富硒長雙歧桿菌DD98菌株的黏附特性及黏附機制初步研究

周 艷,祁 艷,紀 瑞,譚 俊,*,陳代杰,3,*

(1.中國醫藥工業研究總院,上海 200040; 2.復旦大學,上海 200120; 3.上海交通大學,上海 200240)

雙歧桿菌是存在于人體腸道內的具有重要益生功能的厭氧微生物,具有調節腸道微生物群、抵抗病原微生物及提高機體免疫力等功能[1-2]。有研究表明[3],雙歧桿菌能夠通過自身的生物轉化吸收利用培養基中的元素,同時改變自身的生理生化特性。據此,研究人員可以采用特定的培養條件,使益生菌特定地富集某種元素,有目的地改進其生理特性,從而豐富并優化其益生功能[4]。硒元素是人體所必需的微量元素,具有抗氧化、抗腫瘤、增強機體免疫力等多種生物學活性,對人體的健康有諸多益處[5]。在高硒環境中發酵培養益生菌,使其將無機硒吸收轉化為自身硒蛋白,即可制備有機硒和益生菌雙重功效的富硒益生菌[6]。

雙歧桿菌能否對機體產生益生作用與其能否在消化道內黏附、定植有關,其中黏附是其發揮作用的先決條件[7-8]。雙歧桿菌對腸道上皮細胞的黏附能力、對胃酸膽鹽的耐受力均會影響其在腸道的定植,因此分離培養得到具備腸道定植能力的雙歧桿菌具有非常重要的應用價值和現實意義。體內研究益生菌對人腸道上皮細胞黏附性較為困難,體外研究益生菌黏附能力常用模型為人結腸癌細胞系的Caco-2細胞株,該細胞株在體外培養后能夠較好地模擬人體腸上皮細胞的成熟形態[9]。同時研究表明[10-11],菌體表面疏水性、自聚集能力與細菌黏附性存在一定的相關性,細菌黏附能力與細菌表面性質有直接關系。表面疏水性(Cell surface hydrophobicity,CSH)常作為評價細菌黏附性的指標[12],用于表明細菌表面具有非極性成分,使菌體在極性較高的水中表現出非穩態,并引起非穩態體系中的熱能和分子的重新排列[13]。自動聚集能力是指在培養菌體過程中,菌體快速大量繁殖從而自行聚集成團的現象[14]。菌體的自動聚集能力有助于其生物膜形成,從而能夠在腸道內提前占位,抑制致病菌對人體腸道的侵襲[15]。

目前,有關雙歧桿菌一類益生菌的黏附特性研究較多。Del等[16]研究雙歧桿菌的黏附能力時,發現不同種類長雙歧桿菌間黏附能力存在差異性。研究初步證明,細胞壁蛋白Tuf參與了B.LongumNCC2705黏附于Caco-2細胞的過程中,且Tuf蛋白能夠明顯抑制競爭性菌體黏附于Caco-2細胞,為黏附相關蛋白[17]。但關于富硒培養對益生菌黏附性質的影響研究尚未報道。本研究旨在探討一株新的長雙歧桿菌菌株DD98在富硒前后的黏附特性變化,并根據相關黏附蛋白Tuf轉錄表達情況,對富硒培養前后菌體黏附能力變化的機制進行初步探索,為研究和開發益生活性更優的新型富硒益生菌產品奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

長雙歧桿菌DD98菌株(CGMCC No. 16573) 本實驗室經高通量篩選得到耐硒長雙歧桿菌菌株[18],經16S rRNA測序及核苷酸序列BLAST分析,結果表明DD98菌株是一種新的長雙歧桿菌;人結腸腺癌細胞系Caco-2株 上海來益生物藥物研究開發中心有限責任公司惠贈;高糖型DMEM培養基、優級胎牛血清 Gibco;青鏈霉素(雙抗) Thermo Scientific;胰蛋白酶、臺盼藍、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO) 上海合谷生物科技有限公司;亞硒酸鈉 山東西亞化學工業有限公司;海藻糖 日本林源；脫脂奶粉 新西蘭恒天然公司；二甲苯、硝酸鉀、乙醇、尿素、SDS等 國藥試劑。

