楊樹天冬氨酸轉氨酶基因家族鑒定及表達分析

王宇晨 曲春浦 劉關君

摘要：【目的】鑒定楊樹天冬氨酸轉氨酶（ASPAT）基因家族成員，并檢測其組織表達特異性，為研究ASPAT在楊樹初級氮素同化中的生物學功能提供參考依據。【方法】從楊樹基因組數據庫中篩選鑒定ASPAT基因家族成員，利用生物信息學軟件分析各基因家族成員序列和基因結構及編碼蛋白的理化性質、亞細胞定位和保守基序等，并利用實時熒光定量PCR檢測正常施氮處理（1 mmol/L NH4NO3）下其在楊樹根、莖和葉中的組織表達特異性。【結果】從楊樹基因組中共鑒定出9個ASPAT基因家族成員，包括7個真核型ASPAT（AAT）基因（PtASPAT1～PtASPAT7）和2個原核型ASPAT（PAT）基因（PtASPAT8～PtASPAT9），編碼區（CDS）序列長度1215～1791 bp，編碼的氨基酸數目304～480個，外顯子數7～14個，編碼蛋白的等電點5.66～8.99，相對分子質量33.11～53.31 kD，脂融指數76.36～93.54，分別定位于葉綠體、線粒體和胞質中，除PtASPAT6和PtASPAT7為不穩定蛋白，其他均為穩定蛋白。擬南芥和楊樹的ASPAT蛋白可聚為兩大類，Ⅰ類為AAT蛋白，包括PtASPAT1～PtASPAT7和AtASPAT1～AtASPAT5;Ⅱ類為PAT蛋白，包括PtASPAT8、PtASPAT9和擬南芥PAT（AtPAT）。PtASPAT1～PtASPAT6均含有5個保守基序，PtASPAT7缺少2個保守基序，PtASPAT8和PtASPAT9均僅含有1個與AtPAT相同的保守基序。9個楊樹ASPAT蛋白均含有磷酸吡哆醛結合位點（SGTHNYSSK）、同源二聚體多肽結合位點（GAVAER）和催化殘留活性位點（K）。正常氮素處理下，PtASPAT1基因在楊樹根、莖和葉中表達量無明顯差異;PtASPAT2～PtASPAT9基因在根部的表達量較在莖和葉中的高，尤其是PtASPAT4和PtASPAT8基因表達量較高。【結論】楊樹ASPAT基因家族成員主要在根部表達，尤其是PtASPAT4和PtASPAT8基因在楊樹根部的初級氮素同化中發揮重要作用。

