高速逆流色譜法從小葉金錢草中分離制備三種黃酮苷類化合物

宋道光,樊鑫宇,徐順連,熊雯豆,段向蘭,陳 志

(青海師范大學生命科學學院,青藏高原藥用動植物資源重點實驗室,青海西寧 810008)

小葉金錢草(HydrocotylesibthorpioidesLam.)為傘形科天胡荽屬植物天胡荽[1],是中國傳統中藥之一,可全草入藥,具有抗炎、鎮痛、利膽等功效[2]。根據文獻報道可知,小葉金錢草含有黃酮類、萜類、甾醇和香豆素類等化學成分,通過柱層析分離手段,能夠分離得到黃酮苷類成分[3-4]。黃酮苷成分富含酚羥基結構,因而具有抗氧化、清除自由基等多種重要的藥理活性,進而在食品醫藥等領域應用廣泛[5-6]。截至目前,小葉金錢草只作為民間用藥,尚未被中國藥典收錄,因此對小葉金錢草黃酮苷類等化學成分及藥理活性的深入研究具有重要意義。

利用傳統及現代分離手段可實現復雜天然產物的提取和分離,如硅膠、反相硅膠(ODS)、葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20)、大孔吸附樹脂和制備性高效液相色譜等。雖然上述諸多方法可以實現許多化合物的分離,但存在所需溶劑多、分離時間長以及對填料不可逆吸附等問題。高速逆流色譜(high speed counter-current chromatography,HSCCC)依據化合物在兩相不互溶的溶劑中的分配系數不同,可以實現結構極性相似及復雜天然產物的分離[7]。本研究采用高速逆流色譜分離小葉金錢草中的三種極性較大的黃酮苷類成分,這對于進一步研究小葉金錢草的化學成分及其活性提供分離方法及思路,為以后更好地開發小葉金錢草提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小葉金錢草 購于西寧城北百信大藥房,經青海師范大學植物學陳志教授鑒定,為傘形科天胡荽屬植物天胡荽,HydrocotylesibthorpioidesLam.;葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20) 安徽博美生物科技有限公司;氯仿、正己烷、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、乙腈、甲酸(分析純),高效液相色譜所用的乙腈(色譜純) 天津市百世化工有限公司;水 二次蒸餾水。

RE.52AA旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;真空脫氣過濾裝置 美國Waters公司;KJ-11030AL型超聲波清洗器 深圳市科潔超聲科技有限公司;Waters 600高效液相色譜儀 美國Waters公司;Waters 2998 PAD二極管陣列檢測器 美國Waters公司;Waters 2707自動進樣器 美國Waters公司;HSCCC TBE-300B型高速逆流色譜儀(柱體積300 mL) 中國上海同田生化技術有限公司;N2000雙通道色譜工作站 浙江大學智達信息工程有限公司;Bruker-500 MHz NMR(AVANCE III HD)核磁共振儀 瑞士Bruker公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 小葉金錢草乙酸乙酯提取物及分離樣品的制備 將購買的小葉金錢草藥材用中藥粉碎機粉碎,過40目篩。稱取20 kg藥材粉末分次置于KJ-11030AL型超聲波清洗器中,按液料比10∶1 mL/g,加入70%(V/V)乙醇溶液,于60 ℃超聲提取1 h,過濾除去藥渣,將20 kg藥渣重復提取四次。合并提取液,旋轉蒸發得到棕褐色粘稠浸膏。浸膏用蒸餾水混懸,依次用10倍量的石油醚、乙酸乙酯萃取5次。將乙酸乙酯萃取液濃縮得到小葉金錢草乙酸乙酯萃取物,4 ℃避光保存備用。

