食品中降尿酸活性物質及其作用機理研究進展

鄒 琳,馮鳳琴

(浙江大學生物系統工程與食品科學學院,農業部農產品采后處理重點實驗室, 浙江省農產品加工技術研究重點實驗室,浙江杭州 310058)

近年來,隨著生活方式、飲食習慣和周圍環境等因素的改變,痛風發病率呈逐年上升趨勢。痛風是人體嘌呤代謝異常所致的一組代謝性疾病,其生化基礎是高尿酸血癥(Hyperuricemia,HUA)。臨床上,當男性血尿酸水平大于7.0 mg/dL,女性血尿酸水平大于6.0 mg/dL即可確診為高尿酸血癥[1]。長期的高尿酸水平對血管、心臟、腎臟均會產生一系列不良后果,增加了患心腦血管疾病、高血壓、糖尿病及腎臟疾病等的風險[2-4]。目前,臨床用降尿酸藥物可以歸為三種類型:第一類是抑制尿酸生成類藥物,包括別嘌呤醇(Allopurinol)、非布索坦(Febuxostat)等;第二類是促進尿酸排泄類藥物,包括丙磺舒、苯溴馬隆、RDEA594等;第三類是促進尿酸分解類藥物,如培戈洛酶Pegloticase。這些西藥雖然藥效明顯,但容易引起嚴重過敏反應、胃腸道反應、骨髓抑制、肝功能損害等毒副作用[5-7]。因此,開發食品來源的、新型的、低毒副作用的降尿酸活性物質具有重要的意義。已有大量研究證明,黃酮類、酚酸類、生物堿類等活性物質均具有降尿酸作用[8],而對于生物活性肽和益生菌的降尿酸作用的研究尚處于起步階段[9-10]。本文主要圍繞高尿酸血癥的發病機制,對黃酮類、酚酸類、生物堿類、生物活性肽和益生菌等五類食品中降尿酸活性物質及其降尿酸機理的研究進展進行綜述,以期為開發降尿酸功能食品提供研究思路。

1 高尿酸血癥的發病機制

高尿酸血癥的發生主要與尿酸過度產生和尿酸排泄不足有關。體內尿酸的生成主要由嘌呤類代謝相關酶控制,而尿酸的排泄主要由尿酸重吸收蛋白和尿酸分泌蛋白調控(見圖1)。

圖1 體內尿酸生成和排泄途徑Fig.1 Uric acid production and excretion pathway in vivo

1.1 嘌呤類代謝相關酶調控尿酸生成

人體內的尿酸來源主要分為內源性和外源性兩方面,其中67%的尿酸是由體內核蛋白、核酸等物質分解代謝產生,而剩下的33%來源于食物中的嘌呤類物質[11]。在嘌呤類物質代謝成尿酸的過程中,腺苷脫氨酶(Adenosine deaminase,ADA)和黃嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase,XO)是調控尿酸生成的關鍵酶[12]。ADA屬于巰基酶,能催化腺嘌呤核苷生成次黃嘌呤核苷,再經過核苷磷酸化酶作用生成次黃嘌呤,最終被XO氧化生成尿酸[13]。XO是一種黃素蛋白酶,分子量為290 kDa,催化中心由兩個鐵-硫中心[2Fe-2S]、一個鉬蝶呤中心(Mo-pt)及一個黃素腺嘌呤二核苷酸(Flavin adenine dinucleotide,FAD)組成[14],其作用是將次黃嘌呤轉化成黃嘌呤,將黃嘌呤轉化成尿酸[15]。

