基于化合物與蛋白互作分析根皮苷的降糖機制

冉軍艦,雷 爽,阮曉莉,梁新紅,焦凌霞,趙瑞香

(河南科技學院食品學院,河南省高校重點實驗室培育基地, 新鄉市農產品加工工程技術研究中心,河南新鄉 453003)

糖尿病是一類慢性非傳染性疾病,目前全球患糖尿病的人數已經達到3.46億,而且有上升的趨勢,糖尿病是由于胰島素分泌不足或胰島素抵抗導致血糖升高的一類疾病,引起機體糖代謝紊亂,進而會導致神經病變、心血管病變、腎功能衰竭、視網膜病變等各類并發癥,死亡率較高[1]。目前糖尿病治療主要以西藥為主[2],但其存在著嚴重的副作用,因此尋找天然有機功能因子替代當前藥物治療具有重要的現實意義。

根皮苷是蘋果中的特征酚類物質,在不同蘋果品種或者蘋果不同生長時期中差異較大[3],根皮苷對蘋果的風味和色澤有重要的作用[4]。另外根皮苷在蘋果多酚中具有顯著的功能活性,已經證明根皮苷具有調節血壓、降低血糖、清除體內自由基、保護心臟、預防和治療糖尿病等作用[5-7]。也有研究表明,根皮苷可以作為糖類運輸的競爭性抑制劑,從而降低人體對蔗糖、3-O-甲基葡萄糖、葡萄糖的攝取量[8],抑制糖尿病的發生。

蛋白互作網絡(Protein interaction network,PIN)在蛋白功能之間相關性、化合物與蛋白互作關系、蛋白與疾病相關性等方面有重要的作用[9],作為系統網絡生物學重要研究內容,其中的蛋白及其相互作用是細胞組織和功能的基礎,起到調控機體健康和疾病狀態的作用[10]。本研究以蘋果中根皮苷為研究對象,通過數據分析確定其作用靶點,利用靶點相關信息構建蛋白互作網絡,對其進行模塊分析及功能注釋,從分子網絡水平系統探討根皮苷的降糖機制,為根皮苷治療糖尿病的研究提供科學依據。

1 實驗方法

1.1 根皮苷對應靶點信息的篩選

選取蘋果中的特征酚根皮苷對其進行成分靶點的數據挖掘。根皮苷作用的靶點有兩個來源:一個是化合物-蛋白相互作用數據庫STITCH(http://stitch.embl.de/),另一個是歐洲生物信息研究所(European Bioinformatic Institute,EBI)提供的靶點生物活性數據平臺ChEMBL(http://www.ebi.ac.uk/chembl/)(截至2018年11月)。為了保證數據的可靠性,在STITCH 數據庫選擇匹配值大于0.7的化合物對應的靶點作為研究對象。這兩個數據庫能夠顯示已知蛋白和化學物之間的親緣關系,并能過濾網絡數據只顯示與選定組織相關的蛋白。本文通過數據庫篩選去除重復的靶點。

1.2 根皮苷蛋白互作網絡的構建與分析

本研究選取的根皮苷靶點蛋白相互作用(Protein-protein interaction networks,PPI)信息來源于String數據庫(http://www.string-db.org/)。String數據庫收集整合表達蛋白和細胞功能相關信息,預測蛋白與蛋白之間相互作用,包括物理交互作用和功能交互作用,這些預測信息從系統共表達分析、跨基因組共享選擇性信號檢測、文獻自動化文本挖掘和基于基因的生物相互作用的計算轉移等途徑獲得。所以數據庫會對每一組數據進行打分,本研究選取分值高于0.7的高置信度的數據,以確保數據的可靠性。將得到的蛋白質相互作用數據導入Cytoscape 3.7.0,利用Advance Network Merge[11]插件去除重復邊和自環邊,取最大連通子圖作為根皮苷的蛋白互作網絡。Cytoscape是一個廣泛應用的生物信息學軟件,用于生物網絡可視化和數據集成,每個節點(node)是基因、分子或者蛋白質,節點之間的線(edge)是分子之間的相互作用。

