基于高通量測序鑒定慈姑黃化病病原

張馳 胡成慧 邱靜思 蘇燕 鄒承武

摘要：【目的】明確引致廣西平樂縣慈姑大面積黃化的主要病原物，為該病害的防治提供參考。【方法】從廣西平樂縣采集自然表現褪綠黃化癥狀的慈姑植株，分別提取其葉片和莖組織的總RNA，利用RNA-Seq高通量測序技術對其轉錄組進行測序，并對序列組裝獲得的重疊群（contigs）進行BLAST注釋，篩選出注釋為植原體16S rRNA序列的contigs，根據其序列設計引物Phy-F和Phy-R，以采集的褪綠黃化癥狀慈姑植株和無癥狀植株的葉片樣本總DNA為模板，進行PCR鑒定。【結果】對擴增獲得的長度為1.5 kb的DNA片段進行序列測定，從分子水平證實慈姑黃化病的病原為植原體（strain：AY-China）。將測序獲得的植原體16S rRNA序列與GenBank收錄的15個植原體分組代表菌株的16S rRNA序列進行比對分析并構建系統發育進化樹，發現AY-China與翠菊黃化植原體16SrI組（Aster yellows group：16SrI）聚類在同一分支，且各組代表菌株的16S rRNA序列相似性在88.3%～96.0%。進一步將AY-China與16SrI不同亞組代表菌株的16S rRNA序列進行多重比對并構建系統發育進化樹，發現AY-China與翠菊黃化植原體16SrI-B亞組聚類到在一分支，且與16SrI-B亞組代表菌株的16S rRNA序列相似性高達99.5%，說明AY-China應屬于16SrI-B亞組。【結論】廣西平樂縣慈姑黃化病病原為植原體，其隸屬于翠菊黃化植原體16SrI-B亞組。

關鍵詞： 慈姑黃化病;高通量測序;植原體;16S rRNA序列;系統進化分析

中圖分類號： S436.45;S432.44? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）03-0578-07