400M厭氧培養箱 RUSKINN;SPX-150B-Z二氧化碳培養箱 松下電器產業;HITACHI S-4800型掃描電鏡 株式會社日立制作所;SP-756P紫外分光光度計、Multiskan Go酶標儀 賽默飛世爾科技公司;XSP-2CA倒置顯微鏡 上海締綸光學儀器有限公司;TL-18M冷凍離心機 上海市離心機械研究所;T100熒光定量PCR儀器 伯樂Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品及培養基制備 RCM培養基:蛋白胨10.0 g、牛肉粉10.0 g、酵母粉3.0 g、葡萄糖5.0 g,可溶性淀粉1.0 g、氯化鈉5.0 g、醋酸鈉3.0 g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g、瓊脂0.5 g、蒸餾水1000 mL,pH6.7～6.9,121 ℃滅菌15 min。

DD98的培養:將長雙歧桿菌DD98接種于RCM培養基中,厭氧培養24 h,收集菌體。

Se-DD98的培養:將長雙歧桿菌DD98接種于RCM培養基中,厭氧培養12 h后,向培養基中添加亞硒酸鈉,繼續培養至24 h,在高硒環境下發酵制備Se-DD98。

將DD98及Se-DD98分別與凍干保護劑(海藻糖2%、脫脂奶粉10%，水70%)1∶1混合后,冷凍干燥48 h后得到凍干菌粉,密封保存于4 ℃,實驗前采用平板涂布法檢測樣品活菌數。

1.2.2 細胞培養 液氮罐中取出Caco-2細胞,將凍存管迅速置于37 ℃水浴中復蘇細胞,離心(1000 r/min,3 min)收集細胞后,加入4 mL含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養基,在37 ℃、5% CO2二氧化碳培養箱中培養,隔天換液。當細胞在培養瓶底長滿至80%時,需要進行傳代[19]。

用于黏附試驗的細胞培養于細胞6孔培養板中,接種量為105個,待單層細胞匯合之后,繼續培養10～15 d,即可用于黏附試驗。進行黏附實驗前24 h,需要提前更換為無雙抗DMEM培養基(含有血清,不含抗生素)。

1.2.3 掃描電鏡觀察菌株黏附情況 采用無雙抗的DMEM培養基將DD98及Se-DD98凍干菌粉濃度調整至108CFU/mL[15],然后加入到培養在6孔板中的已分化的Caco-2細胞層中,于37 ℃、5% CO2、95%空氣的細胞培養箱中共同培養2 h。無菌PBS(pH7.4)洗滌5次,以除去未黏附的細菌后,取出6孔培養板中黏附細胞的蓋玻片,加入2.5%的戊二醛固定過夜;采用PBS緩沖液漂洗樣品3次,每次10 min;鋨酸固定樣品30 min后,以PBS緩沖液漂洗3次;樣品于30%、50%、70%、90%、100% 梯度乙醇中脫水,每次15 min,樣品經由無水乙醇/醋酸異戊酯(1∶1)的混合液過渡后,轉入純醋酸異戊酯,每次約10 min以置換酒精,樣品置于預冷干燥室進行CO2臨界點干燥(約4 h),噴金后采用掃描電鏡觀察[20]。

1.2.4 菌株黏附能力的測定 細胞、細菌培養及處理同1.2.3。無菌PBS(pH7.4)洗滌5次以除去未黏附的細菌后,加入胰酶250 μL,37 ℃孵育10 min,釋放細胞上已黏附的細菌,然后向培養板每個孔中添加250 μL含無雙抗DMEM的培養基以終止胰酶活力,用1 mL移液器將Caco-2細胞層吹打下來。黏附細菌經無菌生理鹽水10倍梯度稀釋后,涂布于RCM固體培養基平板上進行平板菌落計數,菌株的黏附能力以每100個Caco-2細胞黏附的細菌數量(CFU/100 cells)表示[21],進行3次獨立的實驗,計數樣品均在37 ℃條件下厭氧培養。