1.2 尿酸重吸收蛋白和分泌蛋白調控尿酸排泄

人體內生成的尿酸約70%由腎臟排出,30%由腸道排出[16]。目前已發現多種轉運蛋白參與腎臟近曲小管尿酸的轉運過程,分為重吸收蛋白和分泌蛋白兩大類[17],分布在腎臟近曲小管頂端膜和基底外側膜。尿酸重吸收蛋白包括尿酸鹽陰離子轉運體1(Urate transporter 1,URAT1),葡萄糖轉運蛋白9(Glucose transporter 9,GLUT9),有機陰離子轉運體(Organic anion transporters,OATs)家族中的OAT4和OAT10及鈉偶聯單羧酸轉運體(Sodium-coupled monocarboxylate transporter,SMCT)[18-19],這些蛋白與尿酸自腎小管腔向上皮細胞內的重吸收有關。尿酸分泌蛋白包括OAT1、OAT2和OAT3,多藥耐藥蛋白4(Multidrug resistance associated protein 4,MRP4),鈉依賴性磷酸轉運蛋白(Sodium-dependent phosphate transporter proteins,NPTs)家族中的NPT1和NPT4,三磷酸腺苷結合轉運蛋白G超家族成員2(ATP-binding cassette,subfamily G,membrane 2,ABCG2)[20],與尿酸向小管腔分泌有關。若機體尿酸重吸收蛋白或分泌蛋白表達異常,造成尿酸重吸收增加或排泄減少,就會導致高尿酸血癥。

2 黃酮類降尿酸活性物質

黃酮類化合物是一大類多酚天然產物,廣泛分布于各種植物中。諸多黃酮類化合物具有多種生物學和藥理學活性[21],如木犀草素、芹菜素、槲皮素和落新婦苷等具有較強的降尿酸活性。木犀草素(Luteolin)是世界上廣泛用作食品的芹菜和青椒的主要組分之一,研究表明,木犀草素能在單個結合位點以疏水性相互作用與XO結合,競爭性地抑制黃嘌呤氧化酶的活性,其抑制常數(Ki)值為(2.38±0.05)×10-6mol/L[22]。芹菜素(Apigenin)是天然存在的一種黃酮類化合物,廣泛分布于溫熱帶的蔬菜和水果中。Miao等[23]發現芹菜素可以通過下調氧嗪酸鉀誘導的高尿酸小鼠腎臟中URAT1蛋白的表達,達到降低尿酸的目的。槲皮素(Quercetin)的化學結構中含有3,5,7-三羥基團,Nile等[24]從洋蔥廢渣中提取并分離得到槲皮素及槲皮素的多種苷類化合物,并研究發現槲皮素及槲皮素-3,4′-O-二糖苷的抗氧化活性及黃嘌呤氧化酶抑制活性最強,其XO抑制活性IC50分別為(10.5±0.06)、(15.3±0.02) μg/mL,陽性對照別嘌呤醇的IC50為(6.5±0.05) μg/mL,說明從植物提取物中獲得的黃酮類物質具有潛在的治療高尿酸血癥的應用前景。林戀竹等[25]對比了神秘果樹葉的乙醇、水提取物在氧嗪酸鉀誘導的高尿酸血癥大鼠體內的降尿酸作用,并采用現代色譜、波譜技術導向分離鑒定出3種槲皮素類化合物,為神秘果樹葉乙醇提取物用作保健食品功效因子提供了一定的理論依據。Adachi等[26-27]在探究別嘌呤醇、槲皮素及黃杉素(Taxifolin)的體外降尿酸作用時,以鳥苷和肌苷為前體物質建立了鼠源AML12肝細胞模型,通過測定平衡鹽溶液中尿酸含量的變化來反應三種物質對肝細胞吸收利用尿酸前體物質的抑制作用,并利用次黃嘌呤核苷酸和鳥嘌呤核苷酸誘導的高尿酸血癥小鼠模型分析驗證了降尿酸機理。XO在催化黃嘌呤、次黃嘌呤生成尿酸時,會產生超氧陰離子自由基、過氧化氫等,對機體造成損傷。而研究表明,落新婦苷(Astilbin)可以調節氧化應激和炎癥反應,從而降低尿酸和改善腎損傷[28]。諸多研究表明黃酮類化合物可以抑制黃嘌呤氧化酶的活性,特別是具有7-羥基的平面黃酮和黃酮醇[29-30]。Lin等[31]利用紫外光譜法和熒光滴定法研究了20種類黃酮的結構與XO抑制活性及親和力的關系,結果表明,疏水性相互作用在類黃酮與XO的結合中發揮重要作用,并且XO抑制活性通常隨著黃酮類和黃酮醇類與XO的親和力的增加而增加。

