枯草桿菌蛋白酶QK的活性與氨基酸突變位點的相關性

楊媛媛,周 立,唐藝萍,劉秋晨,梁 寧,王業富

(武漢大學生命科學學院病毒學國家重點實驗室,湖北武漢 430072)

枯草芽孢桿菌分布范圍廣、抗逆性強,是人們最早發現的細菌之一[1]。它能產生芽孢,對高溫、酸堿等環境有極強的抗性。它的生長環境多樣化,因此具有豐富的產酶系統,可以將多種蛋白質直接分泌到周邊環境中,已成為工業酶生產應用最廣泛的菌種之一[2]。枯草桿菌蛋白酶是一種堿性的絲氨酸蛋白酶[3],人們對它的使用可以追溯到一千年前,日本人利用枯草芽孢桿菌并采用固態發酵的方法制作傳統食品—納豆[4]。而今,枯草芽孢桿菌在工業發酵產酶上的應用也越來越普遍[1-2]。

枯草芽孢桿菌能分泌枯草桿菌蛋白酶(subtilisin QK,QK蛋白),QK蛋白由381個氨基酸組成,具有溶栓活性,與納豆激酶(nattokinase)高度同源,可以用于治療血栓性疾病,具有抗菌、促消化和提升免疫力的功能[3-5]。對于QK蛋白的研究,一般以提高酶活力為標準,或優化發酵條件,或利用生物工程的方法對枯草芽孢桿菌的某些位點進行突變[6-7]。尚無有關天然QK蛋白的氨基酸序列位點突變與其酶活力相關性的研究。本研究從不同的市售納豆產品種中分離篩選天然的枯草芽孢桿菌,對它們的QK基因進行測序,通過蛋白質比對,初步發現酶活大小與枯草桿菌蛋白酶氨基酸位點變化的關系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株信息:從廣東雙駿生物科技有限公司(2/5/6號菌株)、安徽正東生物科技有限公司(3/11/12號菌株)、上海葳環進出口有限公司(7/13/14號菌株)、上海頂舜穎生物科技有限公司(1/4/10/15號菌株)和日研食品杭州有限公司(8/9號菌株)等5個公司分別購入兩個批次的QK蛋白粉,用生理鹽水溶解后搖培,劃線培養,挑單菌落而得。

DL2000 DNA Marker、細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型) 天根生化科技有限公司;PCR MasterMix 康為世紀;高保真、高效率、高速PCR酶KOD-Plus-Neo TOYOBO公司;膠回收試劑盒 Axygen;尿激酶(Urokinase) 國家藥品標準物質中心;纖維蛋白原(Fibrinogen)、凝血酶(Thrombin) Sigma公司;PMD19-T TaKaRa公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒 Biosharp公司;其他試劑 武漢阿瑪迪生物技術有限公司,試劑均為分析純。

超凈工作臺 蘇凈安泰AIRTECH;多功能酶標儀 美谷分子儀器(上海)有限公司;恒溫恒濕培養箱 上海精宏實驗設備有限公司;恒溫搖床 武漢瑞華儀器設備有限責任公司;PCR儀 TaKaRa生物公司;高壓滅菌鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;電泳槽 北京君意電泳設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的配制 LB培養基:胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,氯化鈉10 g,用去離子水定容至1 L。固體培養基在此基礎上加入瓊脂15 g。

種子培養基和基礎發酵培養基:按文獻[8]進行配制。

1.2.2 菌株的分離與初篩 參照馬明等[8]的方法進行初篩,在無菌條件下分別稱取15份蛋白粉樣品1.00 g,加入到裝有9 mL生理鹽水的培養瓶中,200 r/min、37 ℃振蕩搖培30 min,劃線接種至固體LB培養基上,37 ℃恒溫培養12 h后,共挑取到15個單菌落。將15個單菌落分別轉移到另一LB平板上,繼續培養3天,觀察菌落形態。

1.2.3 基因組DNA的提取與引物設計 將1.2.1中挑選出的15個單菌落分別接種至LB液體培養基中,200 r/min、37 ℃恒溫培養12 h后,采用細菌基因組DNA提取試劑盒進行基因組DNA的提取。根據NCBI已發表的枯草芽孢桿菌QK基因序列,利用Primer Premier 5軟件對基因序列進行分析,設計引物如表1所示,引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.2.4 16S rRNA序列分析法驗證15株菌株 參考雒煥貞等[9]的方法進行。以枯草芽孢桿菌的總DNA為模板,用引物27F/1492R進行PCR擴增。25 μL反應體系為:12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix,1 μL(10 μmol/L)上下游引物,1 μL模板DNA,ddH2O補足至25 μL。

反應程序為:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃復性30 s,30個循環;72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。擴增產物以27F/1492R為引物,送至生工生物工程公司進行測序,測序結果輸入NCBI中做同源序列搜索。

