金銀花提取物對重癥急性胰腺炎肺損傷大鼠ROS-NLRP3炎癥小體信號通路的影響*

阮輝輝 衛 巍 許永富

（上海市第十人民醫院，上海 201106）

急性胰腺炎屬于腹部急性炎癥反應疾病，而重癥急性胰腺炎（SAP）病情嚴重，致死率高，不僅表現為胰腺缺血、壞死，且合并全身多出器官損傷，其中肺損傷為SAP常見的并發癥，是導致SAP患者死亡的重要的原因［1］。有資料顯示，核苷酸結合域樣受體蛋白3（NLRP3）炎性小體通路在受到ROS激活后促進炎性反應，加重組織損傷，進而而參與肺損傷的發病機制［2］，推測ROS-NLRP3炎性體通路可能在SAP肺損傷中發揮重要作用。金銀花屬于忍冬科植物，具有廣泛的藥理作用，如清熱解毒、抗鹽、抗氧化、抗腫瘤、降壓等，為多種中藥制劑的主要成分，對肺部炎癥疾病具有一定的治療效果［3-4］，然而在SAP合并肺損傷中的作用，目前尚不清楚。本研究采用自制金銀花水提取液（HFE）對SAP肺損傷大鼠進行治療，探究其對SAP大鼠肺組織的改善，探討可能機制，以期為疾病的治療提供一定的參考。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SPF級成年SD大鼠，8周齡，雄性，體質量220～240 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號為SYXK（京）2017-0033，所有大鼠均置于統一環境飼養，飼養溫度為23～25℃，濕度為50%～60%，嚴格遵守《關于善待實驗動物的指導性意見》進行飼養。本研究經本院動物倫理委員會批準，審批號：IACUC20170328。

1.2 試藥與儀器 金銀花購于張仲景大藥房，置于50℃烘箱中烘干2 h，于研磨機中研磨成粉，稱取100 g，于1 L 50%乙醇中浸泡24 h，過濾后濾渣添加1 L 50%乙醇60℃浸泡3 h，收集濾液，在旋轉蒸發儀中（65℃）濃縮，添加蒸餾水定容至100 mL，即為原藥液，濃度為1 g/mL；地塞米松購于廣西萬德藥業股份有限公司，批號170314；牛磺膽酸鈉（貨號145-42-6）購于上海紫一試劑廠；HE染色試劑盒（貨號C0105）購于碧云天生物技術研究所；白細胞介素-1β（IL-1β）（貨號hz-0011c）、白介素-18（IL-18）（貨號h-0253c）檢測試劑盒購于上海滬震實業有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）（貨號A001-3）、丙二醛（MDA）（貨號A003-1）檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所；鼠抗NLRP3（貨號15101）購于美國CST公司；凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）（貨號AF3805-SP）、半胱天冬酶（Caspase-1）（貨號MAB601-SP）、IL-1β（AF6215-SP）抗體購于美國R&D公司；HRP標記IgG二抗（貨號sc-51642）購于美國SantaCruz公司；80I顯微鏡購于日本Nikon公司。

1.3 分組與造模 參照文獻制備SAP大鼠［5］，隨機挑選80只大鼠，禁食不禁水12 h后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）充分麻醉大鼠，于腹正中切開，暴露十二指腸，區分胰膽管以及肝門部膽管，于近肝門端、近腸端胰膽管用動脈夾夾閉，用注射器針頭穿刺胰管，緩慢推注5%牛磺膽酸鈉溶液，注射量為1.5 mL/kg，注射速率為0.2 mL/kg，10 min后，除去動脈夾，當胰腺組織出現水腫并伴有出血［6］，表明SAP模型制備成功，隨后退出針頭，按摩穿刺孔，用封閉膠將穿刺孔封閉后，復位腸管逐層關腹。假手術組大鼠（16只）僅翻動腸管。造模后將大鼠分為模型組及HFE低、中、高劑量組、地塞米松組，每組16只大鼠。

1.4 給藥方法 金銀花提取物組：造模后尾靜脈注射金銀花提取液，參考文獻［7］注射劑量分別為40、80、120 mg/kg；地塞米松組：造模后尾靜脈注射地塞米松溶液，參考文獻［7］注射劑量為0.5 mg/kg。假手術組、模型組尾靜脈注射等量0.9%氯化鈉注射液；各組大鼠均連續給藥4周。

