用及其分子機制提供參考，也為構建CTGF轉基因廣西巴馬小型豬及研發基于CTGF的癌癥基因治療策略提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

廣西巴馬小型豬由廣西大學巴馬小型豬封閉養殖場提供;反轉錄試劑盒、DNA膠回收試劑盒、pMD18-T載體、限制性內切酶和Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司;大腸桿菌DH5α感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司;pDsRed-N1載體（4700 bp）和小鼠Hep3B細胞由廣西大學動物科學技術學院動物遺傳育種實驗室保存提供;T4 DNA Ligase購自寶生物工程（大連）有限公司;卡那霉素購自上海華舜生物技術有限公司;無內毒素質粒小提中量試劑盒（E.Z.N.A.? Endo-free plasmid Mini Kit II）購自OMEGA公司;Lipofectamine? LTX and Plus Rea-gent購自Life Technologies公司;DMEM、Opti-MEM及RPMI1640培養基購自Gibco公司;胎牛血清（FBS）購自Hyclone公司;二甲基亞砜（DMSO）和0.25%胰蛋白酶購自Sigma公司。

1. 2 引物設計與合成

根據NCBI上已公布的普通豬CTGF基因序列（登錄號NM_213833.2），利用Oligo 7.6設計擴增引物（CTGF-F：5'-AAGCTTATGTCCGCCACCGGCC TG-3'和CTGF-R：5'-GGATCCTAGGCCATGTCTCC ATACATC-3'），酶切位點（下劃線部分）分別為Hind III和BamH I，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 3 CTGF基因擴增

采用TRIzol法提取廣西巴馬小型豬肝組織總RNA，按照反轉錄試劑盒說明合成cDNA。PCR反應體系15.0 μL：cDNA模板1.0 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/mL）7.5 μL，上、下游引物（20 mmol/L）各0.5 μL，ddH2O 5.5 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 50，進行32個循環;72 ℃延伸7 min。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

1. 4 pMD18-CTGF重組質粒獲取

通過膠回收試劑盒回收PCR擴增產物，與pMD18-T載體連接后轉化DH5α感受態細胞，18 h后挑取菌落進行PCR鑒定，陽性菌落送至深圳華大基因公司測序。測序結果正確，即構建獲得pMD18-CTGF重組質粒。

1. 5 pDsRed-CTGF真核表達載體構建

pMD18-CTGF重組質粒與提純后的pDsRed-N1載體分別用Hind III和BamH I進行雙酶切，以1.5%瓊脂糖電泳檢測后回收酶切產物。經T4 DNA連接酶連接后轉化DH5α感受態細胞，通過卡那霉素（Kna+）篩選，挑取陽性克隆進行測序鑒定。

1. 6 轉染小鼠Hep3B細胞及驗證

將小鼠Hep3B細胞成功復蘇后傳代至6孔板中，當細胞數量達60%～70%時按照Lipofectamine? LTX and Plus Reagent說明以構建的pDsRed-CTGF真核表達載體對其進行轉染。轉染48 h后置于倒置顯微鏡上觀察熒光并拍照記錄。同時收集細胞，采用TRIzol法提取總RNA后進行實時熒光定量PCR檢測。

2 結果與分析

2. 1 廣西巴馬小型豬CTGF基因擴增結果

以廣西巴馬小型豬肝臟組織總RNA為模板進行RT-PCR擴增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，約在1050 bp處出現單一明亮的目的條帶，與預期結果相符。

2. 2 pDsRed-CTGF真核表達載體構建及驗證結果

將pMD18-CTGF重組質粒與pDsRed-N1載體分別用Hind III和BamH I進行雙酶切，酶切產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果顯示目標條帶清晰，其條帶大小約為4700和1050 bp，與預期結果相符。分別回收酶切產物（載體骨架和目的片段），然后采用T4 DNA連接酶進行連接并轉化DH5α感受態細胞，挑選陽性克隆菌去內毒提取pDsRed-CTGF真核表達載體。經Hind III和BamH I雙酶切后采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果獲得兩條清晰的目標條帶，與預期結果相符。其中一條條帶約4700 bp，與載體骨架大小一致，另外一條條帶為目的基因片段，約1050 bp。

2. 3 pDsRed-CTGF真核表達載體轉染小鼠Hep3B細胞的效果

分別以pDsRed-CTGF真核表達載體和pDsRed-N1載體轉染小鼠Hep3B細胞48 h，結果發現二者轉染的小鼠Hep3B細胞均能觀察到紅色熒光，表明pDsRed-CTGF真核表達載體構建成功且能轉染小鼠Hep3B細胞。轉染48 h后收集小鼠Hep3B細胞進行CTGF基因實時熒光定量PCR檢測，結果表明，pDsRed-CTGF轉染組小鼠Hep3B細胞中的CTGF基因相對表達量顯著高于pDsRed-N1轉染組（P<0.05），說明廣西巴馬小型豬CTGF基因能在小鼠Hep3B細胞中成功表達。

2. 4 廣西巴馬小型豬CTGF基因測序結果

對陽性pDsRed-CTGF真核表達載體進行測序，結果表明構建獲得的真核表達載體中包含廣西巴馬小型豬CTGF基因的完整編碼區（CDS），序列全長1050 bp，共編碼349個氨基酸。利用Nucleotide BLAST對測序得到的CTGF基因CDS序列與NCBI上已公布的普通豬CTGF基因CDS序列進行比對，結果發現共有5處堿基發生突變，分別是：第813位C→T，第816位C→T，第825位T→C，第990位C→G，第993位G→T。采用Protein BLAST對CTGF編碼氨基酸序列與NCBI上已公布的普通豬CTGF氨基酸序列進行比對，發現5處堿基突變均為同義突變，并未引起氨基酸改變。