0 引言

【研究意義】慈姑（Sagittaria sagittifolia L.）隸屬于澤瀉科慈姑屬，為多年生水生草本植物，其球莖可食用或制作淀粉，亦可入藥（王漢榮等，2009）。近年來，隨著慈姑產業的發展，慈姑病害問題不斷出現。據報道，目前慈姑病害主要有黑粉病、葉斑病、褐斑病、斑紋病、軟腐病、葉柄基腐病、鏈孢霉紅粉病和粘菌病等（陳建明等，2016）。2017年在廣西平樂縣大面積發生一種慈姑黃化病，噴施多種殺真菌和殺細菌藥劑進行防治均無效果，根據其葉片出現黃化和斑駁癥狀，初步推測其感染病毒或植原體，但目前國內外尚無病毒或植原體引致慈姑植株黃化的報道，無確切的病原物序列信息可供參考。因此，利用新技術對慈姑未知病原物進行鑒定，對于制定有針對性的防治方案具有重要意義。【前人研究進展】測序法是鑒定病原物最準確的方法之一，將植物病害樣本的高通量測序數據與現有的微生物基因信息數據庫進行比對，可迅速鑒定出各類病原微生物。自2009年高通量測序技術應用于新病毒檢測以來，該技術在快速鑒定病原物，特別是未知病原物方面展現出巨大的優勢（Saldarelli et al.，2017）。迄今，應用高通量測序技術已成功鑒定了上百種新的植物病毒和類病毒（馬宇欣和李世訪，2016）。Rosario等（2014）通過粉虱的RNA病毒元基因組測序發現并鑒定了由粉虱傳播的香石竹潛隱病毒屬病毒（Carlavirus）;Mardi等（2015）對酸橙鬼帚病樣本和健康的酸橙樣本分別進行高通量轉錄組測序，在酸橙鬼帚病樣本中鑒定到植原體的基因表達，發現2805個差異表達基因（Differentially expressed genes，DEGs），其中上調的DEGs主要富集在細胞壁合成與降解途徑、激素生物合成途徑、信號轉導途徑、蔗糖代謝途徑、次生物質代謝途徑、氨基酸和脂類代謝途徑等，而下調的DEGs主要富集在泛素蛋白水解和氧化磷酸化途徑;Su等（2015）應用小RNA深度測序技術鑒定了檸檬樹上的啤酒花矮化病毒;辛敏（2017）對采自河南省開封市西瓜田呈現典型病毒病癥狀的樣品進行高通量測序，通過序列拼接和比對，鑒定出5種已知的西瓜病毒和3種未知RNA病毒;王慧煜等（2018）利用高通量測序技術對來源于不同邊境地區的蜱類進行宏基因組測序，并對其所攜帶的病原基因序列進行鑒定和分類;Rott等（2018）利用高通量測序技術對蘋果軟枝病的病原進行鑒定，發現蘋果軟枝病毒ARWV-1和ARWV-2。【本研究切入點】目前國內外對慈姑病毒和植原體的研究極少，單憑慈姑黃化癥狀無法確定其病原是病毒還是植原體。由于高通量測序技術用于鑒定病原物可不依賴病原物序列信息，因此本研究擬利用該技術對慈姑黃化病的樣品進行高通量測序，以期獲得其病原物的序列信息，從而鑒定該病害的病原物。【擬解決的關鍵問題】利用Illumina HiSeqTM 4000高通量測序平臺對慈姑黃化癥狀樣品進行轉錄組高通量測序，并對組裝獲得的單基因簇（unigene）進行注釋，根據注釋信息篩選出病原物信息，以明確引致廣西平樂縣慈姑大面積黃化的主要病原物，為該病害的防治提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料：自然表現褪綠黃化癥狀的慈姑植株和無癥狀慈姑植株均采自廣西桂林市平樂縣。主要試劑：植物DNA提取試劑盒及膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司;2×ES Taq Master Mix（含染料）購自康為世紀生物科技有限公司;瓊脂糖BIOWEST? Regular Agarose G-10購自Biowest公司;GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder購自Thermo公司;克隆載體pMD18-T和TRIzol試劑購自寶生物工程（大連）股份有限公司;其他試劑為國產分析純。引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 慈姑黃化病病原體檢測 取褪綠黃化癥狀的慈姑葉片和莖組織各0.1 g，分別用TRIzol法提取總RNA，經質檢符合RNA-Seq要求后，將兩個樣品的總RNA各取1.0 μg混合后進行RNA-Seq建庫，利用Illumina HiSeqTM 4000高通量測序平臺進行深度測序，然后對去除接頭（adapter）和低質量讀段（reads）的有效讀段（clean reads）進行組裝獲得unigene，分別將unigene在NR、NT、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO數據庫中進行BLAST注釋，再通過分析注釋信息篩選疑似病原體的核酸序列信息。根據RNA-Seq測序獲得的病原體序列信息設計引物，對自然表現褪綠黃化癥狀的慈姑樣品和無癥狀慈姑樣品進行PCR鑒定。PCR反應體系20 μL：cDNA模板1 μL，2×ES Taq Master Mix 10 μL，10 μmol/L的正、反向引物各1 μL，ddH2O 7 μL。擴增程序：94 ℃預變性2 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行35個循環;72 ℃延伸5 min;12 ℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物：取2 μL PCR擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，使用Syngene G：Box凝膠成像系統（英國Syngene公司）進行拍照。

1. 2. 2 PCR產物亞克隆與序列分析 PCR產物切膠回收后與pMD18-T載體進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，然后從藍白篩選培養基上挑取白色的單菌落進行PCR鑒定以獲得陽性克隆，再對陽性克隆進行序列測定。使用MEGA 6.0中的ClustalW算法，將測得的慈姑植原體16S rRNA序列與GenBank上下載的15個植原體分組（I～XV）代表菌株的16S rRNA序列進行多重序列比對，去除兩端未對齊的序列，使用最大似然法（Maximum likelihood，ML），參數默認，自助值檢驗1000次，構建系統發育進化樹。使用DNASTAR Lasergene v7.1的MegAlign模塊進行序列相似性分析。