1.5 標本采集與檢測 1）樣本收集。末次給藥后各組選取6只大鼠麻醉后，迅速于左肺進行支氣管肺泡灌洗，收集支氣管肺泡灌洗液（BALF），重復3次，置于-20℃保存。采集各組剩余大鼠腹主動脈血2 mL，離心后于-20℃保存上清；處死大鼠獲得左肺葉組織、胰腺組織，進行組織濕/干質量比分析，隨后一部分肺組織置于4%多聚甲醛中固定，一部分凍存-80℃。胰腺、肺組織濕重、干重測定。2）組織形態學檢測。常規制備4 μm胰腺、肺組織石蠟切片，經脫蠟、脫水后，采用HE染色試劑盒對切片進行染色，于顯微鏡下觀察組織病理學變化，參考Schimidit半定量評分系統對胰腺組織病理學情況進行評定打分［9］。3）動脈血氣指標檢測。利用全自動血氣分析檢測儀對腹動脈血中氧分壓、二氧化碳分壓進行檢測。4）BALF中炎性細胞及因子水平檢測。參考試劑盒檢測說明書進行操作。采用血細胞計數儀對BALF沉淀細胞中總細胞數量和多形核白細胞數量進行計數檢測。5）肺組織中SOD、MDA、ROS水平。具體參照SOD、MDA檢測試劑盒說明書進行操作。根據文獻中二氫乙啶（DHE）法檢測肺組織中的ROS相對水平，在熒光顯微鏡下分析氧化的DHE活性［11］。6）免疫印跡法檢測肺組織中NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白表達。7）大鼠生存狀態評估。參考Zealongals標準對各組大鼠生存狀態進行評定并打分［8］。

1.6 統計學處理 應用SPSS22.0統計軟件。計量資料以（）描述，兩組間比較行t檢驗，多組間比較行單因素方差分析，進一步兩兩對比采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 各組大鼠生存情況比較 見表1。與假手術組相比，模型組生存狀況評分顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，HFE各組以及地塞米松組生存狀況評分均顯著升高，呈劑量依賴性（P＜0.05）。各組大鼠死亡率相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠生存情況比較

2.2 各組大鼠胰腺、肺組織形態學情況比較 見圖1～圖2，表2。椵手術組胰腺組織、細胞形態正常；模型組胰腺組織中細胞發生變性和收縮、空泡樣改變，同時伴有炎性細胞浸潤（黑色箭頭）。HFE各劑量組以及地塞米松組細胞變性、腫脹減少、空泡變小，胰腺組織逐漸恢復。假手術組肺泡結構完整，肺組織為發生水腫、炎性細胞浸潤；模型組肺泡壁增厚、肺間質水腫、間隔變寬，伴隨大量炎性細胞浸潤。HFE各劑量組以及地塞米松組肺組織得到明顯改善，且隨著給藥濃度的升高，肺組織逐漸恢復正常。與假手術組相比，模型組胰腺、肺組織病理評分顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，HFE各劑量組以及地塞米松組胰腺、肺組織病理評分均顯著降低，呈劑量依賴性（P＜0.05）。

圖1 胰腺組織形態學變化（HE染色，100倍）

圖2 肺組織形態學變化（HE染色，100倍）

表2 各組大鼠胰腺組織、肺組織病理評分比較（分，±s）

表2 各組大鼠胰腺組織、肺組織病理評分比較（分，±s）

組別假手術組模型組HFE低劑量組HFE中劑量組HFE高劑量組地塞米松組n 10 10 10 10 10 10肺組織病理評分0.38±0.06 3.51±0.16*2.74±0.25*△2.16±0.36*△1.08±0.28*△0.94±0.19*△胰腺組織病理評分0.57±0.15 7.28±0.65*6.17±0.53*△4.25±0.49*△2.14±0.34*△1.94±0.28*△

表3 各組大鼠動脈血氣壓、組織干濕重比較（±s）

表3 各組大鼠動脈血氣壓、組織干濕重比較（±s）

組 別n 血氧分壓（mmHg） 二氧化碳分壓（mmHg） 胰腺組織（W/D） 肺組織（W/D）假手術組模型組HFE低劑量組HFE中劑量組HFE高劑量組地塞米松組10 10 10 10 10 10 95.64±2.63 56.42±3.47*66.24±2.62*△70.82±2.48*△76.49±2.69*△78.16±2.71*△32.67±3.62 58.66±4.35*47.45±3.71*△42.17±3.59*△39.64±3.68*△38.65±3.14*△2.38±0.39 4.57±0.43*3.49±0.36*△3.13±0.48*△2.87±0.37*△2.75±0.32*△2.65±0.29 4.84±0.31*4.17±0.24*△3.94±0.28*△3.43±0.20*△3.37±0.24*△