2. 5 廣西巴馬小型豬CTGF基因生物信息學分析結果

2. 5. 1 系統發育進化樹 采用Oligo 7.6中的MegAlign對測序獲得的廣西巴馬小型豬CTGF基因CDS序列與NCBI上已公布的其他物種CTGF基因CDS序列進行同源性比對分析，得知廣西巴馬小型豬與普通豬（Sus scrofa）、人類（Homo sapiens）、牛（Bos taurus）、褐家鼠（Rattus norvegicus）和雞（Gallus gallus）的同源性分別為99.5%、91.0%、91.7%、89.0%和84.3%。其中，廣西巴馬小型豬與普通豬的親緣關系最近，其次是牛，親緣關系最遠的是雞。

2. 5. 2 CTGF蛋白親/疏水性分析結果 借助ExPASy ProtScale預測CTGF蛋白的親/疏水性，CTGF蛋白具有較強的親水性，與ExPASy ProtParam預測得到的總平均疏水分值（GRAVY= -0.189）相符。

2. 5. 3 CTGF蛋白二級和三級結構預測結果 利用NPS@在線蛋白分析系統對廣西巴馬小型豬CTGF蛋白二級結構進行預測。在廣西巴馬小型豬CTGF蛋白二級結構中，α-螺旋（以h表示）、β-折疊（以t表示）、氨基酸殘基構成的延伸鏈（以e表示）、無規則卷曲（以c表示）各占13.18%、5.73%、17.48%和63.61%。同時利用SWISS-MODEL分析預測廣西巴馬小型豬CTGF蛋白三級結構，得知廣西巴馬小型豬CTGF蛋白可能存在的三級結構有5種模型。

3 討論

CTGF屬于新的富含半胱氨酸生長因子家族成員之一，由349個氨基酸組成，在人類的心血管系統、腦組織、骨骼肌、消化道、腎臟和胰腺等組織器官中均有發現，其中含量最高的是腎臟（Wada et al.，2002）。CTGF在機體發育與分化、雌性生殖系統、血管生成（Kubota and Takigawa，2007）、傷口修復（de Winter et al.，2008;Liu et al.，2011）、纖維變性病變（Leask，2009）、炎性病變及腫瘤發生發展（包晶晶等，2013）等多種生物學過程中發揮重要作用。目前，關于CTGF在癌癥方面的研究報道較多。Liu等（2008）認為CTGF可作為胃癌前病變、早期診斷和預后判定的指標，而柏秀玉等（2016）認為CTGF可作為卵巢癌新的標志物。CTGF對不同腫瘤具有細胞特異性和環境特異性，在不同腫瘤組織中的表達也不同。此外，有研究報道CTGF有可能成為風濕性心臟病抗纖維化治療的潛在靶點（Wang et al.，2016）。如在增殖性糖尿病視網膜病變中，CTGF的靶向治療可能是預防增殖性糖尿病及其他與新血管形成和纖維化相關眼部疾病的新方法（Kuiper et al.，2008）。

本研究從廣西巴馬小型豬肝臟組織中成功克隆獲得CTGF基因CDS序列，通過與NCBI上已公布的普通豬CTGF基因CDS序列進行比對，發現共有5處堿基發生突變，且均為同義突變，說明CTGF基因在進化過程中的保守性非常穩定。廣西巴馬小型豬CTGF基因CDS序列與NCBI上已公布其他物種CTGF基因CDS序列的同源性分析結果顯示，廣西巴馬小型豬與普通豬的親緣關系最近（同源性達99.5%），其次是牛（同源性為91.7%），與人類的同源性也在90.0%以上。廣西巴馬小型豬的各種生理生化指標及各臟器組織的大小結構與人體極為相似，可作為動物模型用于與人類相關疾病的研究（齊麗娜等，2012;宋少銳等，2014;司景磊等，2016）。本研究結果還表明，廣西巴馬小型豬CTGF基因在pDsRed-CTGF真核表達載體和pDsRed-N1載體轉染的小鼠Hep3B細胞中均有表達，但pDsRed-CTGF轉染組小鼠Hep3B細胞中的CTGF基因相對表達量顯著高于pDsRed-N1轉染組，說明廣西巴馬小型豬CTGF基因能轉染小鼠Hep3B細胞并成功表達，與吳延軍等（2015）的研究結果一致，為生產CTGF轉基因廣西巴馬小型豬提供了技術支持。

目前，有關臟器移植、干細胞、轉基因等研究領域發展迅速。國外學者Kragh等（2009）已成功利用手工克隆方法生產出針對阿爾茨海默病的轉基因小型豬模型;郝朝亮等（2014）已成功通過體細胞核移植及脂質體轉染技術生產出廣西巴馬小型豬轉基因克隆胚胎，為后期生產轉基因廣西巴馬小型豬疾病模型奠定了基礎。本研究構建了廣西巴馬小型豬CTGF基因的真核表達載體，并成功轉染小鼠Hep3B細胞，為研究CTGF基因在哺乳動物中的表達規律及其生物學活性打下基礎，也為研發治療由CTGF引發的癌癥藥物提供參考依據。

4 結論

廣西巴馬小型豬CTGF基因在進化過程中的保守性非常穩定，通過構建的真核表達載體能轉染小鼠Hep3B細胞并成功表達，可用于生產轉基因廣西巴馬小型豬及研發與CTGF基因有關的疾病模型。

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（責任編輯 蘭宗寶）