潰結寧膏穴位敷貼對潰瘍性結腸炎（脾腎陽虛證）大鼠TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的影響

鄭潔， 朱瑩， 高昂

（1.浙江省瑞安紅十字醫院，浙江溫州 325200；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南長沙 410007；3.湖南省長沙市望城區人民醫院，湖南長沙 410200）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病。該病多呈反復發作的慢性病程，治療難度大，復發率高，具有一定的癌變率。流行病學研究表明，UC發病率在我國呈現明顯增長趨勢[1]。控制UC的發生發展具有重要的意義。臨床UC患者常見不同程度的脾腎陽虛表現，亦有學者通過系統檢索對UC中醫證候進行整理，提示脾腎陽虛型發生率居各證型之首[2]。潰結寧膏是由本課題組負責人朱瑩教授通過總結治療UC（脾腎陽虛證）的經驗而創制的。該穴位敷貼療法基于中醫辨證和經穴——臟腑相關理論指導，結合藥物吸收與穴位刺激共同發揮溫腎暖脾、活血化瘀之效，療效確切，中醫特色鮮明，已成為國內外重點開發的外治給藥途徑[3，4]。本研究觀察潰結寧膏穴位敷貼對UC（脾腎陽虛證）模型大鼠ToU樣受體4（TLR4）/髓樣分化因子88（MyD88）/核轉錄因子kappaB（NF-κB）信號通路的影響，探討其作用機制，以期為臨床治療UC提供更多的科學依據，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物SPF級雄性SD大鼠40只，體質量（200±20）g，由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供，動物質量合格證號為SCXK（湘）2011-0003，SPF級實驗室許可證號為SYCK（湘）2013-0005。實驗室溫度恒定20～26℃，濕度控制40%～70%，飼養環境為多層層流架，標準飼料喂養，三級過濾純凈水自由飲用。大鼠適應性喂養1周后開始實驗。

1.2藥品潰結寧膏穴位敷貼的藥物組成：炮附子、細辛、延胡索、赤芍、丁香、白芥子、生姜；無藥物的巴布劑基質敷貼的藥物組成：聚丙烯酸鈉、明膠、高嶺土、甘羥鋁、蓖麻油、甘油、聚乙烯醇。均由湖南中醫藥大學第二附屬醫院藥劑科制成直徑0.4 cm、厚0.25 cm的藥餅。柳氮磺胺吡啶片（SASP），購自上海三維制藥有限公司。

1.3試劑與儀器2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS，美國Sigma公司）；腺嘌呤（美國Sigma公司）；TLR4、MyD88、NF-κB的PCR引物（英駿生物技術有限公司）；反轉錄試劑盒（德國羅氏試劑）；TLR4、NF-κB、MyD88抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；免疫組化試劑盒DAB顯色劑（上海拜力生物科技有限公司）。Neofuge 15R臺式高速冷凍離心機（力康生物科技有限公司）；FBZ2001-up-p標準試劑型純水儀（青島富勒姆科技有限公司）；Step One Plus熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；RM2016病理切片機（武漢俊杰電子有限公司）；CIC XSP-C204顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；TYXH-II渦旋混合器（天悅電子有限公司）。

1.4分組與造模將40只健康的SPF級SD雄鼠被毛染色編號、稱體質量后按照隨機數字表分為正常組、模型組、敷貼組和SASP組，每組10只。UC（脾腎陽虛證）大鼠模型建立方法參考課題組前期研究[5]：每天給予大鼠番瀉葉、腺嘌呤分階段灌胃，連續4周后于第29天禁食不禁水24 h，經麻醉后，將聚丙烯管插入大鼠肛門上段8 cm處，將TNBS按100 mg/kg（約TNBS原液0.2 ml/100 g）加體積分數50%乙醇混合制成的試劑充分注入大鼠腸腔，然后輕放回籠子，自由飲食飲水。正常組大鼠則同期給予相應劑量的9.0 g/L氯化鈉注射液灌胃和灌腸處理。

1.5干預方法選穴定位參考郭義主編的《實驗針灸學》中常用動物穴位定位法、擬人比照法[6]，大鼠穴位圖譜[7]研制如下：中脘、氣海、足三里、天樞。大鼠選定穴位后進行備皮，貼藥后予鼠夾固定。正常組和模型組：給予巴布劑基質穴位敷貼加生理鹽水（5 mL/kg）灌胃；敷貼組：潰結寧膏穴位敷貼加生理鹽水（5 mL/kg）灌胃；SASP組：巴布劑基質穴位敷貼加SASP溶液（用生理鹽水配成10 mg/mL的溶液）50 mg/kg灌胃。各組于造模結束后1周開始給藥，每天1次，敷貼時間每次1～1.5 h，足三里、天樞每次貼一側，左右交替，給藥療程均為28 d。

