CCK-8法測定纖維蛋白膠對人脂肪干細胞的細胞毒性

熊龑 徐濤 龔良國

[摘要]目的 探討CCK-8法測定纖維蛋白膠對人脂肪干細胞的細胞毒性。方法 選取2018年11月12日來我院進行成人吸脂術的某位28歲健康女性的術后廢棄脂肪組織，并從中得到人脂肪干細胞，分別制成50%浸提液組、100%浸提液組、陰性對照組、陽性對照組，采用CCK-8檢測試劑盒測定各組纖維蛋白培養液中的吸光值。結果 原代脂肪干細胞（ASCs）生長緩慢，傳代后生長加速，且脂肪干細胞呈成纖維樣細胞形態;陰性對照組的吸光值與50%、100%形態放置24 h和72 h的纖維蛋白膠浸提液組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。50%及100%纖維蛋白膠浸提液組、陰性對照組的吸光值均小于陽性對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 纖維蛋白膠在與脂肪干細胞相混合的情況下無顯著細胞毒性，能夠為探索基于纖維蛋白膠作為支架材料的有關脂肪結構提供參考。

[關鍵詞]CCK-8法;纖維蛋白膠;脂肪干細胞;細胞毒性

[中圖分類號] R628? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）6（c）-0038-03

[Abstract] Objective To explore the cytotoxicity of fibrin glue to human adipose stem cells by CCK-8 method. Methods Human adipose stem cells were obtained from the waste adipose tissue of a 28-year-old healthy woman who came to our hospital on November 12， 2018 for adult liposuction， and made into the 50% fibrin glue leaching solution group， the 100% fibrin glue leaching solution group， the negative control group and the positive control group respectively. The absorbance values in each fibrin glue medium was determined by CCK-8 method. Results The growth of primary adipose stem cells （ASCs） was slowly. The growth of ASCs was accelerated after passage， and ASCs appeared fibroblast-like morphology. There were no significant differences in the absorbance between the 50% fibrin glue extract group， the 100% fibrin glue extract group and the negative control group at 24 and 72 hours （P>0.05）. The absorbance values of 50% and 100% fibrin glue extract group and the negative control group were lower than that of the positive control group， with statistical significance （P<0.05）. Conclusion Fibrin glue has no significant cytotoxicity when mixed with ASCs， which can provide a reference for the exploration of adipose structure based on fibrin glue as scaffold material.

[Key words] CCK-8 method; Fibrin glue; Adipose stem cells; Cytotoxicity

在整形外科的臨床實踐活動中常常可以看到軟組織缺失的情況，目前存在著兩類能夠作為軟組織充填物的材料，首先是經過人工方式合成的正常肌理組織為主的臨時性填充物，諸如膠原蛋白、透明質酸等，這些物質的良好生物相容性和可降解性讓其應用范圍廣泛，但其填充效果卻不能持續很長時間;其次是通過人工方式合成的惰性材料，諸如硅膠等，但這樣的填充物等于異物植入，無法獲得自然的整形術后效果[1-2]。目前快速崛起的自體脂肪顆粒一直存在著較低的術后脂肪存活率，這無形之中讓以最終填充效果為目標的手術次數增多[3-4]。近年來，以組織再生理論為基礎的脂肪組織工程因為脂肪干細胞（adipose stem cells，ASCs）的出現實現了飛躍，也讓基于脂肪肝種子細胞為基礎的脂肪組織工程日漸受到醫學界關注[5]。本研究采用CCK-8法測定纖維蛋白膠對人ASCs的細胞毒性，旨在為基于纖維蛋白膠支架為基礎的脂肪組織工程深化提供參考，現報道如下。

1資料與方法

1.1試劑與儀器

胎牛血清（FBS）、低糖DMEM培養基、胰蛋白酶（Gibco）均購自美國Gibco公司;Ⅰ型膠原酶、纖維蛋白原、凝血酶（Sigma）購自美國Sigma公司;CCK-8試劑購自日本同仁化學研究所;倒置相差顯微鏡購自日本Olpmpus公司，型號為CKX41;CO2培養箱購自美國Thermo公司，多功能酶標儀購自美國Thermo公司，型號為Skan Spertrum。

