多穗柯炭疽病病原鑒定及其不同殺菌劑的室內毒力測定

宋慧云 段志豪 韋嘉怡 王軍 毛子翎 單體江

摘要：【目的】分離鑒定多穗柯炭疽病病原，并篩選出最佳防治藥劑，為多穗柯炭疽病的識別和防治提供理論依據。【方法】采用組織塊分離法分離多穗柯炭疽病病原菌，通過柯赫氏法則確定致病菌，結合形態學和分子生物學對多穗柯炭疽病病原菌進行鑒定;采用菌絲生長速率法測定8種不同殺菌劑對多穗柯炭疽病菌的室內毒力，根據供試殺菌劑的半數有效濃度（EC50）篩選出最佳的防治藥劑。【結果】引起多穗柯炭疽病的病原為暹羅炭疽菌（Colletotrichum siamense）;不同殺菌劑對多穗柯炭疽病菌菌絲生長的抑制效果存在一定差異，其中98.4%多菌靈的抑菌效果最強，所有供試濃度對多穗柯炭疽病菌的抑制率均為100.00%;其次是97%吡唑醚菌酯和98%福美雙，EC50分別為0.04和0.05 mg/mL。【結論】多穗柯為暹羅炭疽菌的新寄主。98.4%多菌靈、97%吡唑醚菌酯和98%福美雙可作為防治多穗柯炭疽病的化學殺菌劑。

關鍵詞： 多穗柯;炭疽病;病原;室內毒力測定

中圖分類號： S763.11? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）03-0593-07

0 引言

【研究意義】多穗柯（Lithocarpus polystachyus Rehd.）又名甜茶、甘茶、多穗石柯等，屬殼斗科柯屬野生常綠喬木，主要分布于廣西、湖南、江西和廣東等地（尹峰等，2017）。多穗柯是我國傳統中草藥和保健飲料植物，其茶甘甜清爽，具有消除疲勞、生津止渴的功效，現已成為許多國家新興的茶、糖、藥兼具的茶源（任子蓓等，2018;Yang et al，2018）。由于多穗柯潛在的利用價值，近年來引種多穗柯的地區和種植規模不斷擴大，其病害的發生和危害也日趨嚴重，因此，開展多穗柯病害研究，對促進其產業發展具有重要意義。【前人研究進展】目前對于多穗柯的研究多集中在化學成分、藥用價值、保健功能及苗木的繁育等方面，尚未見其病害的相關研究報道。多穗柯根皮苷常用于藥品、食品，是一種具有保健功能的甜味劑（王慧瑩，2014）。曾祥艷等（2014）研究了不同栽培密度對多穗柯幼林生長的影響，結果表明，當多穗柯幼林密度為100 cm×100 cm時，幼林的綜合生長指標達到較優水平。多穗柯中的黃酮、根皮苷等具有顯著的抗糖尿病、抗高血壓和細胞毒活性（Li et al.，2014;Lin et al.，2014）。Wang等（2014）從多穗柯中鑒定出14種新化合物，其主要成分對藤黃微球菌和枯草芽孢桿菌具有一定的抑制作用。由于多穗柯結實率較低，采用半木質化的多穗柯枝條在150 mg/L ABT 6號生根劑中浸泡1 h后插入基質（黃心土∶泥炭土=4∶1）是最佳的扦插育苗方式（陳金艷等，2016）。多穗柯幼苗具有一定的抗鎘能力，在鎘濃度為50 mg/L時可促進幼苗生長，而在濃度為250 mg/L時鎘不僅抑制幼苗的生長，對其生理及光合作用也具有顯著的抑制作用（羅文姬等，2017）。藍光和紅光對多穗柯幼苗的生長有促進作用（藍金宣等，2018）。【本研究切入點】本課題組前期調查發現，多穗柯葉片發病嚴重，疑似為炭疽病。炭疽病是危害林木的常見病害，其種類繁多，寄主廣泛，多穗柯是否為炭疽病的新寄主值得進一步研究。【擬解決的關鍵問題】采集多穗柯發病的葉片和組織，通過組織塊分離法并結合形態學和分子生物學方法分離和鑒定引起病害的病原，明確致病病原的分類地位，進一步通過室內毒力測定篩選出防治多穗柯炭疽病的有效殺菌劑，以期為多穗柯炭疽病的識別和鑒定提供理論依據，為該病害的綜合防控打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 供試植物材料 多穗柯健康葉片和疑似病葉采自廣州市天河區華南植物園。

1. 1. 2 主要試劑 供試殺菌劑共8種，分別為98.4%多菌靈、98%嘧菌酯、98%溴菌腈、96.8%苯醚甲環唑、97%吡唑醚菌酯、81%氨基寡糖素、97%嘧霉胺和98%福美雙，所有殺菌劑均為原藥，購自中國農業科學院植物保護研究所廊坊農藥廠。升汞（天津市富宇精細化工有限公司）;葡萄糖和二甲基亞砜（DMSO）（分析純，購自天津市大茂化學試劑廠）;真菌基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]。試驗所用培養基為PDA培養基，PDB培養基為未加瓊脂的PDA培養基。