取50 g乙酸乙酯萃取物,用50 mL甲醇溶解后用0.45 μm濾膜過濾,濾液上樣硅膠柱層析(5 cm×150 cm),然后分別用不同比例的氯仿-甲醇(50∶1、25∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶3)進行洗脫,每梯度各洗脫2柱體積,1/20柱體積為一餾分,10.0 mL/min流速洗脫。收集氯仿-甲醇1∶3洗脫液,旋轉蒸發除去溶劑,得到硅膠分離樣品。硅膠分離樣品用蒸餾水溶解,并過0.45 μm濾膜并上Sephadex LH-20柱,分別用水、10%、20%、30%、40%、50%、75%、100%甲醇洗脫,每個比例洗脫2個柱體積,1/20柱體積為一餾分,1.0 mL/min流速洗脫,收集70%甲醇洗脫組份,旋蒸除去溶劑并于-70 ℃冷凍干燥24 h,得到Sephadex LH-20分離樣品。其余甲醇洗脫餾分的化學成分另做研究。

1.2.2 高效液相色譜分析條件 色譜柱:Waters 600 SunFireTMC18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為乙腈-0.1%甲酸(15～40%乙腈,0～70 min),流速為1.0 mL/min,柱溫為25 ℃,檢測波長254 nm,進樣10 μL分析。高效液相色譜(HPLC-PAD)紫外光譜掃描范圍:200～400 nm。

取一定量乙酸乙酯萃取物、硅膠柱分離樣品和Sephadex LH-20分離樣品,分別用乙腈溶解,經0.45 μm針頭過濾器過濾后,進行HPLC分析,色譜峰面積在色譜圖中所占比例即為化合物純度。

1.2.3 高速逆流色譜溶劑系統的選擇

1.2.3.1 溶劑系統的確定 參考高速逆流色譜分離黃酮苷類化合物的相關報道選擇溶劑系統[8-9],這些溶劑系統都包含正丁醇和水,并添加其他輔助溶劑如乙酸乙酯、正己烷等。按照溶劑極性的不同,配制體積比為1∶2∶2的乙酸乙酯-正丁醇-水,1∶1∶1的正己烷-正丁醇-水和1∶1∶1∶0.1的正己烷-正丁醇-水-冰乙酸系統,考察此三個比例系統對分配系數K的影響。

1.2.3.2 正己烷-正丁醇-水系統比例的確定 按照正己烷-正丁醇-水-冰乙酸的體積比配制溶劑系統,比例依次為:1∶1∶1∶0.1、1∶1.5∶1∶0.1和1∶1.7∶1∶0.1,分別考察正己烷和正丁醇對分配系數K的影響。

1.2.3.3 K值的測定 通過高效液相色譜測定目標化合物在溶劑系統中的分配系數K。K值定義為上相中目標化合物的色譜峰面積(S上)除以下相中目標化合物的色譜峰面積(S下)(K=S上/S下)。篩選K值在0.2～5.0的溶劑系統用于高速逆流色譜。為達到好的分離效果,待分離化合物的分配系數K值應在0.2～5.0之間,且相鄰兩化合物的分離度(a=K1/K2,K1>K2)應該大于1.5[10]。

1.2.4 高速逆流色譜法分離制備小葉金錢草中的黃酮苷 按比例配制正己烷-正丁醇-水-冰乙酸(1∶1.7∶1∶0.1,V/V/V/V)兩相溶劑系統,置于分液漏斗中充分振搖后,在室溫下靜置過夜。再將上下相進行分離,并超聲脫氣20 min,上相為固定相(正己烷、正丁醇),下相為流動相(水、冰乙酸)。以20 mL/min的流速將上相泵入主機。待主機中充滿上相后,啟動主機正相旋轉按鍵FWD,調整主機轉速為800 r/min。再以2 mL/min的流速泵入超聲脫氣后的下相。待流動相流出主機后,平衡數分鐘等待基線平穩后,計算固定相保留率(Sf),計算方法為:Sf(%)=[(螺旋管體積-流出固定相體積)/螺旋管體積]×100。

開啟TBD 2000檢測系統,設置檢測波長為254 nm,采集數據。取Sephadex LH-20純化后的樣品100 mg,用20 mL上相溶解,由進樣閥上樣,記錄色譜圖,收集各分離組分。

1.2.5 化合物核磁共振波譜表征 通過對已分離化合物進行1H NMR和13C NMR譜圖的測定,將化合物1H NMR和13C NMR圖譜在MestReNova中處理,并對化學位移進行積分和偶和常數(J)的計算。J的計算方法為:(低場化學位移-高場化學位移)×核磁兆數。1H NMR二重峰、雙二重峰(分別表示為d及dd)需計算J值,單峰(s)、三重峰(t)及以上不計算J值。通過與文獻化合物報道數據進行1H NMR化學位移及J和13C NMR化學位移比對,結果一致即確定化合物結構,結構式通過ChemBioDraw 14.0畫出。