1.2研究方法

1.2.1人脂肪干細胞的獲取? 選取2018年11月12日來我院進行成人吸脂術的某位28歲健康女性的術后廢棄脂肪組織并從中得到人脂肪干細胞，本研究在醫院醫學倫理委員會和患者本人的授權下進行。將5 ml廢棄的吸脂術后人體脂肪組織與Ⅰ型膠原酶溶液混合，溶液濃度與脂肪組織相同且濃度為1.0 mg/ml，簡單搖勻后在37℃的水浴箱內部靜置消化30 min，之后在離心機上按照1000 r/min的速度連續離心5 min來消去表面油脂和液體。利用FBS DMEM培養基來對細胞進行重懸，培養基的FBS濃度為10%，細胞濃度設置為（5×105～10×105）個/L，然后將細菌接種到規格為25 cm2的培養瓶中培養48 h再進行第一次液體更換，融合度達到80%后利用胰蛋白酶消化傳代，傳代數目為3代，完成后的干細胞留作后用。

1.2.2纖維蛋白膠浸提液的制備? 纖維蛋白膠浸提液的萃取參照ISO 10993醫療用具的生物學評價準則來進行。將濃度分別為50 mg/ml和500 U/ml的纖維蛋白原溶液和凝血酶溶液按照等體積抽吸到雙聯注射器之中，并將其轉注到6孔板上，令纖維蛋白膠在6孔板底層均勻鋪開。將培養基加注到已經成型的纖維蛋白膠上，加入時材料表面積和液體體積之間的比值為3 cm2/ml，將在37℃的孵化箱內部完成3 d浸提后形成的纖維蛋白膠百分百純度浸提液和等量體積的DMEM培養基相融合，并讓浸提液的濃度降低到50%。然后將10%濃度的胎牛血清放置其中并按照4℃低溫保存以備后用。

1.2.3 CCK-8試劑測定各組培養液中吸光值? 將制備的纖維蛋白膠制成不同濃度的纖維蛋白膠浸提液，分別為陰性對照組（DMEM培養基）、50%纖維蛋白膠浸提液組、100%纖維蛋白膠浸提液組和陽性對照組（DMEM培養基，內含6.4%苯酚溶液），完成細胞毒性檢測。令第3代ASCs胰酶完成消化，之后按照1×107/L的濃度制造細胞懸液，按照每孔100 μl的比例在96孔板中完成接種，24 h以后提取培養完成的細胞貼壁并吸收廢棄培養液。將制備的培養液分別添加到陰性對照組、50%纖維蛋白膠浸提液組、100%纖維蛋白膠浸提液組和陽性對照組4個分組中，4個分組培養液均包括5個復孔配置，細菌種版2個，培養箱溫度為37℃。培養24 h和72 h時，將一塊96孔板取出并對培養液進行吸收，每孔加入10 μl CCK-8溶液。將培養板在培養箱內培養2 h，采用酶聯免疫檢測儀在450 nm雙波長處測得相應的吸光值（A值）。

1.3觀察指標

觀察傳代后的ASCs生長速度以及人脂肪干細胞形態學的形態學狀況，比較各組的A值，A值越大，表示物質對光的吸收越大，毒性也越大。

1.4統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組內比較采用單因子方差法，跨組別比較采用SNK-q檢驗法，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1人脂肪干細胞的形態學觀察

利用酶消化手段從提取的人體脂肪吸收物中提取第一代ASCs，7 d以后，第一代ASCs才完全布滿培養瓶。但是傳代后的生長速度加快，代際傳遞時間只需要3 d。傳代完成的ASCs有著最典型化的纖維細胞形狀，足突與細胞核大而且明顯。密集生長的細胞之間還呈現出渦狀排布。