黃酮類物質由于其平面結構,羥基、雙鍵等位置的不同在XO抑制活性方面有所不同。木犀草素、芹菜素、槲皮素等黃酮或黃酮醇類物質較異黃酮、二氫黃酮等XO抑制活性更強,主要由于其平面結構較其他黃酮類物質更緊密,分子間引力也更強。

3 酚酸類降尿酸活性物質

酚酸類化合物系指在一個苯環上有多個酚羥基取代的芳香羧酸類化合物,具有增強免疫、抗氧化、抗菌消炎、降血脂等多種生理活性,在食品、醫藥領域有著廣泛的應用前景[32]。Honda等[33]研究表明富含酚酸類物質的菊花油能夠降低血清尿酸水平,其作用機理在于通過抑制肝臟中XO的活性來抑制尿酸的產生,并通過調節腎臟中尿酸轉運蛋白基因表達加速尿酸排泄。Chen等[34]以不同劑量的綠茶多酚提取物灌胃處理氧嗪酸鉀誘導的高尿酸血癥小鼠,發現總酚含量為81.41%的綠茶多酚提取物能夠顯著降低小鼠血尿酸水平(p<0.05),同時不同劑量均能極顯著抑制血清和肝臟中XO活性(p<0.01),下調肝臟中XO蛋白及腎臟中URAT1蛋白的表達水平(p<0.05),上調腎臟中OAT1及OAT3蛋白的表達水平(p<0.05)。白藜蘆醇是一種主要存在于虎杖、葡萄等植物中的多酚類化合物,Lee等[35]通過氧嗪酸鉀和尿酸混合物誘導的高尿酸血癥大鼠模型證明,白藜蘆醇能夠極顯著降低血清尿酸水平(p<0.001),且尿酸水平與腎臟中URAT1 mRNA的表達呈負相關,即白藜蘆醇能夠抑制腎臟中URAT1 mRNA的表達,從而減少尿酸在腎小管中的重吸收。Jiang等[36]以匙葉鼠曲草(Gnaphaliumpensylvanicumwilld.)提取物分別處理氧嗪酸鉀誘導的高尿酸血癥小鼠和單鈉尿酸鹽(MSU)誘導的急性痛風性關節炎(Gouty arthritis)小鼠,結果發現所有劑量的匙葉鼠曲草提取物均能極顯著降低尿酸含量(p<0.01)、抑制肝臟XO活性(p<0.01)、下調URAT1和GLUT9蛋白的表達水平(p<0.01),同時減少炎性細胞浸潤,改善MSU誘導的炎癥,同時通過UHPLC-ESI-MS/MS分析得知該提取物中主要的活性成分是13種咖啡酰奎寧酸衍生物。Ferraz-Filha等[37]通過高尿酸血癥和急性痛風性關節炎動物模型,證明咖啡酸和綠原酸均具有降尿酸和緩解炎癥的作用,其體外降尿酸IC50值分別為42.60、56.21 μmol/L。同時,與別嘌呤醇相比,綠原酸還能顯著降低高尿酸血癥大鼠血清肌酐和尿素氮的含量(p<0.05),對腎臟有較好的保護作用[38]。此外,迷迭香酸、菊苣酸等也都具有一定的XO抑制活性[39-40]。

酚酸類物質主要是通過抑制體內XO活性來減少尿酸的生成從而達到降尿酸的效果,少數是通過促進尿酸轉運和排泄從而減少尿酸的重吸收。因此,研究其他具有降尿酸活性的酚酸類物質可以聚焦于抑制XO活性。