2 結果與討論

2.1 HPLC分析結果

按照1.2.2方法分析樣品:圖1(a)為小葉金錢草乙酸乙酯萃取物的HPLC色譜圖,小葉金錢草乙酸乙酯萃取物所含化學成分較為復雜,通過硅膠層析分離(圖1(b))可知,乙酸乙酯萃取物中的化學成分進一步得到富集。而經Sephadex LH-20純化后(圖1(c)),HPLC色譜峰較少,有利于分配系數摸索及溶劑系統的優化選擇。由圖1(c)可知,峰1的保留時間為19.331 min,峰2的保留時間為24.427 min,峰3的保留時間為31.683 min。圖1(d)、圖1(e)和圖1(f)分別為峰1、峰2和峰3的紫外光譜,色譜峰在峰帶I:300～400 nm及峰帶II:220～280 nm有明顯紫外吸收,符合黃酮類化合物紫外光譜吸收特征,即峰1、峰2和峰3為黃酮類化合物[12]。通過HPLC對目標組份進行分析,三種化合物均實現了較好的基線分離。

圖1 小葉金錢草乙酸乙酯部位(a)、硅膠洗脫組份(b)、 Sephadex LH-20純化(c)的高效液 相色譜圖及峰1(d)、峰2(e)、峰3(f)的紫外光譜Fig.1 HPLC chromatogram of the EtOAc-soluble fractions(a),silica gel eluted fraction(b)and Sephadex LH-20 eluted fraction(c)of Hydrocotyle sibthorpioides Lam. and UV spectrum of peak1(d),2(e)and 3(f)

2.2 HSCCC溶劑系統的優化

通過HSCCC分離天然產物,下列條件非常重要:兩相溶劑系統的分配系數適中,即待分離化合物的分配系數位于0.2～5.0之間;兩相溶劑分層時間短(一般小于30 s);固定相有較高的保留率。具備上述條件的溶劑系統方能實現好的分離效果[10]。

2.2.1 溶劑系統的確定 HPLC分析得知,分離化合物的極性較大,根據黃酮類化合物的結構特點和文獻報道[8-9],本研究選擇了HSCCC適合分離大極性物質的正丁醇體系,經HPLC測定了化合物在不同體系中的分配系數,各溶劑體系及相應分配系數K值見表1。

表1 小葉金錢草提取物在不同溶劑體系中的分配系數KTable 1 Partition coefficients(K)of the extract of Hydrocotyle sibthorpioides Lam.in different two phase solvent systems

在初步的試驗當中,目標化合物易溶于乙酸乙酯、正丁醇和水。從表1的數據可以看出,不選用乙酸乙酯系統的原因如下:1號和2號溶劑系統乙酸乙酯-正丁醇-水(1∶2∶1、1∶4∶2,V/V/V)分配系數過大,所需分離時間較長;由1.2.3.3可知化合物分離度需大于1.5,而2、3號化合物分離度小于1.5;雖然減小乙酸乙酯的比例可以改善分離度,但乙酸乙酯系統兩相分層時間較長,且分離度仍小于正己烷體系。因此1、2、3號溶劑系統不適合作為高速逆流色譜溶劑系統。當用正己烷替換系統中乙酸乙酯后,分配系數大大減小而分離度大大增加。

在正己烷體系當中,物質的分離度較大,但分配系數較小,通過增加正丁醇的比例,可以有效地增加分配系數,與此同時分離度雖有所減小,但仍大于2。Chen T等[11]報道了在溶劑體系當中添加酸可以改善物質的分離程度,因此在4號系統中添加冰乙酸來改善物質的分離,進一步探索正己烷-正丁醇-水-冰乙酸溶劑比例。

