與植物抗逆相關的miR-398-3p基因家族進化分析及靶基因預測

薛巨坤 王博 王蓮萍

摘要：通過生物信息學方法對miR-398-3p基因家族進行序列分析和靶基因預測。結果表明，大部分miR-398-3p基因分布在不同的染色體上，miR-398-3p序列在不同物種間具有高度的保守性。進化分析結果表明，miR-398-3p基因家族的成員呈現為7個分支，個別物種miR-398-3p的不同成員具有較遠的親緣關系;miR-398-3p的靶基因具有超氧化物歧化酶[Cu-Zn]、花粉特異性蛋白質SF3、鋅指蛋白WIP2、C2H2型鋅指家族蛋白等功能，參與植物的生物和非生物脅迫及生長發育調控過程。

關鍵詞：miR-398-3p;生物信息學;靶基因;植物抗逆

中圖分類號：Q7? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）14-0141-07

Abstract： In this paper， the miR-398-3p gene family were analyzed by bioinformatics method and the target genes were predicted. The results showed that most miR-398-3p genes were scattered on different chromosomes， and the miR-398-3p sequence was highly conserved among different species. The miR-398-3p gene family showed that the miR-398-3p gene was composed of seven branches， and the different members of miR-398-3p had a distant genetic relationship. The miR-398-3p family regulated superoxide dismutase[Cu-Zn]， pollen-specific protein SF3， zinc finger protein WIP2， C2H2 type zinc finger family protein and other respects， were involved in plant biological and abiotic stress and growth and development control process.

Key words： MiR-398-3p; bioinformatics; target gene; plant resistance

微小RNA（miRNA）是一類內源性小RNA（21～24個核苷酸），通過在轉錄后水平調控基因表達，在植物和動物的發育中起關鍵作用[1]。成熟的miRNA衍生自單鏈RNA轉錄，其含有不完全的莖-環二級結構，其形成并加工成細胞核中的miRNA雙鏈體的發夾結構，然后被轉運到細胞質起到一定的作用[2]。成熟的miRNA通過形成miRNA誘導的沉默復合物（miRNA-induced silencing complex，miRISC）與靶標mRNA互補配對結合，并對其進行剪切或抑制翻譯，實現對靶標基因的負調控[3]。研究表明，miRNA具有調控生物體生長發育、激素分泌與信號傳導以及對外界環境脅迫的應答能力[4]。

近年來，關于miRNA在植物脅迫中的作用機理有一定的研究。陸生植物在生長過程中會遭遇諸多不可預知的環境脅迫，如鹽堿、干旱、蟲害及病害的侵擾。植物需要啟動自身特殊機制來應對這些脅迫，已進化出極為精細復雜的生理和分子調控機制。例如植物自身會調控某些miRNA的生成與表達，通過miRNA作用靶基因在轉錄和翻譯水平調控基因的表達，并通過基因之間的作用，最終抵抗逆境[5]。在已知的眾多參與植物抗逆過程的miRNA中，miR398是第一個被發現受逆境脅迫負調控的miRNA，直接與脅迫應答網絡相關。miR398在調節植物銅代謝平衡、應答過量的銅、鐵、鎘等重金屬脅迫、蔗糖、臭氧、鹽害等其他非生物脅迫，以及病原菌生物脅迫中均扮演重要角色[6]。有研究表明，人參（Panax ginseng C.A.Mey）中miR398在環境脅迫響應中發揮重要作用，通過miR398的表達水平逐步降低，進而提高靶基因CSD的表達水平，可以提高人參應對高鹽和高銅環境脅迫的能力[7]。杜馳等[8]研究發現花花柴[Karelinia caspia（Pall.）Less]在鹽脅迫過程中，短時間內鹽脅迫會導致KcmiR398下降，致使KcCSD1表達量升高以應對鹽脅迫。Raja等[9]發現小麥（Triticum

aestivum L.）miRNA的表達水平分別受紫外線輻射、連續光和熱的影響，約55%miRNA，包括控制參與信號轉導途徑和開花活化的miR398、miR528和miR156等下調表達，通過轉錄后調控，使小麥能夠抵抗非生物脅迫，尤其是高溫脅迫。Valdés-López等[10]在對菜豆（Phaseolus vulgaris）的研究中發現，由于缺氮或缺鐵并且銅的含量增加使得miR398與miR408表達下調，對植物抗逆起調控作用。有研究表明，miR398表達水平降低，而銅鋅超氧化物歧化酶水平升高，使葡萄風信子（Muscari botryoides Mill.）和小麥能夠抵抗干旱脅迫[11，12];冬小麥的抗寒性是由miR398調控其靶基因CSD而發揮作用[13]。賀曉麗等[14]發現在miR398過表達煙草（Nicotiana tabacum L.）植株中，PR5的表達受到明顯的抑制，初步判斷二者之間存在負調控關系。由于PR5和CSD均屬于抗性基因，會應對各種脅迫，因此番茄（Lycopersicon esculentum Mill）中的miR398下調表達起到抗逆作用。Lu等[15]發現高溫可以誘導擬南芥[Arabidopsis thaliana（L.）Heynh]miR398表達，使其靶基因CSD2下調表達，通過熱誘導型miR398對CSD2的下調是擬南芥熱應激反應基因表達和耐熱性所必需的，使擬南芥更加耐高溫。顏秦峰等[16]通過構建miR398過表達的轉基因煙草，在分子水平上對其抗旱性進行研究，通過轉miR398b T1代植株，在干旱條件下發現煙草的抗旱性增加，說明了miR398的表達促進了植物的抗旱作用。Guo等[17]研究發現了椪柑（Citrus reticulata Blanco cv.Ponkan）cre-miR398b和cre-CSD的表達呈現負相關，表明miR398b對CSD的調控在體外保護椪柑中起重要作用。植物通過miR398的上調表達或下調表達對其抗逆進行調控。研究不同植物中miR398的表達情況與抗逆的關系，對于植物抗逆調控機理研究具有重要的意義。