4 生物堿類降尿酸活性物質

生物堿類是廣泛分布在自然界中化學結構相對較為復雜的天然產物活性成分之一,呈堿性,具有抗腫瘤、抗菌、降血壓等多種藥理活性。Sang等[41]探究了荷葉水提物中降尿酸的有效成分,通過UHPLC-Q-TOF/MS及分子對接證明蓮堿(Roemerine)與XO結合的關鍵在于氫鍵及疏水性相互作用,與非布索坦相比,蓮堿的結構可以完全滿足活性結合位點的要求,除了苯丙氨酸(L-Phenylalanine,Phe)914和1009以外,所有關鍵結合氨基酸殘基如亮氨酸(L-Leucine,Leu)648、873、1014,Phe 649和纈氨酸(L-Valine,Val)1011均與蓮堿有一定的相互作用。研究表明,甜菜堿通過調節高尿酸血癥小鼠腎臟有機離子轉運蛋白的表達水平而具有抗高尿酸血癥和腎臟保護作用[42]。同時,甜菜堿能顯著下調高尿酸血癥小鼠腎臟URAT1和GLUT9蛋白的表達水平,抑制尿酸的重吸收;通過上調mOAT1和ABCG2蛋白的表達水平,促進尿酸排泄。此外,甜菜堿還可上調HUA小鼠腎臟有機陽離子轉運體(Organic cation transporters,OCTs)家族的OCT1/2和有機陽離子/肉毒堿轉運體(Organic cation/carnitine transporters,OCTNs)家族的OCTN1/2的蛋白表達水平,對腎臟起到保護作用[43]。中藥青風藤具有祛風除濕、通絡止痛的作用,其主要成分青藤堿(Sinomenine)能有效降低痛風性關節炎大鼠滑膜中腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素(IL-1β)及環氧化酶-2(COX-2)的水平,減少前列腺素類的合成,抑制炎癥進一步擴大,緩解關節疼痛[44]。

生物堿類由于其復雜的結構和較強的生物活性,其在降尿酸方面的功效也不容忽視。它不僅可以通過抗炎癥來緩解痛風的癥狀,而且可以從促進尿酸排泄和抑制尿酸重吸收等方面發揮降尿酸的功能。

5 生物活性肽

生物活性肽是指通過發酵、酶解、化學水解等方式獲得的具有抗腫瘤、免疫調節、抗菌、鎮痛、抗炎癥等特殊生理作用的多肽,其肽鏈長短不一,結構各不相同[45]。近年來,隨著對生物活性肽研究的深入,具有XO抑制活性的食源性生物活性肽備受關注。

5.1 內源性生物活性肽

目前關于具有降尿酸活性的內源性生物活性肽的研究比較少,主要集中在肌肽及其類似物。肌肽是由β-丙氨酸和L-組氨酸組成的二肽,最早是在1900年被發現。肌肽及其類似物,如鵝肌肽、鯨肌肽等以游離的形式主要分布于哺乳動物和其他脊椎動物的骨骼肌中,具有抗氧化、抗衰老、抗聚糖、神經調節等作用[46]。Kubomura等[47]在男性受試者中進行了隨機的雙盲實驗,結果發現高劑量的含有咪唑化合物的金槍魚提取物與安慰劑相比顯著降低了血尿酸水平,并提出三個作用機制,一是金槍魚提取物中的咪唑化合物能夠促進次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶表達,降低次黃嘌呤和鳥嘌呤含量;二是促進乳酸脫氫酶的表達,催化丙酮酸和乳酸鹽的相互轉化,激活URAT1,促進尿酸的再吸收和尿排泄;三是肌肽被血液吸收,通過肌肽酶水解成π-甲基組氨酸和β-丙氨酸,通過質子緩沖能力,穩定尿液的pH,提高尿酸的溶解度并加速尿酸排泄。Otsuka等[48]首次利用HEK293-URAT1細胞探究了β-丙氨酸、1-甲基組氨酸、3-甲基組氨酸、肌肽和鵝肌肽硝酸鹽的降尿酸機理,結果表明,肌肽、鵝肌肽硝酸鹽及3-甲基組氨酸均能夠抑制URAT1及XO活性,由此可以得出咪唑環本身或甲基的位置對其降尿酸活性有一定的影響,同時得到市售鵝肌肽硝酸鹽的降尿酸IC50為(6.45±1.57) mmol/L。

