印楝種子粗提物誘導煙草炭疽病抗性的生理效應

胡亞杰 韋建玉 王麗晶 陳吉榮 張紀利 江定心

摘要：【目的】研究印楝誘抗煙草炭疽病的機理，為煙草炭疽病的生物防治提供理論依據。【方法】測定根施印楝種子粉末對煙草炭疽病的防效，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測印楝種子粉末處理后煙草的NTF6、NtLox、NtSGT1、NtPAL、NtPDF、NPR1、NtRar1和PR1a等8個相關抗病基因的表達變化;對比葉面噴施不同印楝種子提取物（甲醇、乙酸乙酯和石油醚）溶液對煙草抗氧化酶活性的影響，并測定葉面噴施印楝種子甲醇提取物不同分離流分處理的煙葉總酚含量及抗炭疽病效果。【結果】根施印楝種子粉末可使煙草炭疽病的病情指數（26.67%）較對照（74.17%）顯著降低（P<0.05，下同）。qRT-PCR檢測結果表明，NPR1、NtRar1、NtSGT1和PR1a等4個抗病基因的相對表達量與印楝誘導煙草抗炭疽病相關。印楝種子甲醇提取物對煙草抗氧化酶活性的影響最大，其丙酮流分段在處理后6和96 h誘導煙草的總酚含量較對照明顯提高，分別為對照的2.52和3.34倍，且其誘導煙草抗炭疽病的能力最強，病情指數（25.00%）顯著低于對照（69.17%）。【結論】印楝種子提取物通過誘導提高PPO和POD抗病相關酶活性及誘導NPR1、NtRar1、NtSGT1和PR1a等抗病相關基因的表達產生抗炭疽病作用，且誘導活性成分主要存在于甲醇提取物的丙酮流分，其可作為煙草炭疽病的誘抗劑推廣應用于煙草生產。

關鍵詞： 煙草;炭疽病;印楝種子粗提物;誘導抗性;抗性機理

中圖分類號： S572.01? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）03-0524-09

0 引言

【研究意義】煙草炭疽病（Colletotrichum nicotia-nae Av. Sacca）是煙草的主要病害之一（孔凡彬等，2006）。目前防治煙草炭疽病仍以化學防治為主，由于缺乏對炭疽病抗藥性狀況的了解，一味增加用藥量及用藥次數，極易對環境造成污染，并引起病菌抗藥性，特別是煙葉農藥殘留偏高，給煙葉出口和卷煙安全性帶來不利影響（董志堅等，2004）。植物誘抗劑能誘導植物產生抗病性，且具有系統性、廣譜性、安全性和持續性等特點，近年來已逐漸成為綠色農藥開發的重要方向（劉勇鵬等，2017）。印楝（Azadirachta indica A. Juss）是世界上公認的最優秀生物農藥之一。印楝可殺蟲、抗菌和治病，在農業、園藝、花卉栽培、化妝品和醫藥等方面具有重要應用價值（Amadioha，1998），且其活性成分在自然界中無累積，對環境安全，對作物不產生藥害，特別適用于蔬菜、水果、煙草和茶葉等直接食用的作物（徐漢虹等，2017）。因此，探究印楝誘導煙草抗炭疽病的機理具有重要理論意義和應用價值，并為印楝在防治煙草炭疽病中的應用提供理論依據。【前人研究進展】吳鉅文和陳建峰（2002）研究表明，印楝制劑Tril-ogy[?]和Triac[?] 90% EC可用于防治果樹和作物的斑點落葉病、炭疽病及早疫病等真菌病害。趙淑英等（2004）比較了印楝素和苦楝素對4種常見植物病原菌的抑制效果，結果表明印楝素和苦楝素均具有較好的抑菌活性，且印楝素的抑菌活性明顯高于苦楝素，其中以甲醇提取物的活性最高。林靖凌等（2008）發現印楝的甲醇提取物對番木瓜炭疽病病原菌的抑制率可達39.72%。葉敏等（2009）研究表明，在一定時間范圍內，印楝素對植物病原菌菌絲生長的抑制率隨時間延長逐漸增加，但各供試病原菌抑制率隨時間延長而增加的速率存在差異。江厚龍等（2014）研究發現，誘抗劑處理后的煙草葉片，其抗性相關酶[過氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）]活性均有所提高。賴多等（2017）研究發現，印楝渣生物藥肥可有效控制香蕉枯萎病，且可促進香蕉的生長。楊鑫等（2018）研究發現，植物誘抗劑可通過增強抗氧化酶的活性及降低細胞膜脂質過氧化[丙二醛（MDA）含量]來激活植株的系統抗病性。【本研究切入點】印楝種子提取獲得的印楝素一直是農藥學的研究熱點，國內外有關印楝素和印楝的文獻報道已有2000多篇（徐漢虹等，2017），但針對印楝提取物在煙草炭疽病防治方面的研究尚未見報道。【擬解決的關鍵問題】以煙草品種K326為試驗材料，研究印楝對煙草炭疽病的誘抗作用，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術探究8個相關抗病基因的誘導表達，并測定印楝粗提物對煙草抗氧化酶活性和總酚含量變化的影響及煙草炭疽病誘導抗病效果，為利用印楝進行煙草炭疽病的生物防治提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試煙草品種K326由廣東煙草南雄科學研究所提供。印楝種仁采集自四川，低溫干燥，粉碎過20目篩。煙草炭疽病菌（C. nicotianae）由華南農業大學植物病理研究室提供。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 印楝誘導煙草炭疽病抗性測定

