超高效液相色譜-三重四極桿質譜法同時測定飼料中8種類固醇激素

房克艷,趙超敏,陳 沁,鄧曉軍

(1.上海大學生命科學學院,上海200444; 2.上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術中心,上海 200135)

雄性激素和孕激素都是具有調節機體代謝或生理功能的類固醇激素,可促進動物生長,促進蛋白質合成,提高蛋白轉化率。20世紀50年代雄性激素和孕激素被廣泛用作動物生長促進劑,以大幅度提高養殖業的經濟效益。然而,在飼料中濫用激素會導致其在動物組織中積累,進而通過食物鏈進入到人體內,干擾人體內自然的激素平衡。勃地酮、甲睪酮等雄激素會抑制女性雌激素水平,影響孕婦胎盤功能和胎兒的生長發育[1];影響糖和脂肪的正常代謝,導致肥胖、高血壓等,促使心血管疾病和糖尿病的發生[2];甲羥孕酮乙酸酯、美侖孕酮等孕激素能夠刺激機體合成其它代謝類固醇如雌二醇等激素[3],進而擾亂人體內分泌系統,導致女性性早熟、男性生育能力下降等嚴重后果[4-5]。因此,包括中國在內的許多國家禁止了睪酮及其代謝酯、鹽類的使用[6],禁止其作為動物生長促進劑[7-8]。我國農業部第176號公告也明確指出禁止使用此類激素[9]。但是在利益的驅使下,違規用藥的案例仍時有發生。因此,建立一種快速簡單的類固醇激素多殘留分析方法具有重要的實際意義。

目前,對于雄激素和孕激素的檢測研究已經有很多,檢測對象多為動物性產品[10-11]、環境基質[12]等,檢測方法主要有氣相色譜-串聯質譜法(GC-MS)[12]、液相色譜法[13]、液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[14]和超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)[15]。GC-MS分析樣品時必須經過氣化,檢測雄激素和孕激素此類難揮發的物質時需要衍生化,操作繁瑣、耗時長 。UPLC-MS/MS的方法靈敏度高,特異性強,常用于復雜基質中化合物的定性和定量檢測[16]。飼料前處理方法主要有:液-液萃取法(LLE)[12]、基質固相分散萃取法(MSPD)[17]、固相萃取法(SPE)[18]、QuEChERS[19]等,相對于其它方法,LLE法的成本低且操作簡單,是提取和分離的常用方法。本文利用LLE技術、UPLC-MS/MS技術,建立了飼料中8種類固醇激素的檢測方法,以期實現大批量飼料樣品的快速處理和檢測,節省成本,提高檢測效率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

勃地酮(BND,純度98.8%)、17α-羥基孕酮(17α-OHP,純度99.4%)、甲睪酮(MTS,純度97.70%)、甲羥孕酮乙酸酯(MPA,純度99.0%)、乙酸甲地孕酮(MEGA,純度99.0%)、諾龍(NDL,純度98.1%)、群勃龍(TB,純度99.1%) 德國Dr.Ehrenstorfer公司;美侖孕酮(MGA,純度98%) 加拿大TRC公司;17α-羥基孕酮-D8(17α-OHP-D8,純度99%) 加拿大CDN isotopes公司;睪酮-D3(TS-D3,純度98.68%) 美國Sigma-aldrich公司;甲醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈和正己烷 HPLC級,美國TEDIA公司;乙酸銨、三氯乙酸、氯化鎂、氯化鋅和氫氧化鈉 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;超純水 由Mili-Q超純水系統制得;Athena C18-WP色譜柱 上海安譜科學儀器有限公司;飼料樣品(單一植物源性飼料、飼料添加劑、濃縮飼料配合飼料和精料補充料) 均購自當地市場。

