酶型時間-溫度指示劑在食品包裝中的應用及研究進展

王 麟,張 巖,李 菲

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學院包裝與印刷工程學院,河南鄭州 450046)

隨著食品工業(yè)的蓬勃發(fā)展以及消費者對食品安全問題的關注,人們對食品包裝提出了更高的要求?，F(xiàn)在食品包裝不僅要具有功能性、新穎性和吸引力,還應為消費者提供有關食品質量和安全的必要信息。在食品的整個流通過程中,除了自身影響因素外,食品的質量和安全性與外部環(huán)境因素(如溫度、時間、濕度、光照和機械應力等)密切相關[1]。在上述因素中,隨環(huán)境變化的儲存溫度是導致食物腐敗最不可預測的因素,極大影響了食物的保質期。因此,監(jiān)測食物流通過程中的溫度變化至關重要[2]。作為一種智能食品包裝技術,時間溫度指示劑(Time temperature indictor/integrator,TTI)可以監(jiān)控和記錄食品配送過程中一些關鍵參數(shù),結合時間和溫度的累積效應,動態(tài)顯示食品的剩余保質期,為食品生產(chǎn)者、運輸者以及消費者提供準確檢測和評估食品品質的方法[3]。

根據(jù)時間溫度指示劑反應原理和指示方法的不同,可將其分成不同的種類,如擴散型、聚合物型、酶型、微生物型等[4]。其中,酶型時間溫度指示劑的性能穩(wěn)定,成本低廉,且易于控制,受到國內外科學家廣泛的關注和研究[5]。酶型TTI是基于酶促反應原理,利用酶水解底物使pH改變,導致pH指示劑變色;或者是酶直接催化底物,產(chǎn)生肉眼可見的顏色變化,從而實現(xiàn)監(jiān)測食品質量變化的目的[6]。根據(jù)TTI中酶的存在形態(tài),可將其分為液態(tài)酶型TTI和固態(tài)酶型TTI。目前,研究酶型TTI的專利和文章有上百多篇,但相關的總結性文章并不多,尤其是關于固態(tài)酶型TTI的綜述文章更是匱乏。基于此現(xiàn)狀,本文對酶型TTI的最新研究進行了總結,從液態(tài)酶型TTI和固態(tài)酶型TTI兩方面分析,闡述了酶型TTI的研究現(xiàn)狀、存在的主要問題及其改進方法,旨在為酶型TTI在食品包裝中的應用提供理論基礎和實驗參考。

1 液態(tài)酶型TTI

1.1 脂肪酶型

脂肪酶能逐步將甘油酯水解成甘油和脂肪酸,降低溶液的pH,使酸堿指示劑產(chǎn)生顏色變化,且溫度越高,水解速度越快,從而可用作指示食品質量變化的工具。商品化的CheckPointTM(瑞典Vitsab A.B. 公司)就是脂肪酶型TTI的典型代表[7]。CheckPointTM由一個帶有兩個密封隔間的圓形塑料袋組成,一個隔室含有脂肪酶水溶液和pH指示劑,另一個隔室含有脂質底物。激活之前,即脂肪酶和底物還未開始反應時,酶溶液和底物可以分開保存很長時間。通過向塑料袋施加機械壓力,破壞兩隔室之間的屏障,誘導酶溶液和底物混合,可以激活TTI。隨著反應程度的增加,溶液的pH逐漸降低,使pH指示劑的顏色從綠色變?yōu)槌壬?。在其范圍結束時,即反應程度達到100%時,該TTI顯示出最終的紅色,呈現(xiàn)出準確且容易肉眼識別的顏色變化,從而可精確預測食品的保質期,如圖1所示。

圖1 不同反應程度下CheckPointTM顏色變化示意圖Fig.1 Schematic diagram of the color change of CheckPointTM at different reaction levels