關鍵詞： 楊樹;天冬氨酸轉氨酶（ASPAT）;基因家族;生物信息學;基因表達

中圖分類號： S792.119? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）03-0506-09

0 引言

【研究意義】氮素是植物生長發育必不可少的元素之一，是生物大分子如蛋白質、核酸及生長激素等的重要組分（于妍等，2008;趙會杰等，2017;杜亞琳等，2018）。我國北方土地干旱、貧瘠，影響著當地林木及農作物的生長發育，嚴重制約著生態重建和木材供求，目前多采用增施氮肥的方法促進其生長，但易對環境造成不利影響（馬文奇等，2006;劉寶林等，2017;李源等，2019）。因此，如何平衡二者關系一直是土壤肥料學科的研究熱點。與合理施加氮肥相比，采用分子手段改造植物的氮素利用效率，更加省時省力。天冬氨酸轉氨酶（ASPAT）作為初級氮素同化的關鍵酶，可提高植物氮素利用效率（劉瑞響等，2012;梁成剛等，2013;劉紅江等，2017）。本研究對楊樹（Populus tomentosa）ASPAT基因家族進行鑒定，明確其生物學功能及表達特性，對提高楊樹乃至我國北方林木的氮素利用率具有重要意義。【前人研究進展】天冬氨酸是多種氨基酸及衍生代謝物生物合成的前體，是生命有機體重要的組成成分，由ASPAT催化轉氨基反應而合成（Wilkie et al.，1996）。植物質體中包含兩種ASPAT，即真核型ASPAT（AAT）和原核型ASPAT（PAT）（Robinson et al.，1994;Schultz and Coruzzi，1995）。與AAT相比，PAT不僅具有ASPAT活性，還具有預苯酸轉氨酶活性（de la Torre et al.，2014）。擬南芥（Arabidopsis thaliana）作為模式植物，其ASPAT基因家族較小，僅含有5種AAT和1種PAT（de la Torre et al.，2006）。其中，ASPAT2和ASPAT4基因在細胞溶質中發揮功能;ASPAT3和ASPAT5基因在葉綠體中行使功能;ASPAT1則在線粒體行使功能（Schultz and Coruzzi，1995）;擬南芥PAT基因與上述5種AAT基因的序列相似度較低，但與藍細菌PAT基因序列相似度較高（de la Torre et al.，2006）。有研究表明，PAT與發育中的葉綠體蛋白積累密切相關（Graindorge et al.，2014），已從高等植物如發豆、番茄和羽扇豆等中成功克隆并鑒定（Martins et al.，2002;Miesak and Coruzzi，2002;Silvente et al.，2003）。Sentoku等（2000）研究發現，轉ASPAT基因煙草的線粒體或胞質中ASPAT基因過表達，其ASPAT活性比野生型煙草高3倍，且磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因（PEPC）轉錄水平明顯上調。Miesak和Coruzzi（2002）研究發現，擬南芥胞質ASPAT2基因參與種子天冬氨酸和天冬酰胺的合成。Zhou等（2009）研究發現，水稻葉綠體或胞質過表達ASPAT基因時其種子中的總游離氨基酸含量明顯增加。【本研究切入點】目前，在擬南芥、煙草和水稻等植物中ASPAT基因已被深入研究。與這些材料相比，楊樹具有生長迅速、環境適應性強、易無性繁殖和多年生長等特點，可用于長期研究目的基因在不同生長周期或不同環境條件下的生物學功能，但至今鮮見有關楊樹ASPAT基因家族鑒定及表達分析的研究報道。【擬解決的關鍵問題】根據擬南芥ASPAT蛋白氨基酸序列，在楊樹基因組數據庫（Phytozome 13.0）進行同源蛋白BLASTp比對分析，獲得楊樹ASPAT基因家族候選成員。利用生物信息學軟件分析各成員序列和基因結構及編碼蛋白的理化性質、亞細胞定位和保守基序等，并利用實時熒光定量PCR檢測正常施氮處理下各基因的組織表達特異性，為深入研究ASPAT在楊樹初級氮素同化中的生物學功能提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料為1年生小黑楊（P. simonii Carr.×P. nigra L.）莖段插穗，來源于東北林業大學林木遺傳育種國家重點實驗室。主要試劑：植物總RNA提取試劑盒購自上海恪敏生物科技有限公司;反轉錄試劑盒（PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser）購自TaKaRa公司;實時熒光定量PCR試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。主要設備儀器：7500型熒光定量PCR儀（ABI，美國）。

1. 2 樣品處理

將冷凍保存的1年生小黑楊莖段插穗（莖粗0.8～1.0 cm）進行扦插。1個月后對扦插苗進行截頂，長度為4～5個節間，約15 cm。每個幼苗保留2～3片嫩葉，清水培養至生根，移栽至蛭石中，以1 mmol/L硝酸銨（NH4NO3）作為唯一氮源，添加至不含氮素的LA營養液，每3 d澆200 mL LA營養液。處理至16 d，采集幼苗的根、莖和葉，每3株按組織混樣，用錫紙進行包裹，液氮冷凍于-80 ℃保存。