超高效液相色譜配QTRAP6500質譜 美國AB Sciex公司;IKARRVORTEX 2漩渦振蕩器 德國Heidolph公司;CM-1000往復式振蕩器 日本Yamato公司;Rotavapor R-215全自動氮吹儀 美國Caliper公司;RE601旋轉蒸發儀 瑞士Buchi公司;Allegra X-30R Centrifuge低溫離心機 美國Sigma公司;Pipet-Lite XLS移液器 法國Gilson公司;BRANSON-2800超聲清洗機 美國BRANSON公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 儲備液:分別準確稱取BND、17α-OHP、MTS、MPA、MEGA、NDL、TB和MGA 8種類固醇激素及其內標(17α-OHP-D8和TS-D3)各1.00 mg(精確到0.01 mg),以甲醇配制成濃度為100.0 mg/L的單標溶液,密封,于棕色瓶中-30 ℃儲存。單標中間工作液:分別移取0.1 mL 100.0 mg/L的單標儲備液,以甲醇配制濃度為1.0 mg/L的單標中間工作液,密封,于棕色瓶中-30 ℃儲存,備用?；旌蠘藴使ぷ饕?使用前分別移取一定量1.0 mg/L的8種類固醇激素的單標中間工作液,用甲醇配制為100.0 μg/L的混合標準溶液(BND、17α-OHP、MTS、MPA、MEGA、NDL、TB和MGA),密封,于棕色瓶中-4 ℃儲存。

1.2.2 儀器分析條件 色譜條件:色譜柱為Athena C18-WP色譜柱(2.1 mm×150 mm,5 μm);流速為0.40 mL/min;進樣體積10 μL;流動相A為5 mmol/L乙酸銨(1‰甲酸),B為乙腈(1‰甲酸);洗脫程序:0～4 min,35%～50%B;4.0～8 min,50%～85% B;8～9 min,85% B;9～9.1 min,85%～35% B;9.1～14 min,35% B。質譜條件:電離模式:電噴霧電離正離子模式(ESI+);多反應監測(MRM);電噴霧電壓(IS):5500 V;霧化氣壓力(GS1):55 V;氣簾氣壓力(CUR):35 V;輔助氣流速度(GS2):60 V;離子源溫度500 ℃;碰撞氣(CAD):Medium;入口電壓(EP):10 V;所有氣體由氮氣提供(純度,99.999%),具體參數見表1。

表1 8種類固醇激素及其及內標的質譜參數Table 1 Mass spectrometry parameters for 8 steroid hormones and internal standards

1.2.3 樣品前處理 稱取5.00 g(精確到0.01 g)均質飼料樣品,準確加入100 μL 100.0 μg/L睪酮-D3和17α-羥孕酮-D8內標。加入一定量的乙腈、10%三氯乙酸,渦旋30 s,超聲提取10 min,4500 r/min離心5 min,取上清液于250 mL梨型瓶中。10 mL乙腈重復提取一次,合并提取液,于50 ℃旋轉蒸發至近干。15 mL正己烷溶解殘余物,加入一定量的0.1 mol/L氫氧化鈉溶液、0.1 mol/L氯化鎂,提取溶液于10000 r/min,5 ℃離心3 min,取上清液于試管中,10 mL正己烷重復提取一次,合并的提取液在低于40 ℃下,用緩和氮氣流吹干。加入1 mL乙腈-水(1∶1,V/V)溶解殘渣,加1 mL乙腈飽和正己烷溶液,渦旋混勻30 s,轉移至2 mL連蓋塑料離心管中,于4 ℃15000 r/min離心3 min,取下層溶液過0.22 μm濾膜,待測定。

1.2.4 方法優化 質譜條件:質譜的離子源溫度、氣簾氣壓力、霧化氣壓力、輔助氣壓力均在所有目標化合物都有良好響應信號的情況下進行優化。采用100.0 μg/L的單標準溶液流動注射泵連續進樣方式,分別在正、負離子模式下進行一級(Q1)質譜全掃描(100～500 m/z),以確定準分子離子(母離子)。

色譜條件:選取Athena C18-WP色譜柱,在相同質譜條件下,流動相選擇水-乙腈、水-甲醇和5 mmol/L乙酸銨水-乙腈(1‰甲酸),選擇響應值高,峰形對稱尖銳的流動相。另外,優化流速以及洗脫梯度,選擇響應值高,耗時短,基質干擾低的流速和洗脫條件。