1.6指標檢測與方法

1.6.1 標本采集 治療完成后大鼠禁食12 h，腹腔注射麻醉，剪開腹壁，快速剖取結腸組織，并肉眼觀察組織，對結腸大體形態和黏膜組織損傷作出評分。取病變腸段分別進行蘇木素——伊紅（HE）染色、RT-PCR實驗及免疫組化等相關檢測。1.6.2 一般情況觀察 實驗期間每天觀察大鼠體質量、飲食飲水、大便形狀及精神活動等一般狀況。

1.6.3 結腸炎癥評價指標 ①疾病活動指數（DAI）：結合大鼠性狀，按DAI標準[8]進行評分。②結腸黏膜損傷指數（CMDI）：肉眼觀察結腸組織，以正常、糜爛、潰瘍分級描述，進行結腸組織大體形態損傷指數評分[9]。③結腸組織學損傷指數（TDI）：病變組織經HE染色后光學顯微鏡下觀察組織病理學改變，進行結腸組織學損傷評分[10]。

1.6.4 免疫組化法檢測TLR4、MyD88、NF-κB蛋白的表達 TLR4陽性表達為胞質或胞膜內呈現棕黃色，MyD88陽性表達為胞質、胞膜或胞核呈現棕黃色，NF-κB陽性表達為細胞質和細胞核，以細胞核為主呈現，計算鏡下照片中陽性區域的累積光密度（IOD）值。蛋白陽性表達強度以IOD值表示。

1.6.5 逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測TLR4、MyD88、NF-κB mRNA的表達 Trizol提取結腸組織總RNA進行RT-PCR擴增。TLR4上游引物5’-TATCCAGAGCCGTTGGTGTATCT-3’，下游引物為5’-AATGAAGATGATGCCAGAGCG-3’，擴增片段為85 bp；MyD88上游引物為5’-CGAGGA GGACTGCCAGAAATAC-3’，下游引物為5’-CAG TAGCAGATGAAGGCGTCG-3’，擴增片段為177 bp；NF-κB上游引物為5’-GCTCCTTTTCTCAAGC CGATGT-3’，下游引物為5’-CGTAGGTCCTTTTG CGTTTTTC-3’，擴增片段為210 bp。95℃，15 s→60℃，60 s，循環40次。采用Image Lad凝膠成像系統軟件獲得灰度積分值，并與內參β-actin相比計算比率，其結果表示目的基因的相對表達水平（p）。

1.7統計方法采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差(-x±s)表示，檢驗各組數據正態性及方差齊性，多組間比較用單因素方差分析，方差齊性時用LSD法，方差不齊時用Tamhane’s法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1大鼠一般情況從造模第2周開始直至造模結束，大鼠相繼出現神態萎靡，嗜睡懶動，毛發稀疏無澤，易脫毛，甚則拱背蜷縮聚堆，小便清長，大便變軟，甚則糞便溏瀉，肛門周圍沾有污物，飲食及飲水量明顯降低，體質量增長幅度較正常組大鼠明顯減小，部分甚至出現腹部脹滿。經過28 d治療后，敷貼組及SASP組大鼠癥狀、體征均有不同程度改善，體質量增長，且飲食及飲水量增加，基本接近正常組。模型組大鼠癥狀體征持續，甚則加重，體質量較前繼續下降，飲食及飲水量進一步減少。

2.2各組大鼠結腸炎癥評分比較與正常組比較，模型組、敷貼組、SASP組疾病活動指數、結腸黏膜損傷指數及結腸組織損傷指數評分明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，敷貼組及SASP組大鼠疾病活動指數、結腸黏膜損傷指數及結腸組織損傷指數評分明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.01），但敷貼組與SASP組間差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表1。

表1 各組大鼠疾病活動指數、結腸黏膜損傷指數、結腸組織損傷指數評分比較Table 1 Comparison of the scores of DAI，CMDI and TDI in various groups （-x±s，s/分）

2.3各組大鼠結腸組織病理變化比較正常組：結腸黏膜、黏膜下層、肌層各層均未見明顯異常，腺體結構清晰，無炎性細胞浸潤。模型組：結腸黏膜呈缺損及壞死脫落狀，形成潰瘍灶，嚴重者深達黏膜下層，局部組織充血、水腫明顯，伴中性粒細胞、淋巴細胞等大量炎性細胞浸潤。敷貼組：黏膜缺損及潰瘍較少，腺體結構排列尚規則，伴有炎性細胞少量浸潤。SASP組：黏膜下毛細血管充血，黏膜下層稍有水腫，少量炎性細胞浸潤。結果見圖1。

圖1 各組大鼠結腸組織病理變化比較（HE染色法，×100）Figure 1 Comparison of the pathologic features in colonic tissues of various groups（by HE staining method，×100）

2.4各組大鼠結腸組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達比較與正常對照組比較，模型組、敷貼組及SASP組大鼠結腸組織TLR4、MyD88、NF-κB表達增強（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，敷貼組及SASP組TLR4、MyD88、NF-κB表達水平均明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.01），但敷貼組與SASP組間差異沒有統計學意義（P＞0.05）。結果見表2。