吳丹等[8]基于脂肪酶和甘油三丁酸酯之間的反應,改變底物的濃度,開發(fā)出了四種具有不同活化能的TTI體系,擴展了其應用范圍。四種TTI的活化能值分別為42.12、36.84、31.60和34.42 kJ/mol,且TTI達到終點所需的響應時間隨著底物濃度的降低而增加,適用于監(jiān)測活化能在30～42 kJ/mol范圍內的新鮮食品,例如由于脂質氧化、酶促反應等導致質量損失的水果、蔬菜、魚類等食品。任興晨等[9]構建了適用于4 ℃下使用的脂肪酶TTI,且研究了乳化劑聚乙烯醇和Na+、K+、Mg2+、Ca2+等金屬離子對TTI的影響。在聚乙烯醇乳化液和CaCl2存在下,制備的TTI最適合低溫下使用,其動力學活化能為60.14 kJ/mol,為脂肪酶型TTI 在食品冷藏溫度下的適用性提供了理論基礎。Taoukis等[10-12]基于CheckPointTM,改變TTI中脂肪酶濃度,研究了其在冷凍狀態(tài)下的動力學模型。選擇揮發(fā)性鹽基氮(TVBN)作為表征冷鏈食品新鮮程度的理論指標,感官評分作為冷鏈食品新鮮程度的實際指標,發(fā)現(xiàn)這種酶型TTI能有效地對藍鯊片、魷魚片和牡蠣等冷凍產(chǎn)品在分配、儲存、銷售等過程中的質量進行監(jiān)測,預估出產(chǎn)品在儲存期任何時候的剩余保質期,從而能優(yōu)化和管理食品的冷鏈運輸。

Kim等將脂肪酶型TTI系統(tǒng)用于監(jiān)測碎牛肉的質量變化[13]。選用三己酸甘油酯作為脂肪酶水解底物,基于具有溫度依賴性的假單胞菌屬的生長來研究碎牛肉的腐敗情況。動力學實驗數(shù)據(jù)表明,牛肉中假單胞菌屬腐敗的活化能是47.5 kJ/mol,而制備的TTI活化能是35.8 kJ/mol,兩者活化能相似,且在兩種動態(tài)儲存條件下,TTI系統(tǒng)的終點接近于碎牛肉的保質期。因此,該TTI系統(tǒng)是監(jiān)測碎牛肉在分配和儲存過程中質量變化的有效工具。郭素娟等[14]利用脂肪酶TTI監(jiān)測羊肉的質量變化，選用三丁酸甘油酯作酶底物,優(yōu)化反應條件,確定最佳的反應體系，使用的酸堿指示劑在 pH9.0～6.0范圍內的顏色變化趨勢是紫紅色、藍色、綠色、黃色,能較好地進行肉眼識別。TTI的顏色變化與羊肉的新鮮程度相一致,能方便、快捷地指導羊肉的生產(chǎn)和消費。

1.2 淀粉酶型

淀粉與碘作用形成藍色包合物,淀粉在淀粉酶的作用下發(fā)生水解反應,聚合度或相對分子質量逐漸降低,導致包合物發(fā)生褪色,由藍色變成無色,且褪色速度與溫度和時間有關。因此,基于淀粉的水解反應,可以制備淀粉酶型TTI,用于指示食品的新鮮程度。

Sun等[15]將淀粉和碘的混合溶液烘干后與淀粉酶混合,得到的固態(tài)粉末再與水一起封裝,開發(fā)出了一種低成本的淀粉酶型TTI體系，研究了不同淀粉酶含量下TTI的顏色變化與時間和溫度的關系,并進行了數(shù)學模擬，通過調節(jié)淀粉酶和淀粉的比例,可以將TTI的活化能控制在102～110 kJ/mol范圍內,以適應具有不同活化能的食物。錢靜等[16]基于糖化酶水解麥芽糊精的反應,開發(fā)出了一種新型的淀粉酶型TTI。改變糖化酶的加入量,可以得到活化能分別是88.59、78.95和69.76 kJ/mol的三種TTI模型,應用于因脂肪氧化或微生物增長而造成質量損失的食品。其中,活化能是78.95 kJ/mol的TTI可用于指示冷藏條件下,保質期是5 d的冷鮮肉的質量變化[17]。

