不同品種桑樹根際土壤細菌多樣性的高通量測序分析

邱潔 侯怡鈴 徐麗麗 錢葉 丁祥

摘要：【目的】探究不同品種桑樹根際土壤細菌群落結構及其分布規律，為促進桑樹的生長發育、提高其經濟利用價值和培育更高品質的桑樹品種提供參考。【方法】對3個品種桑樹（粵椹大10、嘉陵30號和紅果1號）根際土壤細菌的16S rDNA序列V3～V5高變區進行PCR擴增，并對PCR擴增產物進行高通量測序，分析土壤中細菌群落多樣性及分布規律。【結果】3個土壤樣品中共檢測出細菌26門76綱88目149科370屬。不同品種桑樹根際土壤樣品中的細菌群落組成和結構存在一定差異，豐富度方面表現為嘉陵30號>粵椹大10>紅果1號;多樣性方面表現為紅果1號>嘉陵30號>粵椹大10。3個品種桑樹的根際土壤細菌在門綱目科屬水平上的優勢菌群及所占比例分別為變形菌門（Proteobacteria，37.2%）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria，24.3%）、擬桿菌目（Bacteroidales，24.3%）、擬桿菌科（Bacteroidaceae，14.2%）、擬桿菌屬（Bacteroides，14.2%）;隨著分類的細化，不同桑樹品種對土壤細菌群落組成和分布的影響越大。【結論】變形菌門在3種桑樹根際土壤中均是最優勢細菌類群，嘉陵30號桑樹品種根際土壤細菌種類最多，紅果1號桑樹品種土壤細菌分布最均勻。根際土壤細菌群落種類和均勻度可作為桑樹差異規模化種植的指標。

關鍵詞： 桑樹;根際土壤;細菌;多樣性;高通量測序

中圖分類號： S888.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?   文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）03-0585-08

0 引言

【研究意義】土壤細菌是土壤生態系統的重要組成成分，參與養分元素循環、有機質分解及能量轉換，在保持生態系統的功能、穩定性及生產力等方面均發揮關鍵作用，是衡量土壤生產力和質量的重要指標（王衛霞等，2013;馮丹妮等，2014;張文元等，2015;尹玉玲等，2017）。在土地覆被過程中，土壤特性、氣候因子和植被群落等均會影響土壤的細菌群落（Li et al.，2014;Tkacz and Poole，2015）。土壤有機質含量與細菌群落組成和結構間一般具有很好的線性關系（王傳杰等，2018）。土壤細菌不僅推動了土壤的物質循環和生化反應（劉銀銀等，2013），土壤細菌群落的變化還會影響土壤養分的轉化和吸收，從而影響植物生長代謝（孫波等，2017）。不同植物類型根系分泌物和凋落物的質量又反作用于土壤細菌群落的生長發育，造成某些細菌群落的出現或消亡（陳心想等，2014;潘彥碩等，2018;王美溪等，2018）。桑（Morus alba L.）為桑科桑屬植物，其葉是家蠶重要的飼料，是蠶絲產業發展的必須物質基礎（Jia et al.，2014;向仲懷等，2017），因此，了解桑樹根標土壤細菌組成多樣性對保障桑葉生產和促進蠶絲產業發展均具有重要意義。【前人研究進展】Carvalhais等（2013）通過擬南芥在無菌土壤和非無菌土壤中生長對比試驗，證明擬南芥在整個細菌群落存在條件下比細菌貧乏時表現出更強的生長力。Muehe等（2015）通過對鼠耳芥根際細菌組成與植物對鎘和鋅的吸收研究，證明土壤細菌可直接或間接影響植物對金屬元素的吸收。崔佩佩等（2018）采用Biolog微平板法研究不同施肥條件下高粱根際土壤細菌功能多樣性的變化，結果證明施肥能改善土壤細菌的功能多樣性。蔣景龍等（2018）采用Illumina MiSeq高通量測序技術對西洋參根腐病病株和健株根際土壤細菌的組成及多樣性變化進行研究，結果顯示鞘脂菌屬（Sphingobium）和紅游動菌屬（Rhodoplanes）可能是引起西洋參根腐病的重要菌群。對于桑樹根際土壤細菌的研究，目前主要采用傳統方法探究不同施肥方案、作物間作等對根際土壤細菌種類變化、重金屬含量、酶活性差異的影響（楊統一等，2015;張萌萌等，2015）。鄧文等（2016）采用Biolog微生態技術研究偏施氮肥桑樹根際土壤細菌對碳源利用的能力變化，證明4年偏施氮肥桑樹根際土壤細菌多樣性及活性均高于其他方法處理的土壤。樊芳玲等（2016）利用磷脂脂肪酸（PLFA）法分析不同模式的坡耕地—桑樹系統對旱坡地紫色土壤中細菌群落的影響，證明種植桑樹能顯著提高土壤中PLFA含量，改善細菌群落結構。【本研究切入點】高通量測序技術能產生測序覆蓋深度更高的基因數據，在細菌群落組成研究中能真實地揭示環境中細菌群落的多樣性和復雜性。目前針對不同品種桑樹根際土壤細菌多樣性的高通量測序分析研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】對不同品種桑樹根際土壤細菌的16S rDNA序列V3～V5高變區進行PCR擴增，并對PCR擴增產物進行高通量測序，分析土壤中細菌群落多樣性及分布規律，了解不同品種桑樹根際土壤細菌的群落結構、物種組成和差異，探究根際土壤細菌與桑樹的相互關系，為促進桑樹的生長發育、提高其經濟利用價值及培育出更高品質的桑樹品種提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