1. 1. 3 主要儀器設備 BX43F生物顯微鏡[奧林巴斯（中國）有限公司];SW-CJ-2G型超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）;MLS-3870三洋高壓滅菌鍋（松下電器產業株式會社）;Exceed-C超純水機（成都唐氏康寧科技發展有限公司）;JA2003N分析天平（上海精密科學儀器有限公司）;LRH-50型生化培養箱（上海恒科科技有限公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 病害癥狀觀察和描述 通過觀察疑似炭疽病的多穗柯葉片，描述并記錄病斑的發生和危害情況，同時觀察和描述病害植株林間的生長狀態。

1. 2. 2 病原菌的分離和純化 參照席中剛等（2018）的方法分離引起多穗柯葉部病害的病原。采集新鮮的感病葉片，蒸餾水沖洗干凈后，用無菌剪刀在病健交界處剪取10塊以上、大小為3 mm×5 mm的葉片組織，先用75%酒精表面消毒20 s，用無菌水沖洗3次，再用0.1%升汞表面消毒1 min，然后用無菌水沖洗3～4次去除殘留的升汞，最后用濾紙將表面水分吸干后接種于PDA培養基上，28 ℃暗培養。純化2～3次后，即可獲得純培養的菌株。將純化后的菌株接種在PDA斜面培養基上，4 ℃保存備用。

1. 2. 3 致病性測定 參照宋慧云等（2018）的方法，利用柯赫氏法則確定其致病菌。

1. 2. 4 病原菌的鑒定 采用形態學和分子生物學相結合的方法對分離得到的病原菌進行鑒定。病原菌的形態學鑒定參照《真菌鑒定手冊》（魏景超，1979）及《植物病原真菌學》（陸家云，2001）。采用光學顯微鏡觀察并記錄病原菌的菌絲、產孢情況及孢子特征等。分子生物學鑒定參照宋慧云等（2018）的方法。首先利用真菌基因組DNA抽提試劑盒提取病原菌的基因組DNA，然后利用真菌的通用引物ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）和ITS5（5'-G GAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）進行PCR擴增、測序。將測序成功的ITS-rDNA序列提交至GenBank數據庫，獲得登錄號，經同源性比對后采用最大似然法構建系統發育樹，結合形態學的鑒定結果最終確定病原菌的分類地位。

1. 2. 5 不同殺菌劑對病原菌室內毒力測定 采用菌絲生長速率法測定不同殺菌劑對多穗柯炭疽病菌的室內毒力，供試殺菌劑濃度參照單體江等（2019）的方法。分別以30% DMSO為陰性對照、無菌水為空白對照、98.4%多菌靈為陽性對照，每處理重復3次。待空白對照的菌落生長至培養皿面積的2/3時，采用十字交叉法測得不同處理的菌落直徑，計算抑制率。

計算出不同濃度下的抑制率，以殺菌劑濃度的對數值為橫坐標、抑菌率的生物統計機率值為縱坐標，采用Excel 2010處理得到毒力回歸方程和回歸系數，計算半數有效濃度（EC50），通過SAS 9.4進行差異性分析，比較不同殺菌劑的相對抑制效果。

2 結果與分析

2. 1 病害癥狀觀察結果

該病害的林間危害癥狀，主要危害多穗柯葉片，發病葉片的葉尖或邊緣出現近圓形褐色小斑點，隨后病斑不斷擴大，不規則;病斑中心灰白色，干枯，邊緣灰褐色，壞死，病斑周圍組織黃化。后期部分葉片干枯，干枯面積達葉片的1/3～1/2，嚴重時葉片脫落。

2. 2 病原菌分離及致病性測定結果

通過組織塊分離法從多穗柯病葉的病健交界處共分離得到2株不同的菌株，分別為Lpf-L1和Lpf-L2。采用針刺回接法將Lpf-L1和Lpf-L2分別接種到離體健康的多穗柯葉片上。觀察發現，接種3 d后，Lpf-L1菌株能使多穗柯葉片表現出發病癥狀，接種部位出現深褐色壞死病斑，隨后病斑逐漸擴大，危害癥狀與自然發病癥狀類似。左側病斑上進行病原菌的分離，能分離得到與Lpf-L1相同的菌株，而接種Lpf-L2菌株的葉片未發病。結果表明Lpf-L1菌株是多穗柯病害的病原菌。

2. 3 病原菌鑒定結果

Lpf-L1菌株在PDA培養基上菌落為圓形，規則，白色，氣生菌絲發達，菌落背面中心呈淺灰色。培養7 d左右，菌落可長滿整個培養皿（d =7.5 cm）。菌絲為有隔菌絲，分生孢子長橢圓形或圓柱形，兩端鈍圓，無色，單孢，內含多個油滴，分生孢子大小平均為15.71 μm×7.50 μm。根據病原菌分生孢子、菌絲和菌落的形態特征，將該病原菌初步鑒定為炭疽病菌。

通過基因組DNA提取、PCR擴增和測序，獲得大小為603 bp的ITS-rDNA序列，GenBank登錄號為MH397500。在GenBank數據庫中進行同源性比對分析，并構建系統發育進化樹。Lpf-L1菌株與暹羅炭疽菌（Colletotrichum siamense，MH005091.1）聚在同一分支上。