Rajan等[18]利用淀粉酶型TTI監(jiān)測冷凍牛肉的高溫融化過程，將裝有淀粉酶和淀粉-碘復合物混合液的聚乙烯袋子粘貼在冷凍牛肉的保鮮膜外側,分別在25、37 ℃下加熱解凍。25 ℃時,TTI在18 h后由最初的藍黑色變成最終的黃色;37 ℃時,TTI顏色到達終點所需時間為12 h。在牛肉加熱融化過程中,該TTI的顏色變化與各種肉質參數(shù)的變化相吻合,可以成功地用于評估冷凍牛肉的高溫融化歷史。Brizio等[19]將淀粉酶型TTI用于指示易腐家禽運輸鏈中的質量變化(圖2)。通過實驗室、工廠和銷售點的測試,證明了TTI的保質期可通過改變淀粉酶濃度來進行調節(jié)。當?shù)矸勖傅馁|量是淀粉質量的60%時,TTI的活化能是22.29 kJ/mol,可在4 ℃下保存10 d,最適合用于冷凍雞胸肉的運輸。

圖2 淀粉酶型TTI的反應原理Fig.2 Reaction principle of the amylase type TTI system

1.3 蟲漆酶型

蟲漆酶是一種銅離子氧化酶,具有廣泛的作用底物,可催化氧化酚類化合物、二胺、芳香胺、苯硫醇等底物,使反應溶液顏色發(fā)生變化,結合時間和溫度的累積效應,可制備蟲漆酶型TTI。將蟲漆酶應用于酶型TTI有以下優(yōu)點:a. 蟲漆酶的作用底物廣泛,對不同底物的氧化速率不同。因此,可以通過改變蟲漆酶的作用底物,調控TTI的活化能值,開發(fā)出具有寬活化能范圍的TTI;b. 蟲漆酶的酶催化機理簡單,蟲漆酶型TTI的反應速率與時間的變化成線性關系,動力學簡單;c. 蟲漆酶安全環(huán)保,基于蟲漆酶的TTI在意外破裂引起溢出的情況下也是安全的。

Kim等[20]選用愈創(chuàng)木酚作為蟲漆酶的反應底物,牛血清白蛋白作酶穩(wěn)定劑,利用愈創(chuàng)木酚在蟲漆酶作用下的氧化變色作指示劑,研發(fā)出了蟲漆酶TTI模型。動力學實驗表明,該TTI的顏色變化與愈創(chuàng)木酚的氧化速率成線性關系,且改變蟲漆酶的加入量可將TTI的活化能值控制在43～47 kJ/mol范圍內,能直觀地評估由酶促變化、水解和脂質氧化引起的食品質量變化。

疊氮化鈉(NaN3)能可逆地與蟲漆酶的底物結合位點以外的位點結合,抑制其酶活性?；诖?Park等[21]又進一步研究了NaN3對蟲漆酶TTI的影響。結果表明NaN3可以改變TTI的活化能,使其隨著NaN3含量的增加而升高,并將其控制在48～110 kJ/mol范圍,精準監(jiān)測各種食品的質量變化。當NaN3的濃度是7 μmol/L時,TTI的活化能是99 kJ/mol,可用于監(jiān)測朝鮮泡菜的發(fā)酵過程[22]。

1.4 脲酶型

脲酶是一種含鎳的寡聚酶,能催化尿素水解生成碳酸和兩分子氨,并釋放出氨氣和二氧化碳,使溶液的pH增加,酸堿指示劑顏色發(fā)生變化。脲酶催化尿素水解的反應速率與溫度密切相關,在一定溫度范圍內,溫度越高,反應速率越快。因此,基于此反應可構建脲酶型TTI體系。

吳秋明[23]以脲酶催化尿素水解反應為基礎,改變緩沖溶液的種類、pH指示劑的種類和尿素底物的濃度,優(yōu)化實驗條件,開發(fā)出了各組分最佳的脲酶型TTI體系。通過研究TTI的動力學行為,確定了體系的反應函數(shù)和動力學參數(shù),其活化能值是22.5 kJ/mol,具有指示食品剩余貨架期的可行性。吳丹等[24]將脲酶加入到尿素的磷酸緩沖溶液中,利用酚紅酸堿指示劑的顏色變化,構建了脲酶TTI模型；隨著反應時間的進行,TTI系統(tǒng)由黃色變?yōu)榧t色；研究了顏色變化的動力學,建立了顏色隨時間和溫度變化的數(shù)學關系,測得該TTI的活化能為23.05 kJ/mol,可用于監(jiān)測具有相似活化能值的食物質量。

1.5 酪氨酸酶型

酪氨酸在酪氨酸酶的作用下能被催化氧化成多巴胺中間體,再進一步被氧化成多巴色素,使反應溶液由無色變成褐色,再變成最終的黑色,且溫度越高,反應速度越快。因此,可基于此反應制作酪氨酸酶型TTI。