正常組：結腸組織僅有微量TLR4、MyD88表達，主要分布在黏膜下層和固有層炎性細胞胞質及胞膜中，NF-κB呈微弱表達，以細胞核為主。模型組：結腸組織TLR4、MyD88及NF-κB均呈強陽性表達，主要以結腸表面上皮細胞、單核細胞、漿細胞及中性粒細胞等炎性細胞為主要分布，TLR4、MyD88以胞質和胞膜為主，NF-κB以細胞核為主，染色呈彌漫或顆粒性深棕黃色或褐色粗顆粒分布。敷貼組、SASP組：結腸組織TLR4、MyD88及NF-κB均呈散在陽性表達，弱于模型組。結果見圖2～4。

2.5各組大鼠結腸組織TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達比較與正常組比較，模型組、敷貼組、SASP組大鼠結腸組織TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達水平均升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，敷貼組及SASP組TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達水平明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.01），但敷貼組與SASP組間差異沒有統計學意義（P＞0.05）。結果見表3。

表2 各組大鼠結腸組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達比較Table 2 Comparison of the expression of TLR4，MyD88，and NF-κB in colonic tissues of various groups (-x±s)

圖2 各組大鼠結腸組織TLR4免疫組化結果（×200）Figure 2 The immunohistochemical results of TLR4 in colonic tissues of various groups（×200）

圖3 各組大鼠結腸組織MyD88免疫組化結果（×400）Figure 3 The immunohistochemical results of MyD88 incolonic tissues of various groups（×400）

圖4 各組大鼠結腸組織NF-κB免疫組化結果（×400）Figure 4 The immunohistochemical results of NF-κB in colonic tissues of various groups（×400）

表3 各組大鼠結腸組織TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達比較Table 3 Comparison of the mRNA expression of TLR4，MyD88，and NF-κB in colonic tissues of various groups （-x±s，p）

3 討論

潰瘍性結腸炎屬于中醫學“泄瀉”、“痢疾”等范疇，《景岳全書》曰：“凡里急后重……而其病本，則不在廣腸，而在脾腎”。正所謂脾主一身之運化，腎寓一身之真陽，泄瀉日久，脾陽不振，土不制水，致腎陽不足，則不能溫養脾胃……濕壅滯腸絡，搏結氣血，氣血瘀滯，血敗肉腐，內潰成瘍，發為本病[11]。因此，本課題組負責人朱瑩教授認為，UC雖病位在腸，但可累及脾腎之臟，脾腎陽虛是UC反復發病的根本病機。基于多年的臨床經驗及前期研究，課題組采用自制的潰結寧膏，結合穴位敷貼療法治療UC，臨床效果顯著。膏方以炮附子、細辛、丁香、延胡索、赤芍、生姜、白芥子等作為主要組成，炮附子、細辛、丁香溫脾腎而散寒凝，延胡索、赤芍散瘀止痛，白芥子、生姜增強藥物透皮性。在此基礎之上結合經穴——臟腑相關理論選取中脘、氣海、足三里、天樞作為敷貼主穴，循經絡“聯系上下，溝通表里”，共奏溫腎暖脾、活血化瘀之效[12]。

現代醫學對UC的發病機制尚未完全明確，隨著黏膜免疫系統的深入研究，發現TLRs家族中的TLR4介導的信號轉導通路是UC發病過程中的重要環節[13]。TLR4介導信號通路主要通過識別配體后再與其主要接頭蛋白MyD88相結合進行胞內信號轉導，最終導致關鍵轉錄因子NF-κB的激活，使效應細胞分泌腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-8（IL-8）等細胞因子，從而破壞腸道免疫穩態，最終導致UC發生。目前已有研究表明TLR4/MyD88/NF-κB信號通路參與介導脾腎陽虛型UC的發病過程[14，15]。吳氏等[14]研究發現脾腎陽虛型UC大鼠模型結腸組織TLR4、NF-κB的基因與蛋白表達明顯增強，與正常組差異顯著，經“溫腎暖脾，澀腸止瀉”方藥進行干預治療后，脾腎陽虛型UC大鼠模型結腸組織TLR4水平呈下降趨勢，且大鼠證候改善明顯。

本實驗結果顯示，模型組大鼠一般情況、腸道炎癥指數評分、病理組織學形態方面均較正常組差，結腸組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達明顯增高，提示模型組大鼠結腸組織炎癥失調、TLR4/MyD88/NF-κB信號通路則呈現高表達狀態。敷貼組及SASP組大鼠一般情況、腸道炎癥指數評分、病理組織學形態方面較模型組明顯改善，TLR4、MyD88、NF-κB蛋白水平下降，表明潰結寧膏穴位敷貼可有效治療UC（脾腎陽虛型），其作用機制可能是通過抑制TLR4的表達，下調MyD88表達從而抑制NF-κB的活化，阻斷TLR4介導信號通路的轉導，從而減輕機體炎癥反應。