2 結果與分析

2. 1 慈姑黃化病病株癥狀表現

感病慈姑植株葉片自頂端和邊緣開始表現黃化癥狀，首先是葉緣和葉脈發黃，然后葉脈間的葉肉逐漸黃化，嚴重時整株黃化枯死。

2. 2 高通量測序分析結果

利用Illumina HiSeqTM 4000高通量測序平臺對采集的慈姑黃化病樣品進行轉錄組高通量測序，并對組裝獲得的unigene進行基因功能注釋，然后對所有注釋的unigene數目進行統計。結果發現，有59.66%（62696條）的unigene得到注釋。對注釋信息進行篩選，發現存在8條豐度較高的植原體基因序列，其中植原體16S rRNA序列的覆蓋度最高（76.22倍），未發現病毒序列信息（表1）。

2. 3 PCR鑒定及序列分析結果

根據獲得的植原體16S rRNA序列信息設計并合成引物（Phy-F： 5'-CCCAATACGAAGAGTTTGAT CCT-3'和Phy-R： 5'-GGATACCTTGTTACGACTTAAC C-3'，預期PCR產物大小為1504 bp），經PCR檢測發現植原體檢測引物在所采集的慈姑黃化病DNA樣品中均能擴增出與預期結果相符的特異性目的片段，而在無癥狀樣品中未擴增出目的片段。對擴增獲得的特異性目的片段進行克隆及序列測定，序列相似性分析結果表明，該株系與植原體16SrI組中各植原體的核苷酸序列相似性均在98.6%以上，其中與翠菊黃化植原體16SrI-B亞組（Aster yellows subgroup，16SrI-B 亞組）的小茴香黃化植原體DfY-1菌株（GenBank登錄號DQ381534）的核苷酸序列相似性最高，達99.5%;與其他16Sr組的核苷酸序列相似性在88.3%～96.0% （表2）。因此，黃化慈姑植株中存在的植原體屬于翠菊黃化植原體16SrI-B亞組。將此植原體暫命名為慈姑黃化植原體中國分離物（Strain：AY-China;GenBank Accession No. MH428835.1）。

2. 4 慈姑黃化植原體16S rRNA序列系統進化地位分析結果

根據AY-China和GenBank中15個植原體分組代表菌株的16S rRNA序列相似性構建系統發育進化樹，發現16個分離物形成兩大分支，其中16SrV、16SrVI、16SrVII、16SrVIII、16SrIV、16SrIX、16SrXI、16SrXIV、16SrIII、16SrII和16SrXV組的分離物聚到一起，而16SrX、16SrXIII、16SrXII、16SrI和Arrowhead yellows形成另一分支。再選取16SrI中各亞組的代表菌株與AY-China構建系統發育進化樹，結果發現AY-China與小茴香黃化植原體（Dogfennel yellows，DfY-1菌株）的關系最近，且二者的16S rRNA序列相似性達99.5%，說明AY-China屬于16SrI-B亞組。

3 討論

3. 1 應用高通量測序鑒定未知病原物的優勢

傳統的病原鑒定主要通過病害典型癥狀對其可能的病原物種類進行初步鑒定，再結合生物學接種、血清學、電鏡或PCR等技術進行進一步鑒定。高通量測序技術的出現為病原物檢測提供了新途徑，將高通量測序結果與微生物基因信息數據庫進行比對，不僅可迅速鑒定出各類病原微生物，還能通過未知序列鑒定新的物種（潘嵩等，2014）。利用該技術可一次性檢測獲得樣品中可能感染的多種病原物信息，特別適合于鑒定多種不同病原物混合侵染的樣品。目前，該技術在動植物病原微生物鑒定中已得到廣泛應用（李洋和蘇曉紅，2016;馬宇欣和李世訪，2016;曹毅等，2017）。此外，高通量測序技術相對于第一代Sanger測序技術具有通量高、單堿基測序成本低和靈敏度高等優勢。同時，深度測序可檢測復雜樣品中非常低豐度的成員，極大提高復合樣品中檢疫性病原物的檢出率（潘嵩等，2014）。