結合上述形態學特征，確定引起多穗柯葉部病害的病原菌為半知菌類，炭疽菌屬（Colletotrichum sp.）真菌。

2. 4 不同殺菌劑對病原菌的室內毒力測定結果

不同殺菌劑對多穗柯炭疽病菌室內毒力測定結果見表1。從表1可看出，除81%氨基寡糖素外，其他7種供試殺菌劑對多穗柯炭疽病菌菌絲生長均表現出一定的抑制活性，但不同供試殺菌劑對炭疽病菌菌絲生長的抑制存在明顯差異。陽性對照98.4%多菌靈對多穗柯炭疽病菌的抑制效果最好，在不同供試濃度下的抑制率均為100.00%，其次是97%吡唑醚菌酯，EC50為0.04 mg/mL，98%福美雙也表現出較好的抑菌活性，EC50為0.05 mg/mL，以上三者的EC50均小于0.10 mg/mL，說明多穗柯炭疽病菌對98.4%多菌靈、97%吡唑醚菌酯和98%福美雙非常敏感;98%溴菌腈和96.8%苯醚甲環唑的EC50在0.10～1.00 mg/mL，即多穗柯炭疽病菌對98%溴菌腈和96.8%苯醚甲環唑較敏感;97%嘧霉胺和98%嘧菌酯的EC50分別為3.08和6.77 mg/mL，對多穗柯炭疽菌的抑制效果較差。綜上所述，98.4%多菌靈、97%吡唑醚菌酯和98%福美雙是防治多穗柯炭疽病菌的有效殺菌劑。

3 討論

本研究結果表明，多穗柯是炭疽病菌的新寄主，其病原為暹羅炭疽菌（C. siamense）。暹羅炭疽菌最早在泰國咖啡上被發現可引起咖啡炭疽病，是膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）復合種之一，可寄生多種熱帶和亞熱帶植物，造成葉、枝、花和果腐爛，導致嚴重的經濟損失（韓永超等，2014;蔣仕強等，2016）。最新的研究表明，暹羅炭疽菌可侵染印度水黃皮（Pongamia pinnata）的果實等（Dwarka et al.，2016）、鳶尾（Iris tectorum）（Liu et al.，2017）、臺灣荔枝（Litchi chinensis）（Ni et al.，2017）、核桃（Juglans regia L.）（Wang et al.，2017）、韓國柿樹（Diospyros kaki L. f.）（Chang et al.，2018）、阿根廷蘋果（Malus pumila）（Fernandez et al.，2018）、中國鷓鴣茶（Mallotus oblongifolius）（Liu et al.，2018）和紅心火龍果（Hylocereus polyrhizus）（Zhao et al.，2018）等。

室內毒力測定結果表明，多菌靈、福美雙和吡唑醚菌酯是有效抑制多穗柯炭疽病菌的殺菌劑。多菌靈化學性質穩定，高效低毒，對多種真菌性病害有較好的防治效果（賀君等，2016）。福美雙低毒、殺菌譜廣，廣泛應用于水果和蔬菜的病害防治（鄧之亮等，2015;馬珂，2016），但相關研究也表明福美雙會造成斑馬魚早期原始生殖細胞移動分布的延遲，誘導細胞凋亡及肉雞脛骨軟骨發育不良等（于永利等，2014;張寧等，2017），因此在病害防治中應合理使用。吡唑醚菌酯應用范圍廣，且具有內吸傳導性和耐雨水沖刷等性能，持效期較長（袁傳衛等，2015）。近年來關于暹羅炭疽菌化學防治的相關報道較少，Hu等（2015）測定了從不同水果中分離到的C. siamense孢子懸浮液對嘧菌酯的敏感性，發現其EC50在0.016～0.035 μg/mL，明顯強于本研究結果，可能與測定方法不同有關，同時嘧菌酯對孢子的抑制效果比對菌絲的抑制效果更明顯。氨基寡糖素作為植物免疫誘抗劑，是通過激發植物自身的免疫反應使其獲得系統抗性，而非直接作用于有害生物（楊普云等，2013），本研究中氨基寡糖素對多穗柯炭疽病菌菌絲生長的抑制作用最弱，可能與測定的方法不同有關。菌絲生長速率法是測定供試藥劑與真菌菌絲直接接觸時產生的抑制效果，但不同殺菌劑的作用機理不同，且作用效果還受殺菌劑的特效性及寄主的生長環境和氣候等因素影響（楊友聯等，2014），因此在后續研究中可進一步測定其在林間的藥效，同時測定殺菌劑的殘留量，從而為植物病害防治提供更加科學的依據。

4 結論

引起多穗柯炭疽病的致病菌為暹羅炭疽菌（C. siamense），多穗柯是炭疽病菌的新寄主。98.4%多菌靈、97%吡唑醚菌酯和98%福美雙對多穗柯炭疽病菌菌絲生長的抑制作用最強，可作為防治多穗柯炭疽病的化學殺菌劑。

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（責任編輯 麻小燕）