1.2.5 高保真PCR擴增QK基因序列 將1.2.3的PCR產物經膠回收柱純化,然后與克隆載體PMD19-T Vector連接,轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞,之后于37 ℃搖床預孵育1 h,涂藍白斑篩選培養基,37 ℃培養過夜,挑取白斑進行菌落PCR[10]。以QKF/QKR為引物,以KOD-Plus-Neo試劑盒進行高保真PCR 擴增。50 μL反應體系為:5 μL 10×Buffer,3 μL MgSO4,5 μL dNTPs,1 μL酶,1.5 μL(10 μmol/L)上下游引物,1 μL模板DNA,ddH2O補足至50 μL。

嵌入式學科服務研究是高校圖書館資源迅速增長與用戶需求多樣性之間的不匹配所形成的針對性服務，是對高校圖書館資源優勢、人力優勢和服務理念的有效體現，然而由于各個高校圖書館在自身服務能力、基礎和理念上的差異，現有的嵌入式學科服務還存在一定的不足。通過分析圖書館網站和專業文獻，結合對用戶、學科館員等嵌入式服務中的相關人員的調查研究，發現嵌入式學科服務中還面臨不少的問題，具體如下。

反應程序為:94 ℃預變性2 min;98 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,68 ℃復性60 s,33個循環;68 ℃延伸10 min,4 ℃保存。PCR擴增產物經1%的瓊脂糖電泳后,用Axygen膠回收試劑盒回收目的片段。

電泳檢測后送到上海生工生物公司進行核酸序列測定。將菌株序列輸入NCBI中進行比對,找出其與QK蛋白的氨基酸序列不同的位點。

1.2.6 枯草桿菌蛋白酶QK粗提液的制備 參考文獻[9]的方法。挑選LB固體培養基上的單菌落接入液體種子培養基中(裝液量為2 mL·20 mL-1),37 ℃、200 r/min恒溫搖培18 h。以3%接種量接種至液體發酵培養基(裝液量為20 mL·250 mL-1),37 ℃、200 r/min恒溫培養38 h。發酵液混合均勻即為枯草桿菌蛋白酶QK粗提液。

1.2.7 枯草桿菌蛋白酶活性測定 本實驗應用纖維蛋白平板法[11-12]測定酶活性,這也是目前國家衛生部測定尿激酶等溶栓酶活力的標準方法。以凝血酶和纖維蛋白原作用后制成人工血栓平板,以尿激酶為標準品,得出酶活力(IU/mL)與透明圈面積S(cm2)的關系。

尿激酶標曲的制作:尿激酶的Tris-HCl(pH=8.8)溶液濃度分別為:620、310、155、77.5、38.75、19.375 IU/mL。用垂直直徑的乘積的常用對數(lgS)為橫坐標,標準尿激酶濃度的常用對數(lgIU)為縱坐標,制作尿激酶酶活的標準曲線,根據尿激酶溶栓活性標準曲線求出樣品的酶活力大小。

1.2.8 枯草桿菌蛋白酶QK粗提液蛋白含量測定 本實驗利用Biosharp公司的BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白含量,配制梯度濃度的牛血清白蛋白(BSA)溶液:0、25、125、250、500、750、1000、1500、2000 μg/mL,利用多功能酶標儀測定各濃度的BSA溶液在562 nm處的吸光值,繪制關于蛋白濃度和吸光值的標準曲線,即可根據測定的吸光值求出蛋白的濃度。

1.2.9 單位酶活力的計算 得到蛋白濃度之后,結合所測得的酶活力大小,后者與前者的比值即為單位蛋白酶活力(IU/mg),以此來表示最終酶活力大小。計算公式表示為:

1.3 數據處理

實驗中每個處理重復3次,采用SPSS 19.0軟件進行數據的顯著性分析,用GraphPad prism5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌的菌種鑒定

2.1.1 菌株的菌落形態 在LB固體平板培養后觀察15株芽孢桿菌的單菌落形態,從形狀、顏色、含水狀態等8個不同的方面進行描述,結果見表2。

表2 枯草芽孢桿菌菌落形態Table 2 Colony morphology of Bacillus subtilis

從菌落形態來看,15株菌株都是乳白偏黃色,不透明。不同菌株之間菌落形態的其他6個方面有一定差異,這與其他學者研究報道的枯草芽孢桿菌形態多樣性的結論一致[10]。但根據菌落形態難以將其分類。

2.1.2 枯草芽孢桿菌16S rRNA和QK基因序列分析 16S rRNA序列經PCR擴增后的片段長度都在1.5 kbp左右,QK基因序列經PCR擴增后的片段長度都在1149 bp左右,如圖1。

圖1 PCR擴增QK基因Fig.1 Amplification of QK gene by PCR注:M:DL2000 DNA Marker; 1～15:15個菌株QK基因PCR產物。

15株菌株的16S rRNA經PCR擴增后送測序,將序列輸入NCBI中進行同源搜索,所有15株的16S rRNA序列都與枯草芽孢桿菌具有超過99%的同源性。

2.1.3 枯草芽孢桿菌的QK蛋白序列分析 將15株菌株的QK基因序列輸入NCBI中,與QK基因所對應的蛋白序列(GeneBank編號:CAE18180.2)進行比對(tBLASTx),氨基酸突變位點如表3所示。