1. 2. 1. 1 煙苗培育 參照李海賓和于嘉（2012）的方法在華南農業大學溫室進行煙苗培育，以大田土壤裝缽，每缽1000 g，在14～24 ℃、光照12 h/d、濕度30%條件下育苗，每周施一次營養液，每缽約50 mL。

1. 2. 1. 2 接種菌液制備 參照李東升（2010）的方法，將炭疽病病原菌接種在PDA培養基上（200 g/L馬鈴薯，20 g/L葡萄糖，15 g/L瓊脂）28 ℃培養7 d，待充分產孢后，加入含0.02%（v/v）吐溫-20的無菌水10 mL浸泡15 min，用無菌棉簽洗下孢子和菌絲體，經無菌脫脂棉過濾，除去菌絲體，稀釋成1×107個/mL的孢子懸浮液。

1. 2. 1. 3 接種方法 煙苗培養至5～6片葉時，以每株煙草根施60 g印楝種子粉末為處理，以不施用印楝種子粉末為對照。在溫度25～26 ℃、濕度55%～60%條件下保濕3 d后接種。接種方法參照賓金華等（2000）方法，煙草葉片表面用無菌水擦拭干凈，將少量細金剛砂（600目）撒在待接種的煙草葉面上，手指在葉面上輕輕摩擦，然后用1×107個/mL的炭疽病孢子懸浮液涂抹于葉片表面直至形成一層水膜，接種后放置在溫度25～26 ℃、濕度55%～60%的恒溫箱中黑暗培育12 h，黑暗處理后放回溫室中培育，溫室中提供穩定光源，光照時間為12 h/d，溫度控制在25～26 ℃，濕度為55%～60%。每處理接種30株煙苗，發病后逐株調查病情指數。

1. 2. 1. 4 植株病情調查 參照王金華（2005）的方法，以病斑擴展垂直兩個方向的平均寬度計算單個病斑的直徑（d），進而計算每個接種斑點的面積，病斑面積（mm2）=3.14×（d/2）2。

炭疽病病情分級標準（陳瑞泰等，1997）：0級，全葉無病;1級，病斑面積占整片葉的5%以下;2級，病斑面積占整片葉的5%～10%;3級，病斑面積占整片葉的10%～25%;4級，病斑面積占整片葉的25% 以上。