1.2.5 菌體自聚合能力的測定 參考Collado等[22]、Tuo等[23]研究方法,將DD98及Se-DD98的細菌培養物,在室溫下離心(6000 r/min,10 min),棄上清,收集菌體。菌體用滅菌的PBS(pH7.2)溶液洗滌兩次,并重懸于PBS 溶液中,使其在600 nm下的吸光度達到0.5±0.02(記為A0)。將細胞懸液渦旋振蕩15 s,于37 ℃分別靜置30、60、90、120、150、180 min。吸取1 mL靜置后的上清,測定其在600 nm的吸光度(At)。按公式(1)計算自聚合能力,重復三次實驗取平均值。

自聚合能力(%)=(1-At/A0)×100

式(1)

式中:A0:菌體懸液的初始吸光度;At:靜置不同時間后上清的吸光度。

1.2.6 菌體表面疏水性的測定 參考Rong等[24]研究方法,將DD98及Se-DD98菌液,在室溫下離心(6000 r/min,10 min),倒去上清,收集菌體,菌體經PBS清洗2次后,再重懸于滅菌的0.1 mol/L KNO3溶液中。在600 nm處調節吸光度為0.5±0.02,記作A0。取3 mL菌懸液與1 mL二甲苯混勻后在室溫靜置10 min(此時形成兩相體系)。將兩相體系渦旋振蕩2 min后再靜置20 min,重新形成兩相體系(水相和有機相)。小心吸取水相,在600 nm下測定吸光度(A)。按公式(2)計算細菌表面疏水性,重復三次實驗取平均值。

表面疏水性(%)=(1-A/A0)×100

式(2)

式中:A0:菌體懸液的吸光度;A:兩相混合后水相的吸光度。

1.2.7 Tuf蛋白轉錄水平表達情況的測定 收集與Caco-2細胞共孵育0、2 h的DD98及Se-DD98菌液混合物,使用RNA抽提試劑盒提取樣品RNA,并進一步將其逆轉錄為cDNA。將所得cDNA稀釋后與引物、SYBRGreen qPCRMix反應液混合,在Bio-Rad T100熒光定量PCR儀器進行反應,PCR反應條件為:95 ℃ 30 s;94 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s共40個循環,每個樣品做3個復孔,每個樣品重復3次實驗。16S rRNA作為內參基因,引物序列[25]見表1。

表1 熒光定量RT-PCR實驗引物Table 1 Fluorescent quantitative RT-PCR experiment primers

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 Se-DD98及DD98對Caco-2細胞的黏附現象觀察結果

Se-DD98及DD98黏附于Caco-2單層細胞膜后,掃描電鏡觀察結果見圖1。由圖1可知,兩種長雙歧桿菌菌體形態完整,邊緣清晰,均附著凍干保護劑顆粒,部分菌體出現凍干后的皺縮,電鏡觀察結果表明,富硒長雙歧桿菌及長雙歧桿菌均能夠黏附于Caco-2單層細胞膜上。

圖1 掃描電鏡下Se-DD98及DD98對Caco-2細胞的黏附情況(×103)Fig.1 Adhesion of Se-DD98 and DD98 strains to Caco-2 cells under scanning electron microscope(×103)注:A:單純Caco-2細胞膜;B:Se-DD98黏附于 Caco-2細胞膜;C:DD98黏附于Caco-2細胞膜。

2.2 Se-DD98及DD98對Caco-2細胞的黏附能力

以Caco-2細胞為體外模型,采用平板計數法,分析Se-DD98、DD98對Caco-2細胞的黏附能力,結果見圖2。由圖2可知,相比DD98,Se-DD98能夠黏附更多菌體在Caco-2細胞上,每100個Caco-2細胞平均黏附的DD98菌體為(39.12±17.57) CFU,每100個Caco-2細胞平均黏附Se-DD98菌體為(581.17±62.79) CFU。結果表明,長雙歧桿菌DD98菌株經富硒培養后,對Caco-2細胞膜的黏附能力極顯著提高(p<0.01)。

圖2 Se-DD98及DD98對Caco-2細胞黏附能力Fig.2 Adhesion ability to Caco-2 cell of Se-DD98 and DD98 strains注:與DD98組相比,**表示差異極顯著,p<0.01, *表示差異顯著,p<0.05;圖4～圖5同。

