簡述桶裝水中銅綠假單胞菌的幾種檢測方法

馬慧娟 徐慧 高宏

引言

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），也稱為綠膿桿菌，屬于假單胞菌屬。廣泛分布于自然界（土壤、空氣、水源等）及正常人皮膚、腸道和呼吸道，大小為（1.5～3.0）μm×（0.5～0.8）μm，屬于非發酵革蘭氏陰性桿菌。該菌在普通培養基上生長良好，專性需氧，菌落形態不一，多數直徑在 2～3 mm，邊緣不整齊，扁平濕潤。在血瓊脂平板上形成透明溶血環。銅綠假單胞菌是一種重要的水源性致病菌，廣泛存在于各類型水中，對消毒劑、干燥、紫外線等理化因素具有很強的抵抗力，可引起急性腸道炎、腦膜炎、敗血癥和皮膚炎癥等疾病。

目前檢測銅綠假單胞菌的標準中采用的主要是傳統生化方法，包括分離培養、生化鑒定等，不能實現大批量水樣的快速檢測。近幾年，隨著科技的發展，檢測銅綠假單胞菌的方法多種多樣，本文對近年銅綠假單胞菌檢測技術進行綜述，為銅綠假單胞菌的快速、準確檢測研究技術提供參考。

銅綠假單胞菌檢測技術

國標濾膜法

檢測桶裝水中銅綠假單胞菌的方法是GB 8538-2016《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》。銅綠假單胞菌產色素分為三種：產綠膿菌素，產青膿素，產紅膿素;銅綠假單胞菌在4℃不生長而在42℃可以生長;具有氧化酶，可以使細胞色素C氧化，再由氧化型細胞色素C使對苯二胺氧化，生成有色的醌類化合物：可以產生一種脫酰胺酶，可使乙酰胺經脫酰胺作用釋放氨，滴加納氏試劑（碘化汞鉀），氨在堿性條件下與碘化汞鉀作用，生成紅色絡合物;根據這些生化特性，通過濾膜過濾將銅綠假單胞菌富集到CN瓊脂上，再用生化試劑管進行生化鑒定。也可以用VITEK 2 Compact 全自動細菌鑒定系統用于微生物鑒定，準確率高，可用于微生物實驗室的日常檢測工作。

實時熒光定量PCR檢測

外毒素 A 基因在銅綠假單胞菌中高度保守，根據 GenBank 中銅綠假單胞菌外毒素A基因片段序列，設計特異性引物及TaqMan探針，并利用實時熒光 PCR技術，對目標靶序列進行特異性擴增，建立了一套檢測食品中銅綠假單胞菌的方法，特異性試驗和靈敏性試驗良好，該檢測方法具有特異、快速的特點，能夠滿足檢測要求，為食品中銅綠假單胞菌的快速檢測奠定了基礎。

LAMP檢測

環介導等溫擴增技術（以下簡稱LAMP）：利用鏈置換DNA聚合酶在等溫條件下進行反應，40min內可完成核酸擴增，檢測過程不需要昂貴的儀器設備，簡單的水浴鍋即可，擴增產物不需要繁瑣的電泳過程，快速靈敏，特異性強，成本低，尤其適合大量、即時、現場的病原微生物的初篩，易于在基層推廣應用。

酶底物法

酶底物法（Pseudalert）采用特異性固定底物技術，目標細菌產生能夠分解 Pseudalert 底物特定的酶，產生熒光，在24 h內即可得到結果，無需進行驗證試驗，該方法能夠較好地彌補傳統濾膜法在檢測工作中的不足，在美國和歐洲部分地區已經被批準為檢驗銅綠假單胞菌的標準方法。

結論與展望

近年來瓶、桶裝水監測發現各種污染物如銅綠假單胞菌等污染問題逐漸增多，因瓶、桶裝水中污染物如銅綠假單胞菌污染引起的食物中毒也時有發生，成為公共衛生的重大隱患。國標方法作為一種傳統、經典的檢測方法，與實時熒光定量PCR方法、LAMP方法、酶底物法一起成為食品安全檢測的重要工具。傳統方法假陽性率低，但檢測周期長。隨著技術研究的不斷深入，希望核酸方法、酶底物法能夠進一步優化和完善，實現快速、特異、靈敏、高通量，可廣泛應用于食品安全檢測、檢驗檢疫、衛生防疫、疾病診斷等領域，前景非常廣闊。