病性指數=[（病株數×發病級數）總株數×最高發病級別數]×100

1. 2. 2 印楝誘導煙草抗性相關基因表達測定

1. 2. 2. 1 樣品處理 溫室培養至5～6片葉的K326煙苗，以每株根施60 g印楝種子粉末為處理，以不施用印楝種子粉末為對照。在溫度25～26 ℃、濕度55%～60%條件下保濕3 d后接種，在接種后1、3、5、7和9 d各取樣1次，炭疽病接種試驗和煙草的培養參考1.2.1。

1. 2. 2. 2 總RNA提取及cRNA合成 采用RNAiso Plus試劑盒（TaKaRa）提取處理后的煙草RNA，以RNA為模板利用逆轉錄試劑盒反轉錄合成第一條cDNA鏈，再利用DNA聚合酶合成第二條cDNA鏈。

1. 2. 2. 3 qRT-PCR檢測 利用SYBR Premix Ex Taq kit（TaKaRa）在TP900 Thermal Cycler DiceTM Real Time System（TaKaRa）上進行qRT-PCR檢測，利用Premier 5.0設計特異性擴增引物（表1），由上海博尚生物技術有限公司合成。反應體系25.0 μL：2×SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL，10.0 μmol/L正、反向引物各0.5 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 9.5 μL。擴增程序：95 ℃ 預變性5 min;94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，進行40個循環;72 ℃延伸10 min。在每一個循環的退火階段收集熒光進行實時檢測，反應結束后，得到含有所有標本的記錄點曲線。最終顯示的數據通過2-ΔΔCt方法，以β-actin為內參基因。對于每個樣品，將兩個相對獨立的反轉錄反應合并在一起，所有的qRT-PCR檢測均依據相同的合成cDNA。每次試驗進行3次技術重復和3次生物學重復。

1. 2. 3 印楝種子粗提物對煙草POD、PPO和PAL活性的影響

1. 2. 3. 1 印楝種子有效成分提取 將印楝種仁低溫干燥，粉碎過20目篩，取20 g粉末置于三角瓶中，分別用甲醇、乙酸乙酯和石油醚提取濃縮濾液。甲醇提取物處理后為淺黃色粉末，乙酸乙酯提取物為褐色膏狀物，石油醚提取物為油狀物。將3種不同的印楝提取物分別置于冰箱內冷藏備用。

1. 2. 3. 2 煙草處理 煙草培養至5～6片葉時，分別噴施3種印楝萃取物配制成的溶液，以噴施清水為對照。每處理重復3次。在溫度25～26 ℃、濕度55%～60%下保濕3 d后接種。在接種后1、3、5、7、9和11 d分別取樣1次，測定PLA、PPO和POD活性。

1. 2. 3. 3 粗酶液制備 PPO和POD粗酶液：取煙葉0.5 g，放入預冷研缽中液氮速凍，加入0.1 mol/L、 pH 6.8的磷酸緩沖液1.5 mL和少量石英砂，冰浴中研磨成勻漿。將勻漿液全部轉入離心管中，于4 ℃、12000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液，轉入 5 mL試管待用。PAL粗酶液制備參照Gonzalez-Aguilar等（2004）的方法：取煙葉0.5 g，放入預冷的研缽中液氮速凍，加入0.1 mol/L pH 8.8的硼酸緩沖液（含5 mmol/L巰基乙醇、1 mmol/L EDTA及1% PVP）1.5 mL，在冰浴中研磨成勻漿，然后于4 ℃下12000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液，轉入5 mL試管待用。

1. 2. 3. 4 酶活性測定 PPO活性測定參照Tan和Harris（1995）的方法，反應體系：0.1 mL粗酶液、0.02 mol/L鄰苯二酚溶液1.4 mL（用pH 6.8緩沖液配制）、1.5 mL磷酸緩沖液。對照組中以磷酸緩沖液代替粗酶液，其他同反應體系。室溫下測定410 nm處吸光值，每30 s記錄1次，連續測定3 min，以每分鐘吸光值變化0.01為1個酶活性單位（U），每處理重復3次。