葛雷等[25]基于酪氨酸酶開發(fā)了一種新型的酶促TTI體系。該TTI由酪氨酸和酪氨酸酶的磷酸緩沖溶液組成,利用酪氨酸在酪氨酸酶作用下的顏色變化作指示,制備簡單。實驗中測定酶促反應的動力學參數(shù),進行數(shù)學模型分析。結果表明該TTI體系在冷藏條件下,48 h后溶液顏色變?yōu)楹谏?指示時間約為2 d,適用于監(jiān)測極易腐敗食品或者要求鮮食的高檔水產(chǎn)品的質量變化。

1.6 其他酶型

過氧化物酶是一類氧化還原酶,在H2O2存在下能氧化酚類和胺類化合物,如2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、愈創(chuàng)木酚、鄰苯二胺、抗壞血酸等。ABTS在過氧化物酶和H2O2作用下被氧化成陽離子自由基,使溶液顏色發(fā)生變化,可用于構建TTI。Rani等[26]從菊科植物紫莖澤蘭中分離提純出過氧化物同工酶,該酶具有較好的熱穩(wěn)定性和經(jīng)濟可行性,并進一步構建了酶型TTI。TTI體系由三部分組成:頂層是H2O2,中間層是低熔點的油脂(如椰子油、酥油和黃油),底層是過氧化物酶和底物ABTS。在低溫環(huán)境下,中間的油脂呈固態(tài),阻止氧化還原反應的進行;溫度升高后固態(tài)的油脂融化,TTI體系被激活,ABTS被氧化,溶液由無色變成深綠色。實驗中研究了TTI變色的動力學,測得其活化能值是120.14 kJ/mol。向體系中加入Hg2+、K+、Ca2+或NaCl可以提高酶的催化活性,加入Mg2+、Zn2+、Mn2+或NaN3可以抑制酶的催化活性,從而可以調控酶促反應的活化能,開發(fā)出一系列過氧化物酶型TTI。

聚羥基丁酯(PHB)是一種熱塑性可生物降解的聚合物,通過熱處理和溶劑輔助處理可加工成均勻的薄膜,其價格低廉,能被多種PHB解聚酶降解,因此可用于開發(fā)TTI。Anbukarasn等[27]在PHB薄膜上負載酞青染料,在解聚酶的作用下,PHB發(fā)生降解,導致染料在溶液中的釋放,隨著時間的推移溶液經(jīng)歷從透明到藍色的顏色轉變,研發(fā)出解聚酶TTI。實驗中研究了染料釋放速率和降解活化能,動力學結果表明37 ℃時染料在6 h內完全釋放;4 ℃時染料在7 d內完全釋放,PHB降解的活化能是74 kJ/mol,可用于監(jiān)測牛奶、鮮肉等食品的保質期和質量損失,如圖3所示。

圖3 基于染料負載的PHB膜發(fā)生 酶促降解反應構建的TTI示意圖Fig.3 Schematic showing of TTI based on the enzymatic degradation of the dye-loaded PHB film

葡萄糖氧化酶在有氧條件下能專一地催化氧化β-D-葡糖,生成葡萄糖酸和過氧化氫,使溶液的pH降低,導致pH指示劑顏色發(fā)生變化,從而可用于制備葡萄糖氧化酶型TTI。Rahman等[28]基于葡萄糖氧化酶的氧化反應,研發(fā)出了一種新型的生物傳感TTI系統(tǒng)。該系統(tǒng)由葡萄糖氧化酶、葡萄糖、pH指示劑和三電極恒電位儀組成,其中電位儀產(chǎn)生的電信號隨體系顏色的變化而改變。分析該響應裝置的反應動力學和溫度依賴性,測定體系顏色和電流信號的變化速率,測得體系顯色反應的活化能值是24.2 kJ/mol,電流反應的活化能是25 kJ/mol。兩者相似的活化能值表明在預測食品質量時,依據(jù)電信號和顏色變化具有相同的效果。因此,基于葡萄糖氧化酶的TTI充當了具有顯著電流變化的生物傳感器,在監(jiān)測食品質量變化過程中可以提供有效的數(shù)字信息,而不是顏色的可見變化這樣的模擬信息,具有很強的實用性。