2.2.2 正己烷-正丁醇-水-冰乙酸比例的確定 由表1中(3、4號)可以發現,添加冰乙酸雖然對目標物的分離度幾乎沒有影響,但卻有效地增加了目標化合物的分配系數。由表2可以看出,當增加正丁醇比例時,分配系數增加,分離度減小。在表2的2號溶劑比例下,3號化合物分配系數達到3。因分配系數越大,所需分離時間越長,色譜峰拖尾嚴重,所需流動相越多,因此繼續增加正丁醇比例意義不大。綜上所述,通過調節正丁醇的比例,并添加冰乙酸輔助調節分配系數,能夠在保證物質的最大分離度的前提下,盡可能地縮短分離時間,節約溶劑,最終選擇正己烷-正丁醇-水-冰乙酸(1∶1.7∶1∶0.1,V/V/V/V)兩相溶劑系統分離目標化合物。

表2 小葉金錢草提取物在正己烷-正丁醇-水-冰乙酸溶劑體系中的分配系數 KTable 2 Partition coefficients(K)of the extract of Hydrocotyle sibthorpioides Lam. in n-hexane/n-BuOH/water/glacial acetic acidsolvent systems

2.3 HSCCC分離結果

采用溶劑系統正己烷-正丁醇-水-冰乙酸(1∶1.7∶1∶0.1,V/V/V/V),參照1.2.4中固定相保留率計算方法,Sf=[(300-112)]/300×100%=62.7%。按照1.2.4 的方法對1.2.1中得到的Sephadex LH-20純化樣品進行高速逆流色譜分離,得到4個分離組分,見圖2。

圖2 小葉金錢草乙酸Sephadex LH-20 分離樣品的高速逆流色譜圖Fig.2 HSCCC chromatogram of the Sephadex LH-20 purified sample from EtOAc-soluble fractions of Hydrocotyle sibthorpioides Lam.

收集圖2中的各組分進行HPLC分析。峰Ⅱ-Ⅳ樣品HPLC分析結果見圖3,其中峰Ⅱ圖3(a)、Ⅲ圖3(b)、Ⅳ圖3(c)為目標化合物,分別對應圖1(c)中的1、2和3號化合物。保留時間和純度分別為:峰Ⅱ-1號,Rt=19.331 min,94.08%;峰Ⅲ-2號,Rt=24.427 min,97.82%;峰Ⅳ-3號,Rt=31.4683 min,92.98%。各色譜圖中小圖對應各色譜峰的紫外吸收光譜,由紫外光譜分析得知,色譜峰紫外吸收在峰帶Ⅰ,300～400 nm及峰帶Ⅱ,220～280 nm有明顯紫外吸收,符合黃酮類化合物紫外光譜吸收特征[12],故所分離得到的三種化合物為黃酮類化合物。

圖3 峰Ⅱ(a)、Ⅲ(b)、Ⅳ(c)組分的 HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of effluent fraction Ⅱ(a),Ⅲ(b)and Ⅳ(c)

2.4 結構表征

所分離得到化合物冷凍干燥后稱重得峰Ⅱ(1號)化合物9.23 mg,峰Ⅱ(2號)化合物8.98 mg和峰Ⅲ(3號)化合物22.93 mg。經1H NMR和13C NMR鑒定為峰II:楊梅素 3,3′-二-α-L-鼠李糖苷(化合物1)、峰Ⅲ:木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(化合物2)和峰Ⅳ:芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(化合物3),其結構式見圖4。

圖4 楊梅素 3,3′-二-α-L-鼠李糖苷(化合物1)、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷

化合物1的1H NMR和13C NMR數據如下:1H NMR(DMSO-d6,500 MHz,ppm):δ 12.64(1H,s,5-OH),10.91(1H,s,7-OH),9.53(1H,s,5′-OH),9.19(1H,s,4′-OH),7.11(1H,d,J=1.9 Hz,2′-H),7.10(1H,d,J=1.9 Hz,6′-H),6.37(1H,d,J=1.9 Hz,8-H),6.21(1H,d,J=1.9 Hz,6-H),5.23(1H,s,3-rha-1-H),5.21(1H,s,3′-rha-1-H),3.49～3.96(4H,m,3-rha-2,3,4,5),3.13～3.96(4H,m,3′-rha-2,3,4,5),1.17(3H,d,J=6.2 Hz,3′-rha-CH3),0.83(3H,d,J=6.2 Hz,3-rha-CH3);13C-NMR(DMSO-d6,125 MHz,ppm):δ 178.3(C-4),164.9(C-7),161.8(C-5),157.9(C-9),156.9(C-2),146.5(C-3′),145.4(C-5′),111.6(C-2′),139.4(C-4′),134.7(C-3),120.1(C-1′),110.7(C-6′),104.6(C-10),102.3(C-1″),101.1(C-1?),99.2(C-6),94.0(C-8),72.4(C-4″),71.7(C-4?),71.1(C-3″),70.9(C-2″),70.9(C-3?),70.8(C-2″),70.6(C-2?),70.4(C-5″),70.0(C-5?),18.4(C-6?),17.9(C-6″)。根據已報道文獻比對[13],化合物1為楊梅素 3,3′-二-α-L-鼠李糖苷(Myricetin 3,3 ′-di-α-L-rhamnopyranoside)。

化合物2的1H NMR和13C NMR數據如下:1H NMR(DMSO-d6,500 MHz,ppm):δ 13.00(1H,s,5-OH),9.99(1H,brs,4′-OH),9.44(1H,brs,3′-OH),7.45(1H,dd,J=2.1 Hz,8.4 Hz,6′-H),7.43(1H,d,J=2.1 Hz,2′-H),6.91(1H,d,J=8.25 Hz,5′-H),6.81(1H,d,J=2.0 Hz,8-H),6.76(1H,s,3-H),6.46(1H,d,J=2.0 Hz,6-H),5.27(1H,d,J=7.3 Hz,glc-1),3.08～4.02(4H,m,Glu A-2,3,4,5);13C-NMR(DMSO-d6,125 MHz,ppm):δ 182.4(C-4),170.8(C-6″),164.9(C-2),163.0(C-7),161.6(C-5),157.4(C-9),150.4(C-3′),146.3(C-4′),121.8(C-1′),119.6(C-6′),116.5(C-5′),114.0(C-2′),105.9(C-10),103.6(C-3),99.9(C-1″),99.7(C-6),95.0(C-8),76.2(C-5″),75.7(C-3″),73.3(C-2″),71.8(C-4″);根據已報道文獻比對[14],化合物2為木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(Luteolin 7-O-β-D-glucuronide)。

化合物3的1H NMR和13C NMR數據如下:1H NMR(DMSO-d6,500 MHz,ppm):δ 12.98(1H,s,5-OH),10.47(1H,brs,4′-OH),7.95(2H,d,J=8.5 Hz,2′,6′-H),6.95(2H,d,J=8.5 Hz,3′,5′-H),6.86(1H,s,3-H),6.86(1H,d,J=1.7 Hz,8-H),6.46(1H,d,J=1.7 Hz,6-H),5.25(1H,d,J=7.3 Hz,Glu A-1),3.29～3.99(4H,m,glc-2,3,4,5);13C-NMR(DMSO-d6,125 MHz,ppm):δ 182.4(C-4),171.1(C-6″),164.8(C-2),163.1(C-7),161.9(C-5),161.6(C-4′),157.4(C-9),129.1(C-2′,6′),121.4(C-1′),116.5(C-3′,5′),105.9(C-10),103.3(C-3),99.8(C-6),99.7(C-1″),95.1(C-8),76.3(C-5″),75.6(C-3″),73.3(C-2″),71.9(C-4″);根據已報道文獻比對[15],化合物3為芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(Apigenin 7-O-β-D-glucuronide)。

3 結論

本文建立了從小葉金錢草分離純化極性較大黃酮苷類化合物的HSCCC分離方法,應用高速逆流色譜法正己烷-正丁醇-水-冰乙酸(1∶1.7∶1∶0.1,v/v/v/v)兩相溶劑系統,在轉速800 r/min、流速2 mL/min的條件下,從小葉金錢草中分離制備了三種黃酮苷類化合物:楊梅素3,3′-二-α-L-鼠李糖苷,木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷,純度均高于90%,為進一步研究小葉金錢草的化學成分、藥效以及綜合利用奠定了一定的理論基礎。