土壤樣品采自四川省農業科學院蠶業研究所瀠溪桑園，分別以粵椹大10（廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所選育）、嘉陵30號和紅果1號（四川省農業科學院蠶業研究所選育）3種果桑根際土壤作為采樣區，隨機在每個采樣區設4個采樣點，每個采樣點采集10份土壤樣品（0～10 cm），使用S形采樣法，剔除石塊和植物根系，混合均勻并過2 mm篩，以四分法篩取所得土樣為同一樣品，再裝入已滅菌的采樣袋，分別編號為LCF20、LCF21和LCF22，于冰盒中保存。

1. 2 總DNA提取、16S rDNA序列擴增及高通量測序

根據Fast DNA SPIN Kit for Soil（MP Biomedical，USA）的使用說明，加入溶菌酶（上海源葉生物科技有限公司）60 mg/mL輔助提取土壤細菌的總DNA。用1%瓊脂糖凝膠對總DNA進行電泳檢測，電泳條件為120 V、45 min，總DNA條帶單一清晰，無嚴重拖尾現象，可用于后續體外擴增。用引物515F/907R擴增細菌16S rDNA序列的V3～V5區域。反應體系25.0 μL：Dream Taq PCR Master Mix（2×）12.5 μL，DNA模板1.0 μL，515F/907R引物各0.5 μL，去離子水補足至25.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行10個循環，每個循環降低0.5 ℃;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行25個循環;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，將單一清晰沒有拖尾現象條帶對應的樣本送至北京金諾銳杰基因科技有限公司測序，并采用MiSeq測序儀完成測序工作（Lu et al.，2015;Navarrete et al.，2015;Lossius et al.，2016）。

1. 3 高通量測序數據處理

原始數據經過低質量過濾、去接頭等后得到高質量的基因序列Reads，然后合并正反向Reads，獲得16S rDNA序列V3～V5區擴增子。利用Flash 8.0合并正方向Reads，合并后序列輸出，并使用FastQC進行質控分析。采用Usearch61檢查嵌合體，De novo方式去除嵌合體序列，再對小片段文庫進行組裝，獲得該物種的基因組序列圖譜。對所有分離的高質量樣本序列進行聚類分析，即一個OTU（同源性為97%），再劃分操作分類單元（OTUs），并構建稀釋曲線及進行聚類分析。

Chao1指數計算公式：Schao1=Sobs+n1（n1-1）/2（n2+1），其中，Schao1為估計的OUT數，Sobs為觀測到的OTU數，n1為只有一條序列的OUT數目，n2為只有兩條序列的OUT數目。

Shannon指數計算公式：H'=-∑（Pi）（lnPi），其中，Pi為此細菌個體數占總個體數比例。

相對豐度計算公式：D=（S-1）/lnN，其中，S為群落中的特定細菌總數目，N為群落中所有細菌的總數。

2 結果與分析

2. 1 不同品種桑樹根際土壤細菌多樣性分析結果

用Chao1指數表示細菌群落的豐富度，其值越高反映細菌群落物種豐富度越高，細菌種類越多。顯示3個樣品的細菌群落豐富度均隨測序深度的增加而增加，隨后逐漸趨于平緩，此時嘉陵30號的細菌群落豐富度最高，粵椹大10次之，紅果1號最低。用Shannon指數表示樣品的細菌多樣性程度，其值越高反映細菌群落的物種多樣性越高，分布也越均勻。當3個樣品的Shannon指數曲線最終趨于平緩時，紅果1號的細菌多樣性程度最高，粵椹大10最低。