1.3 網絡模塊篩選與分析

蛋白質通常不能單獨表現生物過程和分子功能,而是通過相互作用形成功能模塊,實現其生物及生理功能。MCODE[12]是分子復合物檢驗算法,能夠快速聚類并對模塊中蛋白的關聯程度打分。因此,本研究采用MCODE算法對構建的蛋白互作網絡進行模塊分析,默認參數(Degree Cutoff:2,Node Score Cutoff:0.2,K-Core:2,Max. Depth:100)作為網絡模塊的截止標準。然后利用Biological Networks Gene Ontology tool(BinGO)插件[13]對識別出的模塊進行GO富集分析,蛋白的基因本位和GO注釋信息均來自Gene ontology數據庫(http://www. geneontology. org/)。

2 結果與分析

2.1 根皮苷對應靶點信息

按照1.1的方法篩選獲得21個根皮苷的作用靶點基因信息,靶點信息在表1中列出。在獲得的靶點中,SLC5A2(鈉離子葡萄糖聯合轉運子家族5/成員2)、SLC5A1(鈉離子葡萄糖聯合轉運子家族5/成員1)、SLC5A11(鈉離子葡萄糖聯合轉運子家族5/成員11)、SLC5A4(鈉離子葡萄糖聯合轉運子家族5/成員4)、SLC2A2(鈉離子葡萄糖聯合轉運子家族2/成員2)、SLC29A1(鈉離子葡萄糖聯合轉運子家族29/成員1)、SLC28A1(鈉離子葡萄糖聯合轉運子家族28/成員1)、SLC28A2(鈉離子葡萄糖聯合轉運子家族28/成員2)、SLC28A3(鈉離子葡萄糖聯合轉運子家族28/成員3)是葡萄糖吸收與水分吸收過程中重要節點;LCT(乳糖酶)主要與小腸內乳糖分解有關;BCHE(膽堿酯酶)主要與乙酰膽堿水解有關,糖尿病患者膽堿酯酶顯著增高。由此推斷,根皮苷可能通過參與葡萄糖與水的吸收過程、乳糖的分解過程發揮降糖作用。

表1 根皮苷靶點信息Table 1 The targets information of phloridzin

2.2 根皮苷與蛋白互作網絡的構建

將篩選的21個靶點信息輸入STRING下載所有相關基因導入Cytoscape軟件,構建蛋白互作網絡,結果如圖1所示,該網絡包含170個節點和545條邊。

圖1 根皮苷的蛋白互作網絡Fig.1 The protein interaction network of phloridzin

2.3 網絡模塊識別與分析

對構建的蛋白互作網絡進行聚類分析,利用軟件中的MCODE插件篩選出10個模塊,MCODE算法對每一個識別模塊進行打分排序,節點數和分值越高,說明該模塊中蛋白的關聯度越高[9]。根皮苷蛋白互作識別模塊如圖2所示。由圖2可知,網絡模塊1包含節點數11,得分11.0;網絡模塊2包含節點數11,得分11.0;網絡模塊3包含節點數9,得分9.0;網絡模塊4包含節點數15,得分7.9;網絡模塊5包含節點數7,得分7.0;網絡模塊6包含節點數6,得分6.0;網絡模塊7包含節點數5,得分5.0;網絡模塊8包含節點數10,得分4.7;網絡模塊9包含節點數11,得分4.0;網絡模塊10包含節點數7,得分4.0,10個模板的得分均在3分以上,說明每個模塊內蛋白之間的關聯度較高。每個模塊參與的生物過程見表2。

圖2 根皮苷蛋白互作識別模塊Fig.2 The modules of the protein interaction network of phloridzin

表2 功能模塊參與的主要生物過程Table 2 Main biological processes related to the functional module

“模塊性”是蛋白互作網絡復雜系統的一個重要特征,在單個模塊內部節點稠密,而在模塊間節點稀疏,通過這一特征可以從復雜系統中挖掘出更多的信息,更好地幫助理解復雜系統的機能和特性。本研究通過構建根皮苷蛋白互作網絡并進行模塊分析,對所獲得與降糖相關的模塊1、模塊4、模塊6、模塊7、模塊8、模塊9、模塊10進行討論。