5.2 外源性生物活性肽

外源性生物活性肽主要是通過可控酶解法對蛋白質進行水解,以獲得具有不同生物活性的肽類產物。Nongonierma等[49-50]利用胰酶和胃蛋白酶酶解牛乳蛋白制備二肽,在制備得到的12種二肽中,只有含有色氨酸(L-Tryptophan,Trp)的二肽表現出XO抑制活性,通過分子對接技術發現Trp與XO的第二結合位點結合,屬于非競爭性抑制。劉丹等[51]利用LO2細胞構建體外高尿酸血癥細胞模型,在尿酸生成途徑中的中間產物腺苷的誘導下,添加一定濃度的黃嘌呤氧化酶孵育,模型組尿酸生成量顯著增加,當添加一定濃度的乳清蛋白肽時,尿酸生成量相對于模型組顯著降低,這表明乳清蛋白肽具有降尿酸的效果。Murato等[52]發現鯊魚軟骨的Alcalase水解物中含有降尿酸活性的多肽,靜脈注射Tyr-Leu-Asp-Asn-Tyr和Ser-Pro-Pro-Tyr-Trp-Pro-Tyr小分子肽能夠降低血清尿酸水平,但是其在體外時并沒有XO抑制活性。而一些來源于這些小分子肽的二肽或三肽如Asp-Asn卻表現體外XO抑制活性,這可能是Tyr-Leu-Asp-Asn-Tyr等在消化吸收的過程中分解成更小的肽段，從而發揮XO抑制活性或誘導了內源性XO抑制劑的活性。Li等[53]發現核桃粉水解物和脫酚核桃粉水解物在體外和體內實驗中均表現出降尿酸活性,通過葡聚糖凝膠柱及RP-HPLC分離和LC-ESI-MS/MS分析鑒定,得到兩種降尿酸肽WPPKN和ADIYTE,并利用分子模擬得到,WPPKN能進入疏水通道,從而阻斷黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶之間的相互作用,而ADIYTE位于B鏈表面,能阻止底物進入疏水基團渠道。趙謀明等[54]以中性蛋白酶和胰酶水解秋刀魚制備XO抑制肽,采用響應面分析法研究了加酶量、酶解時間和中性蛋白酶所占比例對酶解氮回收率及XO抑制活性的影響,并通過肽分子量分布得到該秋刀魚酶解產物以小于3 kDa的肽段為主,說明小分子肽更易具有降尿酸活性。Li等[55]通過高尿酸血癥大鼠模型評價比較了狐鰹酶解物、脫酚核桃酶解物和大豆蛋白酶解物的體內降尿酸作用,發現狐鰹酶解物能夠顯著抑制XOD活性,同時能夠減緩腎臟損傷,經過分離純化鑒定后獲得體外具有XOD抑制活性的六肽和三肽。

生物活性肽由于其來源廣泛且較其他生物活性物質更易獲得,在降尿酸方面具有得天獨厚的優勢。活性結構方面,發揮降尿酸活性的成分主要是小分子肽類物質;作用機制方面,生物活性肽類物質并不是通過直接抑制XO活性來發揮作用,而可能是其體內代謝物具有XO抑制活性或者通過其他途徑來達到降尿酸的效果。因此,生物活性肽類物質的降尿酸機理還需從代謝轉運及其作用通路開展更深入的研究。