2.3 各組大鼠動脈血氣壓、組織干濕重比較 見表3。與假手術組相比，模型組二氧化碳分壓、胰腺、肺組織W/D顯著升高，血氧分壓顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，HFE各劑量組以及地塞米松組二氧化碳分壓、胰腺、肺組織W/D顯著降低，血氧分壓顯著升高，呈劑量依賴性（P＜0.05）。2.4 各組大鼠BALF中炎性因子比較 見表4。與假手術組比較，模型組BALF中IL-1β、IL-18、總細胞數量、多形核白細胞數量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，HFE各劑量組以及地塞米松組BALF中IL-1β、IL-18、總細胞數量、多形核白細胞數量顯著降低，呈劑量依賴性（P＜0.05）。

表4 各組大鼠BALF中炎性因子水平比較（±s）

表4 各組大鼠BALF中炎性因子水平比較（±s）

組別假手術組模型組HFE低劑量組HFE中劑量組HFE高劑量組地塞米松組n 6 6 6 6 6 6 IL-1β（pg/mL）28.03±2.05 175.74±22.46 136.25±17.34 103.53±14.59 87.39±11.65 79.16±8.71 IL-18（pg/mL）22.34±3.11 219.28±30.65 172.47±18.32 143.62±25.44 128.56±19.07 115.65±3.14總細胞數量（×105）1.01±0.01 14.59±2.69 8.34±1.23 7.05±1.41 6.57±1.17 6.25±0.32多形核白細胞數量（×105）0.06±0.01 12.35±2.16 7.73±1.53 6.26±2.11 5.96±1.68 5.37±0.24

2.5 各組肺組織SOD、MDA水平比較 見表5。與假手術組比較，模型組肺組織SOD水平顯著降低，MDA水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，HFE各劑量組以及地塞米松組肺組織SOD水平顯著升高，MDA水平顯著降低，呈劑量依賴性（P＜0.05）。

表5 各組大鼠肺組織SOD、MDA水平比較（±s）

表5 各組大鼠肺組織SOD、MDA水平比較（±s）

組別假手術組模型組HFE低劑量組HFE中劑量組HFE高劑量組地塞米松組n 10 10 10 10 10 10 SOD（U/mg）37.95±2.18 20.27±1.29*25.81±1.17*△28.56±1.19*△29.18±1.55*△29.79±1.64*△MDA（μmol/g）133.27±13.66 200.75±16.38*181.69±15.44*△166.33±13.85*△152.49±14.79*△148.63±16.49*△

2.6 各組大鼠肺組織中ROS、NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1水平比較 見表6，圖3。各組大鼠肺組織ROS水平比較：與假手術組相比，模型組大鼠肺組織中ROS顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，HFE各劑量組以及地塞米松組肺組織中ROS顯著降低（P＜0.05）。各組大鼠肺組織中NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1表達情況：與假手術組相比，模型組大鼠肺組織中NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白表達顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，HFE各劑量組以及地塞米松組肺組織中NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。

表6 各組大鼠肺組織NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白及ROS表達量比較（±s）

表6 各組大鼠肺組織NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白及ROS表達量比較（±s）

組別假手術組模型組HFE低劑量組HFE中劑量組HFE高劑量組地塞米松組n 10 10 10 10 10 10 NLRP3 0.17±0.06 1.26±0.16*1.02±0.14*△0.92±0.12*△0.76±0.08*△0.62±0.03*△ASC 0.19±0.02 0.94±0.11*0.81±0.11*△0.68±0.08*△0.42±0.05*△0.39±0.04*△IL-1β 0.22±0.03 0.85±0.09*0.72±0.07*△0.68±0.08*△0.58±0.06*△0.42±0.03*△Caspase-1 0.26±0.05 0.88±0.06*0.57±0.07*△0.41±0.09*△0.36±0.07*△0.32±0.05*△ROS 1.00 4.62±0.57*3.71±0.63*△2.67±0.49*△2.14±0.61*△2.06±0.53*△