1. 3 楊樹ASPAT基因家族成員搜索及鑒定

從擬南芥全基因組數據庫（TAIR）下載獲得6個擬南芥ASPAT蛋白氨基酸序列，并在Phytozome 13.0數據庫中進行BLASTp比對，獲得楊樹ASPAT基因家族候選成員。利用Pfam和SMART對候選基因進行進一步確認，以獲得楊樹ASPAT基因家族的染色體位置、編碼區序列（CDS）及編碼蛋白的氨基酸序列等信息。

1. 4 生物信息學分析

利用ExPASy ProtParam分析楊樹ASPAT的分子量和等電點;運用Plant-mPloc對楊樹ASPAT進行亞細胞定位預測;利用GSDS繪制楊樹ASPAT基因結構圖，分析其外顯子和內含子結構;利用MEME對楊樹ASPAT蛋白的保守基序進行預測，參數預測數目設為5，長度設為6～50，其他參數均為默認設置。利用ClustalX 1.83將6個擬南芥ASPAT蛋白與楊樹ASPAT蛋白進行同源比對，并采用MEGA 5.0的相鄰連接法（Neighbor-Joining，NJ）構建系統發育進化樹，校驗參數BootStrap重復為1000次，其他參數均為默認值。運用SOPMA預測楊樹ASPAT蛋白質二級結構;對楊樹AAT與擬南芥AAT進行氨基酸序列比對，并從NCBI上下載多個物種的PAT蛋白氨基酸序列進行比對分析。

1. 5 組織表達特異性檢測

采用植物總RNA提取試劑盒提取楊樹樣品的總RNA，用反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA。采用Primer 5.0設計定量引物（表1），由哈爾濱市新海基因有限公司合成。實時熒光定量PCR試劑盒檢測楊樹ASPAT基因家族成員在楊樹根、莖和葉的表達情況，以PtActin2為內參基因。反應體系20.0 μL：SYBR Mixture 10.0 μL，cDNA模板2.0 μL，上、下游游引物各0.8 μL，ddH2O補足至20.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性10 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共進行40個循環;95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s;60 ℃ 15 s。每個樣品設3次重復，重復數據采用2-ΔΔCt方法進行計算相對表達量。

1. 6 統計分析

試驗數據采用Excel 2017進行整理及制圖。

2 結果與分析

2. 1 楊樹ASPAT基因家族鑒定及編碼蛋白的氨基酸序列分析結果

由表2和表3可知，從楊樹基因組中共鑒定到9個ASPAT基因家族成員，CDS序列長度為1215～1791 bp，編碼的氨基酸數目304～480個，理論等電點5.66～8.99，相對分子質量33.11～53.31 kD，脂融指數76.36～93.54。除了PtASPAT6和PtASPAT7蛋白為不穩定蛋白，其他均為穩定蛋白。9個ASPAT基因家族成員分布于第5、6、7、14、16和18號染色體，其中，PtASPAT9位于第5號染色體，PtASPAT1、PtASPAT2和PtASPAT5位于第6號染色體，PtASPAT8位于第7號染色體，PtASPAT6位于第14號染色體，PtASPAT7位于第16號染色體，PtASPAT3和PtASPAT4位于第18號染色體。PtASPAT1和PtASPAT3定位于葉綠體和線粒體，PtASPAT4、PtASPAT5、PtASPAT8和PtASPAT9定位于葉綠體，PtASPAT2和PtASPAT6定位于線粒體，PtASPAT7定位于細胞質。跨膜結構域數目為1～13，其中，PtASPAT9只有1個跨膜結構域，PtASPAT3有13個跨膜結構域。PtASPAT3和PtASPAT7疏水性分值（GARVY）分別為0.050和0.053，推測為疏水性蛋白，其余蛋白為親水性蛋白。

由表4可知，9個楊樹ASPAT蛋白的二級結構主要以α-螺旋、無規則卷曲和延伸鏈結構為主，β-轉角所占比例均較小。其中PtASPAT1、PtASPAT2、PtASPAT3、PtASPAT4、PtASPAT5、PtASPAT6和PtASPAT7均以α-螺旋結構所占比例最大，為37.59%～46.78%，其次為無規則卷曲結構，占30.26%～35.82%;PtASPAT8和PtASPAT9則以無規則卷曲所占比例最大，分別為37.80%和38.75%，其次為α-螺旋結構，分別為35.39%和38.12%。