本研究利用生物信息學方法檢測了miR-398-3p在不同物種中的基因組定位情況并對其基因家族成員進行同源性和靶基因預測分析，為進一步研究miR-398-3p靶基因的功能和相關抗逆機制提供了重要的理論基礎。

1? 材料與方法

1.1? miR-398-3p序列檢索及分析

從miRBase（http：//www.mirbase.org/）網站獲取31種植物的58條miR-398-3p基因成熟序列。

1.2? miR-398-3p基因家族成員的多序列比對及保守位點分析

利用在線工具Clustalw（http：//www.genome.jp/tools/clustalw/）對miR-398-3p基因家族的成熟序列進行多序列比對和分析。

1.3? miR-398-3p基因家族成員系統進化樹的構建

利用MEGA5.1軟件構建miR-398-3p基因家族成員的成熟序列系統進化樹。

1.4? miR-398-3p靶基因的預測

以gma-miR-398（雙子葉植物大豆）和ghr-miR-398（雙子葉植物陸地棉）為研究對象利用psRNATarget（http：//plantgrn.noble.org/v1_psRNATarget/）和BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）軟件在線預測miR-398-3p靶基因。

2? 結果與分析

2.1? miR-398-3p基因家族及在基因組中的定位分析

利用生物信息學方法，在miRBase數據庫中在線檢索所有物種中的miR-398-3p，結果見表1。由表1可知，31個植物物種中存在miR-398-3p，大部分miR-398-3p基因分散在不同的染色體上，也有少部分miR-398-3p基因位于同一染色體上，如ath-miR398b、ath-miR398c、mtr-miR398a-3p、mtr-miR398b成熟序列分別位于擬南芥和蒺藜苜蓿的5號染色體上，vvi-miR398b和vvi-miR398c成熟序列都位于葡萄6號染色體上。此外，火炬松、南歐丹參、刺菜薊、無油樟、白菜、花生、小麥、陸地棉、甜橙、向日葵、煙草、高粱、甘藍miR-398-3p基因家族成員都只有1個拷貝，其余的都是多拷貝，如擬南芥miR-398-3p基因家族成員有3個拷貝、水稻miR-398-3p基因家族成員有2個拷貝。

2.2? miR-398-3p基因家族序列分析

利用在線工具Clustalw對miR-398-3p家族進行成熟序列的比對，結果見圖1。由圖1可知，31個物種miR-398-3p成熟序列的相似度較高，保守序列為UGUUCAGGUCCCCC。在堿基方面，僅有ssl-miR-398、lus-miR398d、lus-miR398e、ppe-miR398b的一個堿基由U變成了C，火炬松的兩個堿基由UC變成了CA，ahy-miR398、lus-miR398c缺失了一個堿基U，這些可能由于進化過程中的基因突變問題導致。在位置方面，白菜、節節麥的miR-398-3p基因保守序列均位于35個堿基處;向日葵和陸地棉的miR-398-3p基因保守序列位于68～84位的14個堿基處，其余的物種miR-398-3p基因保守序列位于100～150個堿基處，表明miR-398-3p在不同物種間具有高度的保守性，但堿基的位置有一定差異。

2.3? miR-398-3p基因家族系統進化樹的分析

利用MEGA5.1軟件采用鄰接法對miR-398-3p基因家族成員構建系統進化樹，進行分子進化規律的研究，結果見圖2。由圖2可知，miR-398-3p基因家族的成員呈現7個分支。31個物種先由火炬松pta-miR398產生為兩大分支，無油樟atr-miR398單獨分支，而剩下的物種進一步分為5個分支。無油樟的成熟序列miR-398-3p與其他物種的成熟序列miR-398-3p存在一個堿基的差異，導致了無油樟在進化方面也與其他物種屬于不同的分支。而馬鈴薯stu-miR398a基因，不是聚在某幾個分支，而是分散在整個進化樹中，是一個單獨的分支，與其他stu-miR398基因家族成員的親緣關系較遠。這說明miRNA基因可能存在特殊的進化機制，需要進一步研究。