液態(tài)酶型TTI種類豐富、制備簡單。然而,在實際使用中,液態(tài)酶型TTI受到一定程度的限制,其主要原因有：a. 基于脂肪酶、淀粉酶和脲酶的TTI中需要額外加入指示顏色變化的試劑,會使反應體系變得復雜;蟲漆酶和酪氨酸酶價格相對較高,不利于TTI的商業(yè)化應用;其他酶型的TTI研究相對較少,有待進一步開發(fā)；b. 雖然通過改變底物濃度、酶溶液濃度以及輔酶、抑制劑和緩沖劑的配方,可以調節(jié)液態(tài)酶型TTI的反應速率和活化能,擴大其應用范圍,但液態(tài)下酶不穩(wěn)定,容易失活,且液態(tài)酶型TTI對包裝的機械強度有較高要求,否則容易發(fā)生泄漏,污染食品[29]。

2 固態(tài)酶型TTI

液態(tài)酶型TTI的不穩(wěn)定性、易失活性和易泄漏性限制了其商業(yè)化應用。因此,改變TTI中酶的存在形態(tài),從而建立固態(tài)酶型TTI成為了研究酶型時間溫度指示劑的一個新方向。固態(tài)酶型TTI一般是基于固定化酶技術,再利用酶化學反應和擴散原理構建而成的[30]。

2.1 酶的固定化方法

固定化酶是將酶分子限制在與酶底物或產(chǎn)物基質/載體不同的固體基質/載體上,主要通過吸附法、包埋法、交聯(lián)法和共價結合法四種方法實現(xiàn)[31],如圖4所示。

圖4 不同的固定化酶方法Fig.4 Various methods of enzyme immobilization

2.1.1 吸附法 吸附法是利用離子鍵或物理吸附將酶固定在載體基質表面。根據(jù)吸附方法的不同,可分為離子吸附法和物理吸附法。離子吸附法依賴于酶分子與含有離子交換殘基且不溶于水的載體之間的離子結合,通常使用的載體材料主要是多糖和具有離子交換中心的聚合物。物理吸附法是酶通過范德華力、氫鍵相互作用、疏水作用等微弱的力而粘附在基質表面,最常用的基質材料是水溶性載體,如多糖衍生物、玻璃、聚合物等。

2.1.2 包埋法 包埋法是將酶捕獲到凝膠格子或半透性聚合物膜中,形成格子型和微膠囊型兩種包埋形式。在該方法中,酶不與載體基質結合。

2.1.3 交聯(lián)法 交聯(lián)法是利用交聯(lián)劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)耦合,形成不溶于水的網(wǎng)狀結構而進行固定化。常用的交聯(lián)劑有戊二醛、順丁烯二酸酐、胱胺二鹽酸鹽等,酶中游離的氨基、羧基、巰基、咪唑基及酚基均可參與交聯(lián)反應。

2.1.4 共價結合法 共價結合法是利用酶側鏈的氨基酸殘基(如半胱氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、天冬氨酸等),通過與載體之間形成共價鍵而將酶固定化。通過保護酶的活性位點可以獲得高效的酶活性,常用的保護方法有:a. 形成可逆的酶-抑制劑復合物;b. 對酶進行化學修飾,利用新殘基與載體共價結合;c. 加入酶原前體。

固定化酶能夠有效地提高酶的生物活性、穩(wěn)定性、循環(huán)使用性和機械強度,且使酶促反應更易控制。因此,將固定化酶技術引進到酶型TTI中,構建固態(tài)酶型TTI是一個研究熱點,國內外科學家報道了不同類型的固態(tài)酶型TTI。

2.2 不同類型的固態(tài)酶型TTI

2.2.1 脂肪酶型 聚乙烯醇(PVA)水凝膠具有制備簡單、毒性低、吸水量高、良好的生物相容性等優(yōu)點,是一種常用的固定化酶載體[32]。喬磊等[33]、Lu等[34]將三乙酸甘油酯底物、堿性脂肪酶和酸堿指示劑固定到PVA凝膠中,通過冷凍-解凍循環(huán)法制備了固態(tài)脂肪酶型TTI。其中,TTI的上蓋是三乙酸甘油酯的底物凝膠,下層是包含脂肪酶和溴百里酚藍在內的酶基凝膠,如圖5所示。使用時,將上蓋壓在含酶底板上,使底物凝膠與酶基凝膠接觸,酶促反應被激活,形成一條黃色帶。根據(jù)黃色帶的擴散長度來判斷TTI對時間、溫度的積累效應,監(jiān)測冷鮮豬肉和牛奶在生產(chǎn)、儲運和銷售過程中的質量狀況。喬磊等[35]一步研究發(fā)現(xiàn)未激活前,該TTI體系在0 ℃下貯藏180 d仍可以保持88%的相對酶活性,顯著提高了其在實際應用中的可行性。