POD活性測定參照李易興（2016）的方法，反應體系：2.9 mL pH 6.0磷酸緩沖液、0.1 mL粗酶液、0.05 mol/L愈創木酚30 μL（用pH 6.0磷酸緩沖液配制后于30 ℃水浴中保溫10 min）、30%過氧化氫50 μL。對照組中以磷酸緩沖液代替粗酶液，其他同反應體系。室溫下測定470 nm處吸光值，每30 s記錄1次，連續測定3 min，以每分鐘吸光值變化0.01為1個酶活性單位（U），每處理重復3次。

PAL活性測定參照楊光道等（2007）的方法，反應體系：0.2 mL酶液、1.0 mL硼酸緩沖液和0.02 mol/L L-苯丙氨酸1.0 mL。對照組中不加粗酶液而用0.2 mL硼酸緩沖液代替，其余同反應體系。反應體系于40 ℃水浴60 min，加入0.2 mL 6 mol/L HCI終止反應，隨后測定OD290值，以OD值變化0.01為1個酶活性單位（U），每處理重復3次。

1. 2. 4 印楝種子甲醇提取物粗分離 取少量100～200目硅膠，置于研缽內，用少量丙酮溶解甲醇提取的印楝素干粉，并用滴管滴加到硅膠上，玻棒攪散，待丙酮揮發后將樣品碾勻備用。

將200～300目硅膠G加到氯仿中，充分攪勻后轉入玻璃層析柱中，靜置過夜，檢查柱中氣泡情況，若狀態良好，將拌入硅膠中的樣品上柱，再加入2～3 cm厚的石英砂。流動相為氯仿、氯仿∶丙酮（體積比分別為95∶5、90∶10、1∶1）和丙酮，每次收集100 mL。以TLC點板顯色比較，分別合并相近的流分，將合并溶液減壓蒸干備用。

1. 2. 5 總酚含量測定 采用福林—酚比色法測定多酚含量（田桂芝等，2015）。

1. 2. 6 印楝種子甲醇提取物各流分產物對煙草炭疽病抗性測定 將氯仿∶丙酮（體積比分別為95∶5、1∶1）和丙酮流分物質配成適宜濃度噴施在煙草上，12 h后用1×107個/mL的孢子懸浮液接種供試煙草葉片。接種方法和炭疽病發病情況統計參照1.2.1。

1. 3 統計分析

采用Excel 2007和SPSS 17.0對數據進行整理和統計分析。

2 結果與分析

2. 1 印楝誘導煙草炭疽病抗性測定結果

印楝誘導煙草炭疽病抗性試驗結果（表2）顯示，印楝處理的煙草炭疽病病情指數為26.67%，而對照的病情指數達74.17%，二者差異顯著（P<0.05，下同）。這可能是由于印楝處理后的煙草具有誘導抗性，使得其病情指數顯著低于對照，說明根施印楝種子粉末可有效提高煙草對炭疽病的抗性。

2. 2 印楝誘導煙草抗性基因的表達結果

qRT-PCR檢測結果顯示，接種煙草炭疽病菌后，對照煙葉中抗病相關基因NPR1、NTF6、Ntlox1、NtRar1、NtSGT1、PAL、PDF1.2和PR1a的表達變化均不明顯。印楝處理的煙草葉片中，接種后第1 d NPR1基因的相對表達水平很低，接種后第3～5 d急劇升高，第3 d升至對照的2562倍，第5 d升至對照的10789倍，第7 d急劇降至接種后第1 d的水平，隨后略有升高;NtRar1基因的表達水平在接種后第1 d略高于對照，第3 d時低于對照，至第5 d達峰值，為對照的10.15倍，接種后第7～9 d降至對照水平;NtSGT1基因的相對表達量在接種后第1～5 d變化不明顯，且均低于對照，至第7 d時達峰值，為對照的12.76倍，接種后第9 d降低至對照水平;PR1a基因的表達水平在接種后第1 d達峰值，為對照的6872倍，第3 d時急劇降低，第5 d又略有升高，第7～9 d再次降低至對照水平;其他4個基因的表達水平在接種后9 d內略有波動，但整體變化不明顯。