2. 2 在門水平上的細菌群落豐度分析結果

從門水平來看，細菌種類最多的品種是嘉陵30號（26門），最少的是粵椹大10（24門）。變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度較高，分別為37.2%、25.4%和14.1%，在3個土壤混合樣品中3種細菌門的相對豐度之和占土壤細菌總量的76.7%。將群落相對豐度水平位于前10的細菌（相對豐度>0.4%）按照樣品和分類進行聚類后繪制熱圖，結果顯示，3個樣品中的細菌大致分為兩簇，梭桿菌門（Fusobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimona-detes）和厚壁菌門等親緣關系較近的聚為一簇，硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、綠彎菌門（Chloroflexi）和酸桿菌門（Acidobacteria）等聚為另一簇。不同品種桑樹根際土壤中細菌的相對豐度有一定差異，其中，酸桿菌門在紅果1號和嘉陵30號中的相對豐度較高，在粵椹大10中的相對豐度較低;硝化螺旋菌門和綠彎菌門在紅果1號中的相對豐度較高，在嘉陵30號和粵椹大10中的相對豐度較低。

2. 3 在綱水平上的細菌群落豐度分析結果

3個土壤樣品中的細菌在綱水平上群落組成最多的是粵椹大10和嘉陵30號（76綱），最少的是紅果1號（74綱）。α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、β-變形菌綱（Betaproteobacteria）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、擬桿菌綱（Bacteroidia）和梭狀芽胞桿菌綱（Clostridia）等5個細菌綱的相對豐度較高，分別為24.3%、16.0%、12.3%、11.2%和7.7%，在3個土壤混合樣品中5個細菌綱的相對豐度之和占土壤細菌總豐度的71.5%。將群落相對豐度水平位于前20的細菌（相對豐度>0.4%）按照樣品和分類進行聚類后繪制熱圖，結果顯示，嘉陵30號與粵椹大10細菌種類的組成相比紅果1號而言更相似;3個樣品中的細菌大致分為兩簇，α-變形菌綱和擬桿菌綱等7個綱親緣關系較的近聚為一簇，γ-變形菌綱和β-變形菌綱等13個綱聚為另一簇。

2. 4 在目水平上的細菌群落豐度分析結果

3個土壤樣品中的細菌在目水平上的群落組成分別是紅果1號88目、嘉陵30號71目和粵椹大10 78目。擬桿菌目（Bacteroidales）、腸桿菌目（Enterobacteriales）、梭菌目（Clostridiales）、酸桿菌目（Acidobacteriales）和伯克氏菌目（Burkholderiales）等5個細菌目的相對豐度較高，分別為24.3%、12.3%、10.6%、4.1%和3.8%，在3個土壤混合樣品中5個細菌目的相對豐度之和占土壤細菌總豐度的55.1%。將相對豐度位于前30的細菌（相對豐度>0.4%）按照樣品和分類進行聚類后繪制熱圖，3個樣品中的細菌大致分為兩簇，擬桿菌目和梭菌目等14個目親緣關系較近的聚為一簇，酸桿菌目和伯克氏菌目等16個目聚為另一簇。在目水平上，3個樣品中的細菌組成存在差異，如黃單胞桿菌目（Xanthomonadales）和紅螺菌目（Rhodospirales）在紅果1號中的相對豐度較高，在嘉陵30號和粵椹大10中的相對豐度較低。

2. 5 在科水平上的細菌群落豐度分析結果

3個土壤樣品中的細菌在科水平上的群落組成最多的是紅果1號（149科），嘉陵30號（116科）和粵椹大10（118科）相對較少。擬桿菌科（Bacteroidaceae，14.2%）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae，10.6%）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae，8.3%）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae，5.6%）、酸桿菌科（Acidobacteriaceae，3.2%）、毛螺菌科（Lachnospiraceae，2.6%）和韋榮氏菌科（Veillonellaceae，3.2%）等7個細菌的相對豐度較高，在3個土壤混合樣品中7個細菌科的相對豐度之和占土壤細菌總豐度的47.7%。將相對豐度位于前40的細菌（相對豐度>0.2%）按照樣品和分類進行聚類后繪制熱圖，3個樣品中的細菌大致分為兩簇，梭桿菌科（Fusobacteriaceae）和黃單胞菌科（Xanthomonadaceae）等26個科聚為一簇，瘤胃菌科和韋榮氏菌科等14個科聚為另一簇。在科水平上，隨著分類的細化，桑樹品種對細菌群落組成的影響越大。如鞘酯菌科（Sphingomonadaceae）在嘉陵30號中的相對豐度較高，在粵椹大10和紅果1號中的相對豐度較低。