2. 2 系統發育進化樹構建結果

采用MEGA5.0的相鄰連接法構建系統發育進化樹。擬南芥和楊樹的ASPAT蛋白可聚為兩大類，Ⅰ類為AAT蛋白，包括PtASPAT1～PtASPAT7和AtASPAT1～AtASPAT5;Ⅱ類為PAT蛋白，包括PtASPAT8、PtASPAT9和擬南芥PAT（AtPAT），PtASPAT8與PtASPAT9氨基酸序列相似度高達90%。由此推測，PtASPAT8和PtASPAT9為PAT，其他7個PtASPAT為AAT。

2. 3 楊樹ASPAT基因家族成員基因結構分析結果

PtASPAT1和PtASPAT3均含10個內含子和11個外顯子，PtASPAT2、PtASPAT6和PtASPAT9均含9個內含子和10個外顯子，PATSPAT5含13個內含子和14個外顯子，PtASPAT4含11個內含子和12個外顯子，PtASPAT7含8個內含子和9個外顯子;PtASPAT8含7個內含子和7個外顯子。

2. 4 楊樹ASPAT蛋白的保守基序及序列比對分析結果

楊樹ASPAT蛋白共有5個保守基序，其中PtASPAT1～PtASPAT6與AtASPAT1～AtASPAT5一致，均含有5個保守基序，PtASPAT7缺少2個保守基序。PtASPAT8和PtASPAT9與AtPAT一致，僅含有1個相同的保守基序，進一步證實PtASPAT8和PtASPAT9為PAT。

楊樹AAT蛋白（PtASPAT1、PtASPAT2、PtASPAT3、PtASPAT4、PtASPAT5、PtASPAT6和PtASPAT7）含有磷酸吡哆醛結合位點（SGTHNYSSK）、同源二聚體多肽結合位點（GAVAER）及催化殘留活性位點（K）。從NCBI下載多個物種的PAT蛋白氨基酸序列，并與楊樹PAT蛋白（PtASPAT8和PtASPAT9）進行比對分析。PtASPAT8和PtASPAT9含有磷酸吡哆醛結合位點（SGTHNYSSK）、同源二聚體多肽結合位點（GAVAER）及催化殘留活性位點（K），與植物乳酸桿菌（Lactobacillus plantarum）、大腸桿菌（Escherichia coli str. K-12 sub）、短藥野生稻（Oryza brachyantha）和擬南芥（A. thaliana）的PAT蛋白氨基酸序列的相似度為36%～77%，其中與AtPAT相似度最高，為77%，與植物乳酸桿菌PAT蛋白相似度最低，為36%。

2. 5 楊樹ASPAT基因家族的組織表達特異性檢測結果

正常氮素處理下，PtASPAT1基因在楊樹根、莖和葉中的相對表達量無明顯差異;PtASPAT2～PtASPAT9在根部的相對表達量較在莖和葉中的高，其中PtASPAT4基因在根部的相對表達量最高，是其他基因的3～23倍，其次是PtASPAT8基因，推測在楊樹根部主要由PtASPAT4和PtASPAT8催化合成天冬氨酸。