2. 3 印楝種子粗提物對煙草PPO、POD和PAL活性的影響

噴施不同溶劑萃取的印楝種子提取物溶液后，煙葉中PPO、POD和PAL活性表現各異。不同處理的PPO活性在接種后第1 d無明顯差異;接種后第3 d，甲醇提取物處理的PPO活性達峰值，為對照的11.75倍，活性增加明顯，其次為乙酸乙酯提取物處理，PPO活性也較對照明顯增加，而石油醚提取物處理的PPO活性略高于對照;接種后第5～11 d，不同處理的PPO活性變化趨勢不同，但整體上以甲醇提取物的PPO活性相對較高。不同處理的POD活性整體上呈先升高后降低再升高的變化趨勢，其中甲醇提取物的POD活性在接種后第3 d達峰值，為對照的2.98倍，且明顯高于其他處理;接種后第7～11 d也以甲醇提取物處理的POD活性整體較高。不同處理的PAL活性在接種后第1～11 d整體上呈升高—降低—升高—降低的變化趨勢，各處理均在接種后第3 d達峰值，但同一接種時間下不同處理間無明顯差異。綜上所述，以甲醇提取物對煙草PPO和POD活性的提升效果較優。

2. 4 印楝種子甲醇提取物不同流分對煙草總酚含量的影響

酚類化合物是許多植物體本身的固有成分，也是植物的次生代謝產物，在植物的抗病機制中發揮重要作用。通過測定印楝種子甲醇提取物各流分對煙葉總酚含量的影響，發現3組流分處理均可使煙葉總酚含量提高，均呈先升高后降低再升高的變化趨勢。如圖3所示，氯仿∶丙酮（95∶5）處理后2 h總酚含量達峰值（44.70 mg/gFW），為對照的2.63倍;氯仿∶丙酮（1∶1）處理后96 h總酚含量達峰值（123.77 mg/gFW），為對照的4.13倍;丙酮流分處理后第6和96 h煙葉總酚含量出現兩個高峰（81.15和90.45 mg/gFW），分別為對照的2.52和3.34倍。

2. 5 印楝種子甲醇提取物不同流分對煙草炭疽病抗性的影響

印楝種子甲醇提取物不同流分對煙草炭疽病抗性的測定結果（表3）表明，3個處理的病情指數排序為丙酮<氯仿：丙酮（1：1）<氯仿：丙酮（95：5），抗性均顯著高于對照，尤其以丙酮流分處理的誘導抗性能力最強。

3 討論

本研究采用印楝種子粉末進行煙苗根施處理，發現其可降低煙草炭疽病病情指數;進一步采用柱層析分離法，確定印楝種子粗提物誘導活性成分主要在印楝種子甲醇提取物的丙酮流分中。前人已有研究表明，印楝提取物可激活植物的抗病能力。本研究中，根施印楝種子粉末使煙草炭疽病的發病指數由74.17%降至26.67%，且qRT-PCR測定結果表明，在不同時間段可明顯提高抗病基因NPR1、NtRar1、NtSGT1和PR1a的表達量，其原因可能與印楝種子粉末可誘導煙草抗病相關。進一步對印楝種子的甲醇提取物、乙酸乙酯提取物和石油醚提取物誘導煙草的PPO、POD和PAL活性進行分析，發現印楝種子提取物不同有機溶劑浸提物對誘導煙草抗炭疽菌的活性有所差異，其中對煙草PPO和POD活性提升明顯且效果最佳的是甲醇提取物。由此也可衡量不同溶劑的提取效果，以便于誘導活性物質的分離、提純及檢測，同時為下一步研究打下基礎。鑒于印楝種子甲醇提取物良好的酶誘導效果，對其進行柱層析粗分離，綜合煙葉總酚含量測定及對煙草炭疽病的病情指數測定，確定印楝種子甲醇提取物的丙酮流分誘導煙草抗炭疽病的效果最好。因此，推測印楝誘導活性物質可能存在于印楝種子甲醇提取物的丙酮流分段中。