3. 2 慈姑黃化植原體的防治建議

目前植原體分類體系主要分為15個組和若干個亞組，并且已公布23種植原體的基因組全序列，包括玉米叢矮植原體（Maize bushy stunt phytoplasma）（Bedendo et al.，1997）、翠菊黃化植原體（Aster yellows phytoplasma）（Bai et al.，2006）、蘋果叢生植原體（Candidatus Phytoplasma mali）（Kube et al.，2008）、洋蔥黃化植原體（Onion yellows phytoplasma）（Ishii et al.，2009）、蕓香植原體（‘Brassica napus’ Phytoplasma）（Petrzik et al.，2011）、澳大利亞植原體候選種（Candidatus Phytoplasma australiense）（Andersen et al.，2013）、花生叢枝病植原體（Peanut witches’-broom phytoplasma）（Chung et al.，2013）和小麥藍矮植原體（Wheat blue dwarf phytoplasma）（Chen et al.，2014）等。由于國際間的種苗調運和農產品貿易等增加了植原體傳播的風險，該病害對農林業生產造成的損失日益加重，在我國已有14種植原體被列為入境檢疫性有害生物（牟海青等，2011）。植原體主要定殖于植物韌皮部篩管細胞中，可通過葉蟬、飛虱、木虱、蝽和蚜蟲等刺吸式口器昆蟲傳播，引起多種重要作物病害（牟海青等，2011;王真輝等，2013;楊毅等，2014;魏振等，2018）。因此，根據植原體病害主要依靠昆蟲介體等途徑傳播這一特性，可通過阻斷傳播途徑進行防治。此外，植原體是柔膜菌綱病原體，無細胞壁，只有3層膜包被，對青霉素等一般殺細菌抗生素不敏感，目前主要使用四環素類抗生素（金霉素、土霉素和脫甲基氯四環素）及IBA等生長素類物質進行防治，效果較明顯（劉仲健和羅煥亮，1999）。再者，慈姑主要采用球莖或頂芽進行無性繁殖，一旦感染植原體就會代代相傳。因此，預防慈姑黃化病應采用種植健康種苗和防蟲治蟲的大田綜合防治方案。

3. 3 慈姑黃化植原體的傳播介體

篩選確定傳播植原體的介體昆蟲有利于其病害的綜合防控和治理。本研究在進行田間病害調查時發現有黃化癥狀的慈姑假莖上出現大量蚜蟲，推測蚜蟲是傳播該病害的介體昆蟲。目前對于蚜蟲是否能傳播植原體仍存在很大爭議（王真輝等，2013），因為通過檢測昆蟲體內是否含有植原體DNA不能作為判斷昆蟲為植原體傳播介體的依據，必須確定植原體能克服昆蟲腸道和唾液腺的障礙，定殖并隨昆蟲的取食而將植原體傳播到寄主植物上，才能確認該昆蟲為介體（盧恒宇，2016）。此外，侵染慈姑導致黃化病的植原體是否具有遺傳多樣性以及是否存在其他傳播介體，均需要進一步探究。

4 結論

本研究在利用轉錄組高通量測序技術獲取病原物序列信息的基礎上設計引物，通過PCR和克隆測序快速鑒定引起慈姑黃化病的病原為慈姑黃化植原體中國分離物（Strain：AY-China;GenBank Accession No. MH428835.1），經與GenBank收錄的15個分組植原體代表種構建系統發育進化樹，明確慈姑植原體AY-China的分類地位為翠菊黃化植原體16SrI-B亞組。

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（責任編輯 麻小燕）