3 討論

植物氮利用效率可從兩方面得到提高：一是增加土壤的施氮肥量，精準施肥;二是提高植物本身吸收和利用氮的能力。近年來研究發現，不同物種或品種間總吸氮量及在不同發育時期對氮的吸收、轉化和同化能力均存在明顯差異，因此，提高氮利用效率關鍵在于提高植物本身吸收和利用氮的能力（Krouk et al.，2010;Teng et al.，2017）。Murooka等（2002）研究發現，擬南芥過表達天冬酰胺合成酶基因（AS2）可增強植株谷氨酰胺的積累量。Cai等（2009）研究發現，過表達谷氨酰胺合成酶基因（GS1.1）使水稻產量明顯增加，過表達GS1.2基因使水稻的氮素利用效率明顯提高，且蛋白含量也有所增加。Sentoku等（2000）、Igarashi等（2009）研究表明，擬南芥和煙草過表達ASPAT基因時植株中的天冬氨酸含量均有所增加。周瑩（2009）研究發現，轉ASPAT1、ASPAT2和PAT基因的水稻植株過表達這3個基因時均可提高種子的氨基酸和蛋白含量。

本研究從楊樹基因組庫中共鑒定出9個PtASPAT基因，其中7個編碼AAT蛋白，2個編碼PAT蛋白，分別定位于葉綠體、線粒體和胞質中。但Ireland和Joy（1983）研究發現，植物中僅存在一種PAT。本研究結果顯示，楊樹的7個AAT蛋白和2個PAT蛋白均含有磷酸吡哆醛結合位點（SGTHNYSSK）、同源二聚體多肽結合位點（GAVAER）及催化殘留活性位點（K），但數量和位置存在明顯差異，其原因可能是AAT和PAT單體均包含質體靶向的N-末端信號肽，但二者對磷酸酯底物的識別、結合底物的穩定性及最佳結合方向均不同（Morino et al.，2004）。目前，對所結合底物的研究還不是很全面（Wilkie et al.，1996;de la Torre et al.，2009）。本研究的組織特異性表達檢測結果顯示，除PtASPAT1基因在楊樹根、莖和葉中的表達量無明顯差異外，其他8個PtASPAT基因在根部的表達量均高于在葉和莖中的表達量，尤其是PtASPAT4和PtASPAT8基因，其原因是植物NH4+的同化過程主要發生在根部，谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶（GS/GOGAT）循環將NH4+同化成谷氨酰胺和谷氨酸，再經由ASPAT催化轉氨基反應，最終合成天冬氨酸，推測PtASPAT4和PtASPAT8基因在該過程發揮重要作用。今后應深入研究PtASPAT4和PtASPAT8基因在氮素同化機制的調控機制，以提高楊樹根部氮素利用效率。

4 結論

楊樹ASPAT基因家族成員主要在根部表達，尤其是PtASPAT4和PtASPAT8基因在楊樹根部的初級氮素同化中發揮重要作用。

參考文獻：

杜亞琳，陳海燕，徐麗琳，王琛，范蓮雪. 2018. 黃瓜氮素脅迫相關基因CsAHP1的克隆及功能分析[J]. 河南農業科學，47（6）：92-97. [Du Y L，Chen H Y，Xu L L，Wang C，Fan L X. 2018. Cloning and function analysis of cucumber CsAHP1 gene involved in nitrogen tolerance[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences，47（6）：92-97.]

李源，張炎，哈麗哈什·依巴提，李青軍. 2019. 新型尿素對膜下滴灌棉花產量及氮肥利用率的影響[J]. 江蘇農業學報，35（1）：85-90. [Li Y， Zhang Y，Halihashi·Yibat，Li Q J. 2019. Effects of new-type urea on yield and nitrogen use efficiency of drip irrigated cotton under plastic film mulching[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Scien-ces，35（1）：85-90.]

梁成剛，張青，李敬，熊丹，許光利，汪燕，劉泉，黃鵬，李天. 2013. 水稻灌漿期高溫對天冬氨酸代謝酶活性及其家族氨基酸含量的影響[J]. 中國水稻科學，27（1）：71-76. [Liang C G，Zhang Q，Li J，Xiong D，Xu G L，Wang Y，Liu Q，Huang P，Li T. 2013. Effects of high temperature on aspartate metabolic enzyme activity and its family amino acid content during rice filling period[J]. Chinese Rice Science，27（1）：71-76.]