2.3 自動聚集能力的測定

Se-DD98及DD98菌株自動聚集能力測定結果見圖3。由圖3可知,隨著時間的推移,兩組細菌懸浮液上層細胞均逐漸沉降,到180 min后,細菌懸浮液上層渾濁度明顯下降,自聚合能力明顯提高。相比DD98,Se-DD98的自動聚集能力略有上升,但無顯著差別。

圖3 Se-DD98及DD98在不同時間點自動聚集能力Fig.3 Auto-aggregation ability of Se-DD98 and DD98 strains

2.4 表面疏水性的測定

研究認為,細菌表面疏水性是由其表面蛋白、糖類及其他化合物所共同形成的一種菌體表面特性[22]。Se-DD98與DD98在碳氫化合物二甲苯中的表面疏水性如圖4所示。由圖4可知,相比DD98,Se-DD98在碳氫化合物二甲苯中表現出較高的表面疏水性,其結果平均為20.25%±2.14%,DD98的表面疏水性平均僅為5.12%±0.16%,兩者有極顯著性差異(p<0.01)。結果表明,長雙歧桿菌在高硒壓力下培養后,菌體表面性質發生改變,菌株表面疏水性增加。研究發現,菌體表面疏水性與其黏附能力呈正相關[16],據此可推測DD98菌株富硒培養后,其黏附能力增加,更易黏附并定植于機體腸道內壁。

圖4 Se-DD98及DD98的表面疏水性Fig.4 Cell surface hydrophobicity of Se-DD98 and DD98 strains

2.5 細菌表面Tuf蛋白mRNA表達情況

細菌表面Tuf蛋白是已經報道過的兼職蛋白,具有翻譯因子、宿主蛋白Plg受體雙重功能[23]。研究證實,Tuf蛋白可以直接與人纖溶酶原(Plg)相互作用,是Plg的受體,在長雙歧桿菌黏附于腸上皮細胞的過程中產生重要影響[24]。本實驗設計引物,以轉錄相對保守16S rRNA作為內參,通過熒光定量RT-PCR法,檢測Se-DD98及DD98與Caco-2細胞共孵育0、2 h,細菌表面Tuf蛋白mRNA的表達量,結果以2-ΔΔCt值表示,其Tuf蛋白mRNA表達情況如圖5所示。由圖5可知,與Caco-2細胞共孵育前,Se-DD98與DD98菌體Tuf蛋白mRNA表達量無明顯差異。與Caco-2細胞共孵育2 h后,DD98及Se-DD98Tuf蛋白mRNA表達量相比與細胞孵育前均上調,且相比DD98,Se-DD98的Tuf蛋白mRNA表達量顯著上調更多(p<0.05)。推測長雙歧桿菌DD98菌株富硒培養后具有更高的黏附能力與細菌表面Tuf蛋白mRNA的表達有關。

圖5 Se-DD98及DD98與Caco-2細胞共孵育 2 h后其Tuf蛋白mRNA表達情況Fig.5 The Tuf protein mRNA transcription result of Se-DD98 and DD98 after co-incubation with Caco-2 cells for 2 h

3 結論

菌體黏附能力是雙歧桿菌在腸道中定植的先決條件,也是其發揮益生功能的基礎。本研究以DD98為對象,在以Caco-2為模型、研究其富硒前后黏附能力變化的實驗中發現,Se-DD98的黏附能力明顯升高。在菌體表面性質的研究中,發現Se-DD98菌體表面疏水性極顯著升高(p<0.01),表明富硒培養能夠改變DD98的表面特性,使其黏附能力增強,推測富硒培養使雙歧桿菌表面黏附相關蛋白發生改變,從而引起菌體黏附能力升高。本通過熒光定量RT-PCR法,分析與Caco-2細胞共孵育0、2 h的Se-DD98及DD98的Tuf蛋白mRNA轉錄情況,發現相比DD98,Se-DD98的Tuf黏附蛋白mRNA表達量顯著上調更多(p<0.05),推測Se-DD98具有更高的黏附能力與Tuf黏附蛋白的轉錄能力有關,具體機制還需更進一步的研究。