2.2各組培養液中A值檢測結果的比較

對所有完成24 h和72 h培養的分組細胞上清液進行A值測試，結果顯示兩個培養時長內的50%及100%纖維蛋白膠浸提液組的A值與陰性對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。完成24、72 h培養時，50%及100%纖維蛋白膠浸提液組、陰性對照組的A值均小于陽性對照組，差異有統計學意義（P<0.05）（表2）。

3討論

支架材料是搭建脂肪組織工程的重要環節，須滿足包括優良生物相容性和固定時間段高降解特性等一系列性質。在凝血反應的擬態之下，凝血酶與纖維蛋白原發生作用，產生了帶有一定物理強度的膠狀纖維蛋白膠（fibrin gel）。將纖維蛋白膠作成多種組織架構的支架材料已經有了多次見諸報端的實例[6]。然而，融入復合ASCs的纖維蛋白膠支架材料被用于搭建脂肪組織工程的研究范例還較為少見[7]。本研究中，ASCs被按照酶消化模式從脂肪組織中萃取出來，采用CCK-8模式對這一物質進行體外培養后與纖維蛋白膠相融合產生的細胞毒性進行測試，結果顯示纖維蛋白膠與ASCs相融合后并沒有明顯的毒性，從而為該物質與復合ASCs相容共同作為脂肪組織工程支架材料的探索提供了參考。

一般情況下，組織搭建的工程思路是把支架材料和種子細胞的合成材料按照一定誘導模式植入人體，但這就需要種子細胞和支架材料兩個關鍵性的東西。在2001年，Zuk等[8]第1次對基于脂肪吸取物培養而成的命名為ASCs的間充質干細胞特質種群進行報道。基于脂肪組織的大獲取量和低獲取難度，將脂肪作為ASCs的提取來源有著良好的實際潛力。脂肪組織工程因為ASCs的出現而實現了飛躍，也讓基于脂肪肝種子細胞為基礎的脂肪組織工程日漸受到醫學界關注[9-10]。

種子細胞在組織工程的環境下必須在三維支架上實現種植，這也讓支架材料在構建組織的過程中起到了重要的作用。支架可以基于塑型特質分為預塑型多孔材料和注射性凝膠材料[11-12]，在脂肪組織工程的狀態下，注射型凝膠支架搭建的注射型軟組織填充物更具有常態化的優點，創面小、填充均勻、可以更好地完成對不規則缺失的填補[12]。

纖維蛋白原加上凝血酶造就的纖維蛋白膠其實就是凝血反應的最后擬態，水凝膠由纖維蛋白聚合而成，注射填充的活動只需要雙聯注射器即可輕松完成。良好的降解性讓纖維蛋白膠在作為支架材料時可以擁有更好的組織工程潛力，在諸如平滑肌、骨骼、軟組織等多個組織工程領域對纖維蛋白膠的利用探索已經多次出現在相關報道中[13-15]。

生物相容性是測試任何機體植入材料的必須標準，而對這些機體植入材料的生物相容性的國際通用測試活動主要分三步：①基于體外培養細胞繁殖干擾力的體外細胞毒性檢測;②測試材料對于機體的局部或全身毒性的動物實驗;③病患活體實驗。這也讓細胞毒性作用的測試成為了材料生物相容性測試的第一步，而測試細胞毒性的主要標準就是CCK-8標準。

本研究存在100%濃度液和50%濃度液的纖維蛋白膠浸提液，檢測時間均在培養活動的第1、3 d進行。測試結果顯示，兩組浸提液的A值與陰性對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。完成24、72 h培養時，50%及100%纖維蛋白膠浸提液組、陰性對照組的A值均小于陽性對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。通過CCK-8法測定各組各時段的A值，結果顯示，ASCs下纖維蛋白膠不存在顯著細胞毒性。

在脂肪組織工程內部應用纖維蛋白膠支架材料尚無足夠研究實例，本研究也只是纖維蛋白膠在體外ASCs內部所產生獨行的CCK-8檢測，未來對于纖維蛋白膠組織結構支架材料的實用安全研究還需要更加全面。

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（收稿日期：2018-11-30? 本文編輯：孟慶卿）