2.4? miR-398-3p靶基因的預測

大豆含miR-398-3p基因拷貝數比較多，陸地棉miR-398-3p是單拷貝，二者是比較常見的物種。兩種植物都屬于雙子葉植物，利用這兩個物種的miR-398-3p進行靶基因預測，有利于對miR-398-3p基因家族的靶基因進行較詳細全面的分析。利用在線軟件psRNATarget和BLAST進行miR-398-3p的靶基因預測，結果見表2。從表2可以看出，miR-398-3p基因家族靶基因的功能涉及范圍較廣，有zf-C2H2_4結構域蛋白、C2H2型鋅指家族蛋白、超氧化物歧化酶[Cu-Zn]、花粉特異性蛋白質SF3、鋅指蛋白WIP2、GATA型鋅指轉錄因子家族等。在同一物種中，不同種類的miR-398-3p靶基因具有相同的功能，如大豆中靶基因TC421780和TC423529都具有花粉特異性蛋白SF3的功能;在不同物種中miR-398-3p的靶基因也具有相同的功能，如大豆的靶基因TC452415，陸地棉的靶基因TC267083，都具有Cu-Zn超氧化物歧化酶和超氧化物歧化酶的功能，說明miR-398-3p基因家族不僅序列在物種間高度保守， 有些靶基因功能也較保守。也有少數miR-398-3p的靶基因功能表現出物種特異性， 如GATA型鋅指轉錄因子家族即為miR-398-3p在陸地棉中特有的靶基因。miR-398-3p的靶基因具有花粉特異性蛋白SF3、超氧化物歧化酶、銅鋅超氧化物歧化酶等功能，這些基因影響植物的生長發育，并在植物應對在非生物和生物脅迫中產生氧化應激作用，說明miR-398-3p在植物中有廣泛的調控功能。

3? 討論

miR398可以參與植物的抗逆過程，在鹽堿、干旱、重金屬等環境下參與相關的調控，在不同植物的抗逆過程中起到了不同的作用。如Guan等[18]通過研究發現在擬南芥中成熟的miR398表達受熱脅迫誘導，通過靶基因（CSD1、CSD2和CCS）下調表達，抵御熱脅迫。研究發現在N缺乏時，擬南芥中的miR398被抑制來抵抗缺N的脅迫[19]。超氧化物歧化酶（SOD）在幾乎所有細胞中的抗氧化防御中起重要作用，并且被推測與植物對生物和非生物脅迫（如干旱、鹽、重金屬和病原體攻擊）的抗性密切相關[20]。在木薯（Manihot esculenta crantz）中，由于氧化損傷造成的環境脅迫，轉基因木薯顯示細胞溶質Cu/Zn SOD和過氧化物酶體CAT1表達增加，表現出抗其他非生物脅迫的抗性[21]。此外還發現一些miRNA受脅迫上調或下調，意味著它們可以在植物對非生物和生物脅迫的抗性中起重要作用，如在缺水的條件下，豌豆（Pisum sativum Linn）根和芽中miR398a/b表達下調，其潛在的靶基因超氧化物歧化酶（CSD1）的上調表達，在豌豆抵抗缺水脅迫反應中起作用[22]。并且miR398在一些豆類植物中也能夠起到抗逆的作用，如miR398b介導的CSD和Nod19的上調表達與常見的豆類植物在對在非生物和生物脅迫中產生的氧化應激反應相關[23]。Chen等[24]研究發現，在轉基因擬南芥中miR398下調表達，兩個靶基因CSD1和CSD2分別上調表達，提高了擬南芥冷凍耐受性。此外miR398可以調控PetE2基因將3種主要葉綠體銅蛋白、質體蛋白、CCS1和Csd2的表達與擬南芥體內銅水平聯系起來[25]。植物在某種礦物質營養物質缺乏時，其他營養物質的代謝將被調整以保持適當的生長發育。研究表明，在擬南芥中，銅（Cu）缺乏誘導miR397、miR398、miR408和miR857表達并調控銅蛋白的下調表達來抵御營養素不平衡的脅迫[26]。上述研究均表明，miR398大多通過調控其靶基因CSD1、CSD、CCS1等的表達對植物抗逆起重要作用。通過軟件也預測到了miR-398-3p的靶基因具有銅鋅超氧化物歧化酶、SOD等的功能，與植物抗逆相關。此外，Chen等[27]研究發現在玉米種子萌發過程中miR398上調表達，說明miR398在種子萌發和植物生命周期中起關鍵作用;也預測到了miR-398-3p的靶基因也具有花粉特異性蛋白SF3的功能，說明miR-398-3p可能參與植物的生長發育調控過程，關于發育相關的miR-398-3p靶基因功能還需要進一步研究。

4? 結論

本研究通過生物信息學方法發現31種植物中存在miR-398-3p序列，大部分miR-398-3p基因分散在不同的染色體上，也有少部分miR-398-3p基因位于同一染色體上，miR-398-3p序列在不同物種間具有高度的保守性，但堿基位置有一定差異。進化分析表明，miR-398-3p基因家族的成員呈現7個分支，個別物種miR-398-3p的不同成員具有較遠的親緣關系;靶基因預測表明，miR-398-3p的靶基因具有超氧化物歧化酶[Cu-Zn]、鋅指蛋白WIP2、C2H2型鋅指家族蛋白、花粉特異性蛋白質SF3等功能。

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