劉寶林，鄒小云，宋來強，官春云. 2017. 氮肥追施時期對油菜產量、效益及氮素吸收利用的影響[J]. 江西農業學報，29（11）：29-32. [Liu B L，Zou X Yun，Song L Q，Guan C Y. 2017. Effects of nitrogen fertilizer topdressing period on yield，benefit and nitrogen absorption and utilization of rapeseed[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，29（11）：29-32.]

劉紅江，肖敏，張麗萍，陳留根，張岳芳，郭智，鄭建初. 2017. 前氮后移對水稻氮素吸收和利用效率的影響[J]. 江蘇農業學報，33（3）：550-554. [Liu H J，Xiao M，Zhang L P，Chen L G，Zhang Y F，Guo Z，Zheng J C. 2017. Nitrogen uptake and use efficiency of rice in response to postponed nitrogen application[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，33（3）：550-554.]

劉瑞響，曹曉良，陶勇生，張祖新. 2012. 不同氮素水平下玉米產量與zmAspAT基因表達分析[J]. 中國農學通報，28（24）：22-26. [Liu R X，Cao X L，Tao Y S，Zhang Z X. 2012. Analysis of maize yield and zmAspAT gene expre-ssion under different nitrogen levels[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，28（24）： 22-26.]

馬文奇，張福鎖，陳新平. 2006. 中國養分資源綜合管理研究的意義與重點[J]. 科技導報，24（10）：64-67. [Ma W Q，Zhang F S，Chen X P. 2006. Significance and focus of research on integrated management of nutrient resources in China[J]. Science and Technology Review，24（10）：64-67.]

于妍，宋萬坤，劉春燕，高運來，李文福，孫殿君，陳慶山，胡國華. 2008. 植物天冬氨酸代謝途徑關鍵酶基因研究進展[J]. 生物技術通報，（S1）：7-11. [Yu Y，Song W K，Liu C Y，Gao Y L，Li W F，Sun D J，Chen Q S，Hu G H. 2008. Research progress on key enzyme genes in plant aspartate metabolic pathways[J]. Biotechnology Bulletin，（S1）：7-11.]

趙會杰，周穎，李華，王斯琪，許海良，蒲文宣，張錦韜，易克，汪耀富. 2017. 施氮量對烤煙葉片碳同化能力及同化產物分配的影響[J]. 河南農業大學學報，51（5）：603-608. [Zhao H J，Zhou Y，Li H，Wang S Q，Xu H L，Pu W X，Zhang J T，Yi K，Wang Y F. 2017. Effect of nitrogen app-lication rate on carbon assimilation capability and assimilation product distribution of flue-cured tobacco leaves[J]. Journal of Henan Agricultural University，51（5）：603-608.]

周瑩. 2009. 水稻中天冬氨酸轉氨酶的分子生物學研究和轉基因應用[D]. 武漢：華中農業大學. [Zhou Y. 2009. The reseach of molecular biology and application of aspartate aminotransferase in rice[D]. Wuhan：Huazhong Agricultural University.]

Cai H，Zhou Y，Xiao J，Li X，Zhang Q，Lian X. 2009. Overexpressed glutamine synthetase gene modifies nitrogen metabolism and abiotic stress responses in rice[J]. Plant Cell Reports，28（3）：527-537.

de la Torre F，Ca?as R A，Pascual M B，Avila C F，Cánovas M. 2014. Plastidic aspartate aminotransferases and the biosynthesis of essential amino acids in plants[J]. Journal of Experimental Botany，65（19）：5527-5534.

de la Torre F，Moya-García A，Suárez M F，Rodríguez-Caso C，Ca?as R A，Sánchez-Jiménez F，Cánovas F M. 2009. Molecular modelling and site-directed mutagenesis reveal essential residues for catalysis in a prokaryote-type aspartate aminotransferase[J]. Plant Physiology，149（4）：1648-1660.

de la Torre F，Santis L D，Crespillo R，Francisco M C. 2006. Identification and functional analysis of a prokaryotic-type aspartate aminotransferase：Implications for plant amino acid metabolism[J]. Plant Journal for Cell & Molecular Biology，46（3）：414-431.