圖3 免疫印跡法檢測肺組織中NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白表達

3討 論

本研究采用逆行膽管注射牛磺膽酸鈉制備SAP模型，結果發現模型組胰腺組織中細胞發生變性和收縮、空泡樣改變，胰腺泡破壞，同時伴有炎性細胞浸潤，胰腺W/D比值增大，表明胰腺水腫，與臨床水腫型胰腺炎病理特征相似［12］，提示SP大鼠制備成功。進一步對肺部檢測發現肺泡壁增厚、肺間質水腫、間隔變寬，伴隨大量炎性細胞浸潤，肺W/D比值、大鼠動脈血二氧化碳分壓升高，氧分壓降低，大鼠肺BLAF中總細胞數和多形核白細胞數量顯著升高，表明SAP不僅引起大鼠胰腺組織損傷，且可誘發大鼠肺水腫及組織損傷，提示SAP肺損傷模型制備成功。

藥理研究顯示金銀花具有抗病毒、解熱、抗內毒素、抑菌、抗炎等功效，對肺炎具有一等的治療作用［13-14］。本研究發現與模型組相比，HFE各劑量組胰腺組織、肺組織病理學評分均顯著降低，胰腺、肺W/D比值降低，氧分壓升高，二氧化碳分壓降低，大鼠肺BLAF中總細胞數和多形核白細胞數量顯著，呈劑量依賴性，其高劑量組與Dex組效果相似，提示HFE能夠改善SAP引發的肺組織損傷，降低組織炎性反應，然而具體機制目前尚不清楚。

肺泡巨噬細胞產生大量IL-18、IL-1β等促炎性細胞因子，引發肺部炎癥反應［15］。肺損傷大鼠研究中發現，給予IL-1β抗體治療可顯著降低炎癥反應，緩解肺損傷［16］。國內研究發現，IL-1β炎性細胞因子上調可促進肺組織中性粒細胞浸潤，加重炎癥損傷［17］。本研究發現，模型組大鼠BALF中IL-18、IL-1β、總細胞數、多形核白細胞數量顯著升高，提示SAP大鼠肺組織炎性損傷；給予金銀花提取液干預后IL-18、IL-1β、總細胞數和多形核白細胞數量降低，提示HFE可能通過抑制肺組織炎性細胞浸潤，降低炎癥因子水平從而緩解肺組織損傷。

氧化應激反應為肺損傷的重要病理機制，急性胰腺炎相關性肺損傷動物模型中發現小鼠肺組織中氧化應激水平較高，同時伴有炎性細胞浸潤［18］。此外肺損傷后組織中SOD抗氧化因子水平異常導致氧自由基、MDA水平升高，造成氧化應激反應升高損傷肺組織［19］。本研究發現模型組肺組織中SOD水平降低，MDA水平升高，給予HFE干預后SOD水平升高，SOD水平降低，提示HFE可能通過抑制肺組織氧化應激反應減輕肺組織損傷。

近來研究發現，NLRP3炎性小體參與肺損傷的發生發展［20］。NLRP3為NLRP3炎性小體通路的核心蛋白，研究顯示在多種外源性和內源性危險信號刺激下激活NALP3炎性小體，可改變NALP3結構，ATP作用下形成NALP3蛋白復合體，促進ASC、Caspase-1集合，激活pro-Caspase-1向Caspase-1分裂，進而促進IL-1β成熟并分泌細胞外引發炎癥反應［21-22］。本研究發現，HFE能夠抑制大鼠肺組織中NLRP3、Caspase-1、ASC、Caspase-1、IL-1β的表達，推測HFE可能是通過抑制肺組織NLRP3炎癥小體活化，進而抑制Caspase-1的成熟、IL-1β分泌，發揮抗炎作用，進而改善肺組織損傷。肺組織中ROS等激活劑的產生可激活NLRP3炎癥小體，因此ROS常作為NLRP3炎癥小體激活劑調節NLRP3的表達［23］。本研究中Model大鼠肺組織中ROS水平顯著升高，給予HFE干預后，ROS水平降低，結合過往研究推測，HFE可能通過抑制肺組織氧化應激反應，進而抑制NLRP3炎癥小體的活化。

綜上所述，HFE對SAP大鼠肺損傷具有保護作用，且這種作用可能通過抑制ROS產生，進而抑制NLRP3炎癥通路介導的促炎因子IL-1β和IL-18的分泌，緩解肺組織炎癥損傷。然而HFE僅能緩解大鼠肺組織損傷，并不能逆轉肺組織損傷，可能與藥物劑量有關，也有可能與SAP肺損傷其他作用機制有關，這還有待后續深入研究。