2. 6 在屬水平上的細菌群落豐度分析結果

3個土壤樣品中共有細菌屬370個，其中單個樣品最多的是嘉陵30號（370屬），紅果1號（354屬）和粵椹大10（351屬）相對較少。擬桿菌屬（Bacteroides，14.2%）、普氏菌屬（Prevotella，8.3%）、棲糞桿菌屬（Faecalibacterium，3.1%）、奈瑟氏球菌屬（Neisseria，2.1%）、鏈球菌屬（Streptococcus，1.2%）、薩特氏菌屬（Sutterella，1.2%）、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium，1.1%）、不動桿菌屬（Acinetobacter，1.1%）和巨單胞菌屬（Megamonas，1.0%）等9個細菌屬相對豐度較高，在3個土壤混合樣品中9個細菌屬的相對豐度之和占土壤細菌總豐度的33.3%。將相對豐度位于前50的細菌（相對豐度>0.1%）分別按照樣品和分類進行聚類后繪制熱圖，3個樣品中的細菌大致分為兩簇，羅氏菌屬（Roseburla）和薩特氏菌屬等37個屬聚為一簇，硝化螺菌屬（Nitrospira）和黃桿菌屬（Flavobacterium）等13個屬聚為另一簇。各樣品屬級分類聚類分析結果顯示，在屬的水平上，莫拉氏菌（Kaistobacter）在嘉陵30號中的相對豐度較高，在粵椹大10和紅果1號中則相對較低;艾克曼菌屬（Akkermansia）在紅果1號中未檢測出;分枝桿菌屬（Ramlibacter）在粵椹大10中未檢測出。

3 討論

土壤作為細菌的天然培養基，含有大量且豐富的細菌種類。相比于傳統測序技術，使用高通量測序技術對土壤細菌多樣性的研究鮮見報道，且高通量測序產出的數據量是傳統測序技術無法比擬（明磊等，2018）。本研究采用高通量測序技術對3個不同品種的桑樹根際土壤細菌組成和結構進行研究，分析了3個不同品種桑樹根際土壤細菌在門、綱、目、科、屬不同分類水平上的優勢類群，共檢測出包括擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門等優勢菌門在內的26門，其中變形菌門是最豐富的細菌類群，與Constancias等（2015）、Docherty等（2015）的研究結果一致。但Heiko等（2016）發現酸桿菌門是歐洲山毛櫸和挪威云杉根際土壤中含量最豐富的細菌類群;而Kristin等（2016）在溫帶草原和森林土壤中發現放線菌門（Actinobacteria）是占主導地位的細菌類群，說明不同植物根際土壤中存在不同的優勢細菌類群。

本研究共測出包括α-變形菌綱和β-變形菌綱等優勢菌綱在內的76綱;擬桿菌目和腸桿菌目等優勢菌目在內的88目，擬桿菌科和腸桿菌科等優勢菌科在內的149科，擬桿菌屬和普氏菌屬等優勢菌屬在內的370屬。3種不同品種桑樹根際間土壤細菌在門綱目科屬水平上的優勢菌群及所占總比例分別為變形菌門（37.2%）、α-變形菌綱（24.3%）、擬桿菌目（24.3%）、擬桿菌科（14.2%）、擬桿菌屬（14.2%）。但隨著分類的細化，不同的桑樹品種對細菌群落組成和分布的影響越大，在目科屬水平上差異更明顯。如黃單胞桿菌目和紅螺菌目在紅果1號中的相對豐度較高，鞘酯菌科在嘉陵30號中的相對豐度較高，而分枝桿菌屬在粵椹大10中未檢測出。土壤細菌群落多樣性不僅與植物種類有關，還與土壤落葉層、腐殖質及理化性質有關;同時，桑樹根系的生理活動能改善土壤理化性質，使之適應土壤中細菌的生長（Tkacz et al.，2015）。實際應用中可根據桑樹品種的不同，選擇合適的栽培土壤，改善土壤理化性質并施用高效細菌肥料，以促進桑樹根際間土壤優勢細菌群落的形成，從而促進桑樹生長。

4 結論

變形菌門在供試3種桑樹品種根際土壤中均是最優勢細菌類群，嘉陵30號桑樹品種根際土壤細菌種類最多，紅果1號桑樹品種土壤細菌分布最均勻。根際土壤細菌群落種類和均勻度可作為桑樹差異規模化種植的指標。

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（責任編輯 麻小燕）