Graindorge M，Giustini C，Kraut A，Moyet L，Curien G，Matringe M. 2014. Three different classes of aminotransfera-ses evolved prephenate aminotransferase functionality in arogenate-competent microorganisms[J]. Journal of Biological Chemistry，289（6）：3198-3208.

Igarashi D，Ishizaki T，Totsuka K，Ohsumi C. 2009. ASN2 is a key enzyme in asparagine biosynthesis under ammo-nium sufficient conditions[J]. Plant Tissue Culture Letters，26（1）：153-159.

Ireland R J，Joy K W. 1983. Subcellular localisation of asparaginase and asparagine aminotransferase in Pisum sativum leaves[J]. Plant Physiology，72（4）：1127-1129.

Krouk G，Crawford N M，Coruzzi G M，Yifang T，Sonnewald U，Frommer W B. 2010. Nitrate signaling：Adaptation to fluctuating environments[J]. Current Opinion in Plant Bio-logy，13（3）：265-272.

Martins M L L，Mourato M P de F B，Mendon?a A P A de V e. 2002. Characterization of aspartate aminotransferase isoenzymes from leaves of Lupinus albus L. cv Estoril[J]. Journal of Biochemistry and Molecular Biology，35（2）：220-227.

Miesak B H，Coruzzi G M. 2002. Molecular and physiological analysis of arabidopsis mutants defective in cytosolic or chloroplastic aspartate aminotransferase[J]. Plant Physio-logy，129（2）：650-660.

Morino K，Olsen O A，Shimamoto K. 2004. Silencing of the aleurone-specific Ltp2-gus gene in transgenic rice is reversed by transgene rearrangements and loss of aberrant transcripts[J]. Plant & Cell Physiology，45（10）：1500.

Murooka Y，Mori Y，Hayashi M. 2002. Variation of the amino acid content of Arabidopsis seeds by expressing soybean aspartate aminotransferase gene[J]. Journal of Bioscience & Bioengineering，94（3）：225-230.

Robinson D L，Kahn M L，Vance C P. 1994. Cellular localisation of nodule-enhanced aspartate aminotransferase in Medicago sativa L.[J]. Planta，192（2）：202-210.

Schultz C J ，Coruzzi G M. 1995. The aspartate aminotransferase gene family of Arabidopsis encodes isoenzymes loca-lized to three distinct subcellular compartments[J]. The Plant Journal，7（1）：61-75.

Sentoku N，Taniguchi M，Sugiyama T，Ishimaru K，Ohsugi R，Takaiwa F，Toki S. 2000. Analysis of the transgenic tobacco plants expressing Panicum miliaceum aspartate aminotransferase genes[J]. Plant Cell Reports，19（6）：598-603.

Silvente S，Camas A，Lara M. 2003. Molecular cloning of the cDNA encoding aspartate aminotransferase from bean root nodules and determination of its role in nodule nitrogen metabolism[J]. Journal of Experimental Botany，54（387）：1545-1551.

Teng W，He X，Tong Y P. 2017. Transgenic approaches for improving use efficiency of nitrogen，phosphorus and potassium in crops[J]. Journal of Integrative Agriculture，16（12）：2657-2673.

Wilkie S E，Lambert R，Warren M J. 1996. Chloroplastic aspartate aminotransferase from Arabidopsis thaliana：An examination of the relationship between the structure of the gene and the spatial structure of the protein[J]. The Biochemical Journal，319（3），969-976.

Zhou Y，Cai H，Xiao J，Li X，Lian X. 2009. Overexpression of aspartate aminotransfer ase genes in rice resulted in altered nitrogen metabolism and increased amino acid content in seeds[J]. Theoretical and Applied Genetics，118（7）：1381-1390.

（責任編輯 陳 燕）