前處理條件:在飼料空白樣品中添加8種類固醇激素混合標準溶液和兩種內標物各1.0 μg/kg,按照1.2.3的方法進行處理。分別考察乙腈(ACN)、乙酸乙酯(EA)和甲醇(MeOH)的提取效果并確定最佳提取溶劑的體積;選取10%的三氯乙酸(TCA)和NaOH(0.1 mol/L)溶液作為除蛋白溶劑,根據其除蛋白效果和添加回收率結果確定其添加量;比較0.1 mol/L MgCl2和0.1 mol/L ZnCl2除脂效果,選取合適的除脂溶劑和添加體積。

1.2.5 方法學考察 考察所建方法的線性范圍、檢測限、定量限、回收率、精密度、基質效應等指標,以評價該方法的靈敏度、回收率、精密度和基質效應。

線性范圍、檢測限和定量限:配制一定系列標準曲線(0、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L),分別加入1.0 μg/L定量內標,以得到目標物質的峰面積與加入內標物質峰面積的比值為縱坐標(y),對應目標物質濃度與內標物質濃度的比值為橫坐標(x),繪制工作曲線。以3倍基線噪聲(S/N)所對應的待測物濃度為該方法的檢測限(LOD),以10倍基線噪聲(S/N)所對應的待測物濃度為該方法的定量限(LOQ)。

回收率和精密度:單一植物源飼料、飼料添加劑、濃縮飼料、配合飼料和精料補充料空白樣品,分別添加1.0、2.0、5.0 μg/kg標準物質,按照1.2.2和1.2.3的方法進行檢測分析(n=6),驗證方法的回收率和精密度。

基質效應:選取空白基質(5種飼料樣品)按照1.2.3的前處理方法進行處理,得到空白基質樣品與乙腈/水(1∶1,V/V)分別配制一定系列內標標準曲線(0、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L),其中內標的添加量均為1.0 μg/L(n=3),得到8種類固醇激素空白基質匹配標準曲線斜率(k1)與乙腈/水(1∶1,V/V)配置標準曲線斜率(k2)。根據以下公式,計算8種類固醇激素的基質效應值(Matrix effect,ME):

ME=0沒有基質效應;ME>0離子增強作用;ME<0離子抑制作用。

1.2.6 實際樣品的檢測 按照1.2.2和1.2.3的方法對從市場采購的5種飼料樣品(每種類型各10份)進行檢測。

1.3 數據統計分析

數據采集和處理利用Analyst1.5.2軟件進行。8種類固醇激素均采用內標法進行定量分析,具體定量情況見表1。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

8種類固醇激素在正離子模式,且[M+H]+作為母離子時質譜響應值最高。因此,選擇正離子模式進行電離。去簇電壓(Decluster potential,DP)是影響離子響應值的重要質譜參數。因此,首先優化DP使每一個母離子獲得最大靈敏度,進一步優化其它色譜參數。以母離子為準分子離子進行二級質譜掃描,子離子在以氮氣為碰撞氣的碰撞室內獲得,選擇豐度較高的兩個特征離子碎片作為定量和定性離子(圖1)。

圖1 8種類固醇激素及其內標的二級質譜圖Fig.1 Secondary mass spectrogram of 8 steriod hormones and their internal standards

2.2 色譜條件的優化

根據8種類固醇激素的化學結構,選擇3組流動相進行比較,水-乙腈作為流動相時,8種類固醇激素的響應值高,且在流動相中加入甲酸,更有利于其離子化,提高其響應值;乙酸銨的加入,可維持流動相pH的穩定,減少次級保留,改善峰形,使峰形更加對稱尖銳,提高積分的準確度。因此,選擇5 mmol/L乙酸銨水-乙腈(1‰甲酸)為流動相。圖2為經梯度洗脫的二級質譜提取離子流圖。另外,對比了流速為0.20、0.30、0.40、0.50 mL/min時的分離效果,流速過低時,出峰時間晚,耗時;流速為0.50 mL/min時,出峰時間早,基質影響大。最終確定流速為0.40 mL/min,此時出峰時間集中在4～8 min,且基質影響效果小。

圖2 8種類固醇激素及其內標的二級質譜提取離子流圖(1.0 μg/kg)Fig.2 MS/MS extraction ion spectra of 8 steroid hormones and two internal standards(1.0 μg/kg)