模塊1與組蛋白乙酰化相關,組蛋白是染色質的核心,其尾部共價修飾在基因表達調控中起重要作用,研究發現,2型糖尿病外周血單個核細胞(PMBC)組蛋白乙酰化水平增加,組蛋白乙酰轉移酶p300和CREBBP基因表達上調,而組蛋白去乙酰化酶SIRT1下調[14]。部分1型糖尿病患者外周血單核細胞H4乙酰化水平增高,組蛋白修飾參與調控胰島素基因的表達,胰島素基因啟動子附近區域組蛋白H3乙酰化水平明顯升高[15]。有學者將多種低濃度多酚(5 μmol/L)作用于單細胞系統,研究不同多酚對于組蛋白乙酰轉移酶(HAT)和組蛋白脫乙酰化酶(HDAC)的活性影響,結果表明尿石素B和C(Urolithins B、C)、沒食子酸(Gallic acid)和5-O-沒食子酰基--β-D-葡萄糖(Penta-O-galloyl-β-D-glucose)能夠顯著降低HAT的活性,可以作為表觀遺傳調節器[16],根皮苷與文獻中的多酚均存在于蘋果中,且結構功能相似,推測根皮苷具有降低HAT活性的作用。模塊1表明,根皮苷可以通過組蛋白乙酰化作用參與胰島素基因的表達,從分子網絡水平表明了根皮苷的降糖作用機制。

模塊4與血糖穩態相關,在人體內維持血糖穩態可以穩定血糖水平、預防感染,而在呼吸道表面液體(Airway surface liquid,ASL)中維持低葡萄糖濃度是維持人體內血糖穩態的重要作用方式。鈉離子偶聯葡萄糖協同轉運蛋白SGLT1存在于肺部,可有助于清除通過上皮細胞擴散到ASL的葡萄糖[17]。有研究表明,根皮苷可以協助SGLT1轉運除去擴散到ASL的葡萄糖[18]。本研究從分子水平表明,根皮苷通過維持血糖穩定發揮抗糖尿病的作用機制,可通過調控圖2中鈉離子葡萄糖聯合轉運子家族2/成員2(SLC2A2)和乳糖酶(LCT)等蛋白發揮降糖作用。

模塊6與乙酰膽堿分解過程相關,乙酰膽堿引起血管舒張反應,與血管內壁的一氧化碳相關,而一氧化碳與糖尿病的發生和發展有密切的關系,糖尿病患者在發病早期一氧化碳含量明顯降低,這是由于糖尿病患者內皮細胞合成一氧化碳減少,造成動脈血管內皮依賴性舒張反應障礙[19]。多酚類物質通過參與乙酰膽堿代謝,起到改善糖尿病患者血管舒張反應不全的癥狀,從而保護腎臟、提高記憶力等。有研究表明,辣椒素可以改善2型糖尿病大鼠冠狀動脈內皮依賴性舒張不全,同時改善糖尿病慢性高血糖、高血脂狀態[20];張穎等[21]發現,淫羊藿苷能增強乙酰膽堿誘導的腎動脈舒張效應,改善糖尿病腎病大鼠腎動脈舒縮功能。Rizzoni等[22]建立乙酰膽堿、緩激肽、內皮獨立血管舒張劑硝普鈉、內皮素1濃度-反應曲線,發現非胰島素依賴型糖尿病(Non-insulin-depengent diabetes mellitus,NIDDM)和原發性高血壓(Essential hypertension,EH)對小動脈形態學的影響在數量上相似,但在質量上不同,糖尿病患者中存在的高血壓對小動脈形態學的累加作用不大,對內皮功能障礙無影響;茶多酚能改善乙酰膽堿誘發的血管舒張功能,保護腎臟的機構和功能[23];白藜蘆醇可通過調節腦組織內乙酰膽堿代謝以及氧化應激反應提高阿爾茨海默癥合并糖尿病大鼠的學習記憶能力[24]。通過功能模塊分析可知,根皮苷調節乙酰膽堿分解,使血管舒張,從而改善高血糖癥狀。