圖5 固態(tài)脂肪酶型TTI的物理模型Fig.5 The physical model of the solid-state lipase type TTI

2.2.2 淀粉酶型 玻璃微珠具有比表面積大、機械高度高、耐酸堿性好等有點,是一種優(yōu)良的酶載體[36]。Guiavarc等[37]將淀粉酶、蔗糖和鹽以合適的比例吸附在玻璃微珠表面,開發(fā)出了固態(tài)淀粉酶型TTI,并在低濕度條件下對其進行研究。該TTI在溫度范圍是100～132 ℃的等溫條件下表現(xiàn)出顯著的熱穩(wěn)定性。當環(huán)境的相對濕度是0.48時,TTI在30 min內的Z值(熱力殺菌時對象菌的熱力致死時間曲線的斜率)是9.4 ℃,平均誤差是14%,可用于設計、控制和優(yōu)化低酸性罐頭食品的滅菌過程。

海藻酸鈉是一種由1,4-聚-B-D-甘露糖醛酸和A-L-古羅糖醛酸組成的線性聚合物,具有良好的生物相容性和降解性,可在溫和條件下實現(xiàn)對蛋白質等生物大分子的包埋[38]。孟晶晶等[39]利用海藻酸鈉制備出糖化酶的微膠囊顆粒,從而研發(fā)出了固態(tài)糖化酶型TTI。該TTI由兩個獨立的部分組成:覆蓋物和反應體。反應體由糖化酶微膠囊、淀粉、碘和海藻酸鈉組成,并涂在紙上,覆蓋物是3%的瓊脂水凝膠,將兩部分結合即可激活TTI(圖6)。改變各組分的含量及瓊脂層的厚度,得到7組可用于4 ℃條件下的TTI配方,其活化能值在87～107 kJ/mol范圍內,可用于指示不同冷藏產(chǎn)品的貨架期。當糖化酶加入量是0.03 g,瓊脂凝膠是3.75 mL,麥芽糊精質量濃度是40 g/L時,TTI的活化能是54.14 kJ/mol,在恒溫和變溫兩種條件下能準確地監(jiān)測酸奶品質變化,預測酸奶的保質期[40]。

圖6 固態(tài)淀粉酶型TTI的結構組成Fig.6 The configuration of the solid-state amylase type TTI structure

2.2.3 酪氨酸酶型 冷凍-解凍法,也稱物理交聯(lián)法,是目前制備PVA凝膠最常用的一種方法[41]。徐鳳娟等[42]以酪氨酸和酪氨酸酶為研究對象,利用冷凍-解凍成膜方法,分別制備了負載有酪氨酸和酪氨酸酶的聚乙烯醇凝膠薄膜;把這兩種薄膜粘附在一起,即可制備固態(tài)酪氨酸酶型TTI。這種TTI反應體系構成簡單,無需加入任何指示劑,且由無色至黑色的顏色變化過程更加方便肉眼觀察,如圖7所示。在此基礎上,李振興等優(yōu)化了固態(tài)酪氨酸酶型TTI的組分，通過單因素實驗和響應面優(yōu)化分析確定了TTI中各組分的最佳含量,即酪氨酸用量30.08 mg、酪氨酸酶用量0.30 mL、PVA質量分數(shù)15.18%，此時TTI的活化能值是40.9 kJ/mol,其在4 ℃下最長指示時間可以達到50.48 h,能有效地監(jiān)測生魚片在分配和儲存過程中的質量變化[43]。

圖7 固態(tài)酪氨酸酶型TTI的顏色隨時間變化情況Fig.7 Color changes of the tyrosinase-based TTI with time