6 益生菌

人體經過進化,體內缺乏有生物活性的尿酸氧化酶,因而尿酸就是嘌呤類物質代謝的最終產物。益生菌作為腸道重要的生理菌群,具有增強免疫系統等多種益生功效,同時含有尿酸氧化酶,可以將尿酸代謝成為水溶性好、對人體無毒的尿囊素。金方等[56]從多株實驗菌株中篩選獲得了具有降解核苷酸、核苷、嘌呤及尿酸能力最強的益生菌,最后篩選得到了具有較強降解核苷酸與核苷能力的LactobacilluscaseiZM15,并通過高尿酸血癥大鼠模型驗證其降尿酸作用。Li等[57]從酸白菜中篩選得到三株具有快速降解肌苷和鳥苷能力的乳酸菌,并通過比較這三株菌的耐酸性、膽汁耐受性、抗病菌、細胞粘附力、抗生素抗性和過氧化氫產生能力等進一步篩選得到LactobacillusplantarumWCFS1的相似株DM9218。Yamada等[58]通過同位素標記、體外HPLC測定發現LactobacillusgasseriPA-3(PA-3)表現出較強的14C-腺嘌呤、14C-腺苷和14C-AMP吸收能力,并通過動物模型進一步發現PA-3能夠吸收14C-IMP、14C-肌苷和14C-次黃嘌呤,繼而減少尿酸的合成[59]。基于對PA-3的研究,日本明治株式會社的PA-3益生菌產品目前已在日本上市。此外,通過一定手段改良的益生菌也可以具有它們最初未有的能力。Bai等[60]通過尿毒癥血清誘導并利用物理和化學方法改良Lactobacillusdelbrueckiissp.bulgaricus,發現該菌被誘導出降解尿酸以及其他尿毒癥毒素的能力。

以上研究均認為,益生菌能降解尿酸的前體物質從而降低尿酸水平。由于腸道菌群本身是一個復雜的微生態體系,因此相關作用機制也較為復雜,有待新一輪的證據來證明益生菌降尿酸的作用機制。

7 結論與展望

近年來高尿酸血癥及痛風的患病率急劇升高,但臨床治療使用的藥物品種有限,并且具有明顯的毒副作用,因此迫切需要開發高效低毒的降尿酸活性物質。本文綜述了黃酮類、酚酸類、生物堿類、生物活性肽和益生菌等五類食品中降尿酸活性物質及其降尿酸機理的研究進展,其中黃酮類、酚酸類、生物堿類等活性物質防治高尿酸血癥效果確切,主要是通過影響嘌呤代謝中的關鍵酶及調控尿酸鹽轉運蛋白的表達,進而發揮降尿酸功效,具有多環節、多層次、多靶點的調控機制。但在體外XO活性抑制實驗、細胞實驗和高尿酸血癥動物模型實驗體系中,同一活性物質對相同生化指標的影響有時并不一致,有待進一步建立規范標準的評價體系;且體內實驗的測定指標多側重于血清和肝臟中XO活性以及腎臟中肌酐、尿素氮等的含量,缺乏更為深入的基因組學和蛋白組學的分析,同時這些活性物質的提取成本極高,極大地限制了他們的實際應用。相比之下,蛋白來源的小分子降尿酸生物活性肽具有制備成本低、安全性高、易吸收等特點,逐漸成為降尿酸領域的研究熱點,但目前的研究存在研究對象狹窄、構效關系不明確、作用機理不清晰等問題,有待進一步深入研究。作為腸道重要的生理菌群,益生菌的降尿酸作用研究尚在起步階段,其降尿酸作用機理缺乏更為全面系統的深入研究。此外,對食品中降尿酸活性物質的作用機理研究多停留在動物水平,缺乏大規模的臨床試驗證據。

從多角度發掘食品中黃酮類、酚酸類、生物堿類、生物活性肽和益生菌等降尿酸活性物質,明確其降尿酸作用機理,真正實現在防治高尿酸血癥及痛風的臨床應用,已成為該領域亟待解決的問題。