表3 15株菌株的氨基酸突變位點Table 3 Amino acid mutation sites of 15 strains

對比后發現,15株菌株均有的突變位點有6個:L104H,G166D,R167G,S179A,F181L和T290N。其余突變根據氨基酸位點的不同可以分為四類,以下把它們依次分為A、B、C、D四組。A組有5個菌株,分別是2、5、6、8、9號,特有的突變位點為S184T;B組有3個菌株,分別是3、11、12號,特有的突變位點為Q90K,N193S,S236T,N365S;C組有3個菌株,分別是7、13、14號,特有的突變位點為N193S,S236T,A289V;D組有4個菌株,分別是1、4、10、15號,特有的突變位點為Q90K,N193S,S236T,A289V。

2.1.4 枯草桿菌蛋白酶QK粗提液的酶活大小測定 尿激酶標準曲線做出后,可根據方程得出各菌株的酶活大小。具體數據見表4。由表4可知,6號菌株的酶活最高,達到了347.610 IU/mL,且A組的5株菌株的酶活顯著(p<0.05)大于其他三組的10株菌株。4號菌株的酶活最低,僅2.719 IU/mL,且D組的4株菌株的酶活都比較低,但是B、C、D三組的10株菌株之間的酶活無顯著差異。而A組特有的突變位點為S184T,D組特有的突變位點為A289V,由此結果可初步判斷S184T這一位點的突變能提高單位酶活,而A289V這一突變能降低單位酶活。

圖2 尿激酶酶活標準曲線Fig.2 The standard curve of urokinase activity

2.1.5 枯草桿菌蛋白酶QK粗提液的蛋白濃度測定 根據實驗結果所作標準曲線如圖3所示。根據回歸方程:y=0.368x+0.084,計算出15株菌株的蛋白濃度,結果見表4。D組的1號菌株蛋白濃度是18.410 mg/mL,顯著低于其余的14株菌株。B組的3號菌株蛋白濃度最高,為35.235 mg/mL,但是除了與1號、8號的27.251 mg/mL有顯著差異外,與其他菌株均無顯著差異。蛋白濃度在組間的差異并不明顯。

圖3 牛血清白蛋白濃度標準曲線Fig.3 The standard curve of bovine serum albumin

2.1.6 枯草桿菌蛋白酶QK粗提液單位酶活的比較 單位酶活是以酶活與蛋白濃度的比值來定義的。用SPSS 19.0軟件分析各菌株單位酶活數值,結果見表4。組間單位酶活比較結果見圖4。

表4 15株菌株的酶活、蛋白濃度及單位酶活Table 4 Enzyme activity,protein concentration and unit enzyme activity of 15 strains

從15株菌株之間來看,單位酶活的大小差異較大,最低的是4號,僅有0.09 IU/mg,最高的是6號,達到了11.52 IU/mg。除此之外,還可以看出單位酶活的大小與組別聯系密切:同一組之間的各菌株差別不大,不同組之間的差異明顯。因此,對單位酶活進行了組間比較,得到圖4所示的柱狀圖。

圖4 各組單位酶活大小比較Fig.4 Comparison of enzyme activity in each group注:組間單位酶活比較采用One-Way ANOVA檢驗。 柱狀圖上不同字母表示有顯著差異(p<0.05)。

A組的單位酶活最高,B、C組無顯著(p>0.05)差異,D組最低。結合測定單位酶活的實驗結果可以看出,單位酶活大小與突變位點的關系非常密切。其中,A組與其他組相比,QK蛋白氨基酸的S184T這一位點變化,可能對單位酶活性有促進作用。D組與C組相比,說明A289V這一位點的變化可能對單位酶活性有抑制作用。B組與C組相比,說明N365S的突變對單位酶活性的提升有積極作用。進而猜想184、289等位點可能位于枯草桿菌蛋白酶QK的活性中心。

3 結論

本實驗對15株枯草芽孢桿菌的QK基因進行測序,測序結果與GenBank上已提交的QK基因所對應的蛋白序列(GeneBank編號:CAE18180.2)進行比對,根據突變位點的不同將這些菌株分為4組,除去15個菌株均有的6個突變位點:L104H,G166D,R167G,S179A,F181L和T290N。其余各突變如下:A組的突變位點為S184T,B組的突變位點為Q90K,N193S,S236T,N365S,C組的突變位點為N193S,S236T,A289V,D組的突變位點為Q90K,N193S,S236T,A289V。A組的單位酶活顯著最高,B組和C組無顯著差異但均顯著低于A組,D組的單位酶活比其他三組顯著最低(p<0.05)。據此,推測,S184T這一突變對于單位酶活有較大的提高作用,N365S這一突變對于單位酶活稍有提高作用,A289V這一突變對單位酶活有較明顯的抑制作用。在以后的研究中,將會把來自15株菌株的QK基因克隆入載體,在畢赤酵母中表達蛋白,將蛋白純化后進行比較,力求從根本上弄清楚上述位點是否位于枯草桿菌蛋白酶的活性中心。這對于提高QK蛋白在工業生產中的單位酶活性,提高工業生產的效率,有著非常重要的作用。