2.3 固態(tài)酶型TTI的改進方法

固態(tài)酶型TTI的穩(wěn)定性好,機械強度大,使用方便[44],但目前所使用的固定化酶載體材料比較傳統(tǒng)單一,容易限制酶的擴散,影響其進一步應用。因此,通過改進固定化酶的載體材料,能有效地提高酶的擴散能力,豐富酶型TTI的類型,擴大應用范圍,為其商業(yè)化應用提供可能。改進方法可從以下幾個方面入手:

a. 利用溫度敏感型材料用于酶的固定化。一些兩性離子型單體的聚合物(如聚N-丙烯酰甘氨酰胺(PNAGA)、聚甲基丙烯酰乙基磺基甜菜堿(PDMAPS)、聚[3-(甲基乙烯酰胺)丙基]二甲基-(3-磺酸丙基)銨(PDMMPPS)等)具有最高臨界溶解溫度(UCST),基于此種聚合物可制備熱響應型智能材料,并用于固定化酶。如張倩等[45]將胰蛋白酶固定到PNAGA表面,Cummings等[46]將糜蛋白酶固定到PDMAPS側鏈。利用具有UCST的材料作固定化酶載體,并構建酶型TTI時,在低溫條件下,載體材料呈收縮聚體狀態(tài),酶不易發(fā)生擴散,TTI不易被激活;溫度升高,載體材料發(fā)生溶脹,有利于酶的擴散,能有效地激活TTI。由于具有UCST的溫敏性材料在不同溫度條件下能發(fā)生相轉變,且這種轉變與TTI的溫度變化相符,因此可作為新型的固定化酶載體用于開發(fā)酶型TTI。

b. 利用pH敏感型材料用于酶的固定化。pH敏感型材料是一種可離子化的兩性電解質高分子,一般含有酸性基團(如羧基、磺酸基)或堿性基團(如氨基)[47]。當含有酸性基團時,在低pH下,材料中的大分子鏈間氫鍵相互作用較強,材料發(fā)生脫水收縮,不溶或溶脹率較低;隨著pH的升高,酸性基團給出質子,通過解離使材料發(fā)生溶解或溶脹。這類材料適合用于酶促反應時使溶液pH升高的酶(如脲酶)的固定化載體,進而構建酶型TTI。當含有堿性基團時,材料在高pH下不溶或溶脹率較低,在低pH下堿性基團質子化,發(fā)生溶解或溶脹,適合用作酶促反應時使溶液pH降低的酶(如脂肪酶、葡萄糖氧化酶)的固定化載體,應用于酶型TTI中。因此,基于pH敏感型材料在不同pH下的溶解或溶脹率不同,可開發(fā)出智能的酶型TTI。

c. 利用酶-無機雜化納米花材料用于酶的固定化。酶-無機雜化納米花由Ge等[48]首次提出,是酶分子與無機金屬離子(如鈣、鐵、鋅等)通過自組裝而形成的花狀晶體復合物。花狀結構使復合物具有高表面積(圖8),能顯著地提高酶的穩(wěn)定性、生物活性和循環(huán)使用性。納米花的制備條件簡單、環(huán)保,且具有普適性,適用于多種酶,如脂肪酶[49]、淀粉酶[50]、蟲漆酶[51]、葡萄糖氧化酶[52]等。因此,基于酶-無機雜化納米花這一新型雜化材料可以對多種酶進行固定化,進一步用于構建酶型TTI。

圖8 酶-無機雜化納米花的掃描電鏡圖和示意圖Fig.8 Scanning electron micrograph and schematic diagram of enzyme-inorganic hybrid nanoflowers

3 展望

與傳統(tǒng)的食品包裝相比,酶型TTI作為一種新型的智能包裝形式,通過視覺變化的方式提醒消費者產(chǎn)品可能遭受的溫度變化情況,在易腐食品從準備和包裝到運輸再到商店零售和顧客購買的過程中起著重要的作用,可以為人們提供食品供應鏈中關于食品質量的有用信息。隨著新材料和新技術的產(chǎn)生,未來酶型TTI將會向低成本制作、精確化檢測以及智能化控制方向發(fā)展,在食品包裝上的應用也將大放異彩。在不久的將來,以酶型TTI為代表的智能包裝方式也必將通過科技的創(chuàng)新與進步,不斷地滿足人們對于品質與安全的更高要求,更好地服務食品智能包裝行業(yè)。