誘導抗性是指由于外源生物或非生物因子的作用，激活植物自身防御體系，從而產生對病原物系統抗性的現象，其中研究較多的是系統獲得抗性（Systemic acquired resistance，SAR）和誘導系統抗性（Induced systemic resistance，ISR）。水楊酸（Salicylic acid，SA）是誘發SAR產生的關鍵信號分子之一，而茉莉酸（Jasmonic acid，JA）和乙烯是誘發ISR產生的關鍵信號分子。NPR1蛋白還原成單體及其在細胞核內的積累是誘導水楊酸介導PR基因表達和SAR表現的必要條件（張紅志和蔡新忠，2005）;NtRar1基因上調，可誘導植物體內H2O2含量升高（Ramegowda et al.，2013）;NtSGT1和PR1a分別通過激活半乳糖苷酶和葡萄糖醛酸酶誘導煙草產生抗性（Saito et al.，2014）。本研究中，NPR1、NtRar1、NtSGT1和PR1a 4個基因在處理后第1～7 d分別出現明顯上調表達趨勢，表明印楝誘導煙草抗炭疽病通過此4條通路激活植物的抗性，此階段是植株多種抗性表達的活躍時期。

在模式植物中通過基因沉默、突變體和轉基因等試驗證明，SGT1與植物的抗病基因功能表達、超敏反應和非宿主抗性有密切關系，SGT1基因沉默或突變會導致一些抗病基因介導抗性的喪失，而 SGT1基因超表達會增強植株的某些抗病能力（Austin et al.，2002;Muskett and Parker，2003）。NTF6基因是調控SAR的關鍵基因，當煙草中NTF6基因沉默表達時煙草對煙草花葉病毒和假單胞桿菌的抗性減弱。當寄主被病毒、細菌和真菌等病原菌侵染時均會激發MAP激酶產生（Wilson et al.，1995）。Yang等（2001）在發現一種NtMEK2-SIPK/WIPK級聯能控制PAL的表達，而這個基因所編碼的酶在水楊酸生物合成途徑中發揮重要作用，說明MAPK級聯參與了防御反應，且在其中控制多條反應途徑（肖文娟等，2004）。病菌侵染或激發子處理可明顯增強PAL基因的轉錄水平（Weaver and Herrmann，1997）。有些植物在病原菌侵染時能產生兩類富含脫氨酸的小分子抗菌多肽——植物防御素（Plant defensins，PDF）。PDF對許多真菌的生長有抑制作用，病原真菌Alternaria brassicicola侵染或茉莉酸甲酯處理擬南芥，能強烈誘導PDF基因的轉錄表達（Thomma et al.，1998）。控制脂肪氧化酶合成的LOX-1基因通過控制茉莉酸及其甲酯和前體物質合成而調節植物的誘導抗病性，是植物抗病性相關的抗病基因，LOX-1代謝產物可以作為抗菌或抗蟲性物質。周延清等（2012）通過對不同品種的花生抗性研究發現脂肪氧化酶基因LOX-1的表達量也可作為鑒定花生品種抗性的一項指標。本研究中，施用印楝種子粉末對煙草的NTF6、PAL、NtLox1和PDF基因的表達量增加均不明顯，表明印楝誘導煙草抗炭疽病可能不作用在此4條通路。

綜上所述，印楝誘導的煙草抗煙草炭疽病是通過水楊酸信號傳導等多個通路所完成。本研究發現印楝種子甲醇提取物的丙酮流分段可激活煙草的水楊酸信號抗病途徑，但印楝種子粉末中的誘抗化合物有待進一步分離純化。

4 結論

印楝種子提取物通過誘導提高PPO和POD抗病相關酶活性及誘導NPR1、NtRar1、NtSGT1和PR1a等抗病相關基因的表達而產生抗炭疽病作用，且誘導活性成分主要存在于甲醇提取物中。因此，印楝種子甲醇提取物丙酮流分可作為煙草炭疽病的誘抗劑推廣應用于煙草生產。

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（責任編輯 王 暉）