模塊7與戊糖降解過程相關,核糖是人體內重要的戊糖,具有加速體內胰島素合成、提供能量等作用,有研究[25]表明,糖尿病患者體內核糖代謝失常,形成糖基化終末產物(AGEs),該產物能夠加速細胞死亡。Wei等[26]的研究證實,外源攝入核糖可以促進胰島素的產生,暫時降低血糖水平,但這種作用會隨著核糖服用時間的延長而減弱。本研究從分子層面表明根皮苷發揮降糖作用主要與圖2中模塊7的二氫二醇脫氫酶(Dihydrodiol dehydrogenase,DHDH)、山梨醇脫氫酶(Sorbitol dehydrogenase,SORD)、醛脫氫酶(Aldehyde dehydrogenase,ALDH1B1、ALDH3A2)等蛋白相關。

模塊8、模塊9與嘌呤核苷酸和陰離子轉運過程相關,嘌呤核苷酸在能量供應、代謝調節及組成輔酶等方面起著重要作用,在人體內嘌呤氧化后變成尿酸,血尿酸水平升高與2型糖尿病發生率之間存在正相關關系[27]。研究發現,男性體內基線尿酸水平高,則發生糖尿病的風險比基線尿酸水平低的男性增加1.78倍[27],不僅如此,高尿酸血癥和2型糖尿病患者腎臟病變、大血管并發癥、高血壓和其他代謝異常也有非常緊密關系[28-30]。有機陰離子轉運多肽(Organic anion transporting polypeptides,OATPs)多態性介導口服降糖藥與調血脂藥物互作是目前研究熱點,OATPs是溶質轉運體超家族成員(Super family of solute carders,SLC),在胃腸道、肝腎臟、血腦屏障處均有表達,對藥物吸收、分布、消除有重要影響[31]。本研究從分子層面表明,根皮苷發揮降糖作用主要與鈉離子耦合核苷酸轉運體(Sodium-coupled nucleoside transporter,SLC28A2、SLC28A3)、鋅離子轉運體(Zinc transporter,30A4)、胞嘧啶核苷脫氨酶(Cytidine deaminase,CDA)、胸苷磷酸化酶(Thymidine phosphorylase,TYMP)、尿嘧啶-胞嘧啶-激酶(Uridine-cytidine kinase 1,UCKL1)、甘氨酸脒基轉移酶(Glycine amidinotransferase,GATM)、雙重氧化酶(Dual oxidase,DUOX1、DUOX2)等蛋白相關。

模塊10與鈣離子穩態相關,鈣離子穩態在維持細胞器功能和肝臟、脂肪組織關鍵應激反應方面起著重要的作用,在機體內以磷酸鈣的形式存在,在代謝應激、肥胖和糖尿病的影響下,鈣離子穩態的改變會嚴重影響心臟功能、肌肉收縮、胰島素和血糖素分泌[32]。多酚、多糖、三萜類化合物等通過改善鈣離子穩態改善糖尿病患者的癥狀。有研究發現,靈芝孢子粉能有效改善2型糖尿病大鼠腎臟的鈣離子失衡[33],綠茶多酚對D-半乳糖與Aβ25～35誘導阿爾茨海默癥(Alzheimer)病小鼠鈣穩態有積極的影響[34]。圖2網絡分析結果可知,根皮苷通過調節白蛋白(Albumin,ALB)、淀粉樣前體蛋白(Amyloid beta(A4)precursor protein,APP)、凝血酶(Thrombin,F2)等蛋白調節鈣離子穩態發揮降糖作用。

3 結論

本研究通過網絡數據庫獲得了蘋果中根皮苷的作用靶點,利用STRING獲得靶點的蛋白互作信息,構建了根皮苷的蛋白互作網絡,Cytoscape識別網絡模塊進行聚類分析,利用BinGO 對識別出的模塊參與的生物過程進行了注釋,從分子網絡水平闡釋了根皮苷降糖作用機制,其主要通過參與組蛋白乙酰化、血糖穩態、乙酰膽堿分解、戊糖降解、嘌呤核苷酸陰離子轉運、鈣離子穩態等生物過程發揮降糖作用。