2.3 提取條件的選擇

2.3.1 提取溶劑的選擇 由于8種類固醇激素在弱極性和中等極性的溶劑中均具有良好的溶解性。選取的3種提取溶劑在體積(均為20 mL)與前處理條件均相同的情況下,三者的提取回收率分別在70.6%～99.1%、38.3%～84.5%和31.4%～94.0%之間。乙腈對8種激素的提取效果均良好,甲醇對勃地酮、群勃龍、甲羥孕酮乙酸酯和乙酸甲地孕酮的提取效果不理想,而乙酸乙酯的提取效果均不理想(圖3);且甲醇提取液暴露在空氣中一段時間后,顏色由黃色變為草綠色,后期的凈化處理無法將其有效去除,而乙腈和乙酸乙酯提取液顏色為淺黃色,進一步純化后,色素能夠被去除;經甲醇提取的樣品,質譜響應值低,且峰形亂,表明提取液中基質共提物較多?？紤]到回收率、基質效應和提取效率等綜合效果,最終選擇乙腈作為提取溶劑。

圖3 提取溶劑的種類對8種類固醇激素回收率的影響Fig.3 Effect of type of extraction solvent on 8 steroid hormones

2.3.2 提取溶劑體積的選擇 對比了10、15、20、25 mL的提取溶劑對回收率的影響,結果顯示,當提取劑體積為10 mL時,除甲睪酮和諾龍外,其它6種激素的提取率在45%～70%之間,且峰形寬,色譜響應值低;當提取劑體積為15 mL時,回收率均達到70%以上,峰形明顯改善,繼續增加提取溶劑的量,回收率有上升的趨勢,但變化并不明顯(圖4)。為了節省有機溶劑和旋轉蒸發的時間,選擇提取溶劑體積為15 mL。

圖4 提取溶劑體積對8種類固醇激素回收率的影響 Fig.4 Effect of volume of extraction solvent on 8 steroid hormones

2.4 凈化條件的選擇

2.4.1 除蛋白條件的選擇 分別在均質飼料中加入600 μL(A組)、700 μL(B組)、800 μL(C組)10%的三氯乙酸(TCA)。結果顯示:B組的提取液渾濁,呈現不透明狀,而A組和C組的提取液較清澈;濃縮后,白色殘余物的量為A>B>C;且A組樣品:有雜質均勻的粘連在梨型瓶壁上,B、C組樣品:大部分雜質均聚集在梨型瓶的底端。由于C組添加10% TCA的量多,蛋白迅速凝聚,部分分析物被包裹在內,造成分析物的損失;而B組樣品則是在旋轉蒸發的過程中緩慢的發生蛋白質的聚集,既能有效去除蛋白,又避免了分析物的大量損失。因此,選擇添加700 μL 10% TCA。

為了進一步去除殘余蛋白,選擇添加一定量的NaOH(0.1 mol/L)。通過考察其添加量對類固醇激素回收率的影響,結果顯示:隨著NaOH添加量的增加,梨型瓶底部白色沉淀物的量逐漸增加,表明加入的NaOH溶液能夠有效的分離出殘留的蛋白。由圖5A可以看出,NaOH(0.1 mol/L)添加量對4種雄激素的影響較大,對4種孕激素回收率影響效果不明顯。NaOH添加量為0～1 mL時,受樣品中蛋白質的干擾,雄激素的回收率低,質譜峰寬且拖尾,導致積分不準確;添加量為2 mL時,提取液呈現不透明狀,說明大部分蛋白質已經被沉淀出,且此時各激素的回收率及色譜峰形均良好;繼續增加NaOH添加量,回收率效果變化不明顯。因此,選擇NaOH(0.1 mol/L)的添加量為2 mL。

圖5 NaOH(0.1 mol/L)添加量 對8種類固醇激素收率的影響Fig.5 Effect of NaOH(0.1 mol/L) addition on 8 steroid hormones

2.4.2 脫脂條件的選擇 通過比較0.1 mol/L MgCl2和0.1 mol/L ZnCl2的除脂效果,結果顯示,兩者均具有除脂效果,相比較而言,經MgCl2除脂后,8種類固醇激素的回收率高(圖6)。表明,MgCl2能有效降低基質的影響,提高回收率。因此,選擇MgCl2作為除脂溶劑。

圖6 MgCl2與ZnCl2對8種類固醇激素回收率影響效果的比較Fig.6 Comparison of effects of MgCl2 and ZnCl2 on 8 steroid hormones

MgCl2(0.1 mol/L)添加量不僅影響除脂效果,而且會對目標物產生一定的基質干擾。對比結果顯示,對于雄激素,不添加MgCl2時,群勃龍的回收率較低,為60%左右;隨著MgCl2添加量的增加,諾龍的回收率逐漸增加(圖7A);對于孕激素,美侖孕酮和乙酸甲地孕酮的響應值隨著MgCl2添加量的增加而略有降低,但回收率均在70%以上,對其它幾種激素的回收率影響效果不明顯(圖7)。因此,選擇MgCl2(0.1 mol/L)添加量1 mL。

圖7 MgCl2(0.1 mol/L)添加量對8種類固醇激素回收率的影響Fig.7 Effect of MgCl2(0.1 mol/L) addition on 8 steroid hormones

以上分析可以看出,4種雄激素受蛋白質和脂肪的影響較大,4種孕激素受其影響相對較小。蛋白質和脂肪的去除,不僅能夠減少基質的干擾,使檢測結果更為準確;更重要的是,能夠減少對儀器的損傷,避免長期檢測在儀器中積累大量的蛋白質和脂肪,堵塞管路、色譜柱,減少儀器的使用壽命。

2.5 基質效應

通過比較基質匹配內標標準曲線的斜率與乙腈/水(1∶1,V/V)溶劑內標標準曲線的斜率。結果顯示:8種類固醇激素的ME(%)值均小于10%,且5種空白基質匹配內標標準曲線定量分析的結果與用乙腈/水(1∶1,V/V)配制的內標標準曲線定量分析的結果差別不大(以甲睪酮為例-圖8)。表明樣品基質中存在一定的基質效應,但是對分析結果的影響效果不大。

圖8 液相色譜-串聯質譜的基質效應考察(甲睪酮為例)Fig.8 Matrix effect of LC-MS/MS(methyltestosterone as an example)

2.6 方法學考察

2.6.1 方法線性范圍、檢出限和定量限 該方法的線性相關系數均在0.999以上,線性關系良好。3倍基線噪聲(S/N)所對應的待測物濃度LOD為0.10～0.34 μg/kg,10倍基線噪聲(S/N)所對應的待測物濃度LOQ為0.35～0.98 μg/kg,與其它檢測方法相比,該方法的檢出限和檢測限低[20-21],表明該方法的靈敏度高。

2.6.2 方法回收率與精密度 單一植物源飼料、飼料添加劑、濃縮飼料、配合飼料和精料補充料空白樣品,分別添加1.0、2.0、5.0 μg/kg標準物質,按照1.2.2和1.2.3的方法對加標樣品進行處理和檢測,每個水平平行測定6次,其加標回收率均在70.4%～109%之間,相對標準偏差(RSDs)為0.38%～10.3%(表3)。該方法準確度和精密度均符合飼料中激素殘留檢測的要求。

表3 8種類固醇激素的加標回收率和相對標準偏差(n=6)Table 3 Sampling recovery and relative standard deviation of 8 steroid hormones(n=6)

續表

2.7 實際樣品分析

采用所建方法對從市場采集的5種飼料(每種類型10個樣品)進行檢測分析,均未檢出上述8種激素。

3 結論

本文建立了飼料樣品中4種雄性激素(勃地酮、甲睪酮、諾龍和群勃龍)和4種孕激素(甲羥孕酮乙酸酯、美侖孕酮、乙酸甲地孕酮和17α-羥基孕酮)的超高效液相色譜-三重四極桿質譜(UPLC-MS/MS)方法。樣品前處理采用液-液萃取的方法,操作簡單,凈化效果好,能有效地降低基質效應;可在14 min實現8種類固醇激素的檢測分析,與普通的液相色譜方法相比,分離效果好,分析時間短,檢出限和定量限低,精密度高;該方法的回收率和線性均符合檢測的要求。該方法可靠、快速,靈敏度高,可作為飼料中8種類固醇激素的確證和定量方法。