MitoQ對模擬高原缺氧大鼠腦組織的保護作用

蒙 萍，景臨林，何 蕾，高迎春，李玉芳，馬慧萍

(1. 中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四○醫院藥劑科全軍高原環境損傷防治重點實驗室；2. 甘肅省婦幼保健院麻醉手術科，甘肅 蘭州 730050)

高原低壓性缺氧是人類在高海拔區域面臨的重要挑戰，是引起急性高原反應和高原腦水腫、高原肺水腫等高原性疾病的首要因素[1]。缺氧引起氧化應激，活性氧(reactive oxygen species，ROS)大量產生，造成機體過氧化損傷、線粒體功能障礙等[2]。多年來，研究人員致力于抗氧化劑的研究，認為抗氧化劑能夠清除機體過多產生的ROS，緩解氧化應激損傷[3]。然而，大量的ROS主要產生于線粒體，基于線粒體的雙層膜結構，普通的抗氧化劑并不能穿過其雙層膜到達線粒體內部發揮作用，使得抗氧化劑的效果并未能得到最大程度的發揮，人們開始研究線粒體靶向抗氧化劑來治療相關疾病[4]。其中一個很好的方法是結合陽離子脂質體如三苯基膦，磷的衍生物已經被廣泛的用于靶向藥物的設計，使藥物有靶向線粒體內膜的特性。線粒體靶向抗氧化劑MitoQ(Mitoquinol mesylate)是內源性抗氧化劑輔酶Q10與三苯基磷共價結合得到的一個化合物，是一種具有線粒體靶向特性的抗氧化劑，已經被廣泛用于多種疾病的預防和治療[5]。有研究顯示，MitoQ對神經退行性疾病的細胞和動物模型都有神經保護作用，能明顯抑制6-羥基多巴胺誘導的SH-SY5Y細胞帕金森病(Parkinson′s disease，PD)模型中Drp1向線粒體遷移，阻礙線粒體分裂機制的激活，同時抑制促凋亡蛋白Bax轉位到線粒體，抑制PD的發生[5]。但MitoQ對高原缺氧損傷防治方面尚無相關研究，因此，本研究采用大型低壓氧艙模擬海拔8 000 m高原缺氧環境，通過腦組織病理切片觀察，測定大鼠腦組織氧化應激水平、線粒體呼吸鏈復合物活性和凋亡蛋白的表達，研究MitoQ對高原缺氧大鼠腦組織的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.2藥物與試劑 MitoQ為本課題組景臨林博士合成惠贈；丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒(批號：20150417)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒(批號：20150421)、線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ測定試劑盒(批號：20151020)、線粒體呼吸鏈復合物Ⅱ測定試劑盒(批號：20150513)、線粒體呼吸鏈復合物Ⅳ測定試劑盒(批號：20150513)、Ga2+測定試劑盒(批號：2014.12.20)，均購自南京建成生物工程研究所；膜電位測定試劑盒(碧云天，批號：C2006)；抗體Bax(貨號：ab32503)、細胞色素C (cytochrome C，Cyt C)(貨號：ab133504)，均購自Abcam公司；caspase-3抗體(Cell Signaling，批號：0071)；β-actin抗體(中杉金橋，批號：150120)。

1.1.3儀器 大型低壓氧艙(貴州風雷軍械有限公司)；低溫高速離心機(德國Sigma公司)；MULTISKAN MK3型酶標儀(上海雷勃分析儀器有限公司)；免疫印跡分析儀(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1MitoQ對常壓密閉缺氧小鼠的保護作用 取♂BALB/c小鼠，共18只，隨機分為6組，每組3只。分別腹腔注射不同劑量的MitoQ(1、3、5、10、20 mg·kg-1)，對照組腹腔注射等劑量的生理鹽水，給藥0.5 h后，依次將小鼠放入250 mL廣口瓶中(為了避免小鼠因為自呼吸產生的CO2而酸中毒產生多因素死亡原因，加入了5 g鈉石灰，用來吸收CO2[6])，瓶口涂抹適量的凡士林并擰緊瓶塞，立即開始計時至其死亡，記錄存活時間，計算存活時間延長率。

1.2.2模擬海拔8 000 m高原缺氧實驗 將60只♂Wistar大鼠隨機分成5組，包括正常組、缺氧12 h模型組、缺氧12 h MitoQ組、缺氧24 h模型組、缺氧24 h MitoQ組，每組12只。按小鼠常壓密閉缺氧實驗得到的MitoQ最佳給藥劑量，換算成大鼠給藥劑量為3.5 mg·kg-1，將大鼠分別稱重后腹腔注射給藥，MitoQ為每天早上新配，連續給藥3 d。d 3早上給完藥后0.5 h，放入大型低壓低氧模擬艙。將大鼠按組別放入實驗艙，關閉實驗艙艙門，以20 m·s-1的速度升高至海拔8 000 m，缺氧12 h后，實驗人員進入操作間，關閉操作間艙門，以2 m·s-1的速度升高海拔至3 500 m，同時將實驗艙海拔降低至3 500 m，打開實驗艙艙門，實驗人員進入實驗艙后迅速取出缺氧12 h組大鼠，實驗艙復升壓至海拔8 000 m，實驗人員在海拔3 500 m操作間麻醉大鼠解剖采集大鼠腦組織。缺氧24 h組與缺氧12 h組操作步驟一致，正常組大鼠正常飼養24 h后麻醉取材。

1.2.3HE染色 將大鼠解剖，取出腦組織皮層，漂洗，縱切厚1 mm切片，放入含有4%甲醛的固定液中。固定1周后，制樣與顯微鏡觀察、拍片。

1.2.4氧化應激相關指標的測定 按腦組織(重量) ∶生理鹽水(體積)=1 ∶9的比例，使用電動勻漿器冰浴制備10%腦組織勻漿，按照MDA、SOD試劑盒說明書測定。

首先，高中化學教職人員必須要準確有效地了解每一位學生的實際學習情況，然后依照學生的綜合素質對其進行準確的劃分，同時在對學生進行層次劃分的過程當中，必須要時刻關注學生的心理變化情況，準確地告知學生將其進行小組劃分對于學生自身化學水平提升的重要性。

1.2.5線粒體功能與能量代謝相關指標的測定

1.2.5.1大鼠腦組織Ga2+含量的測定 制備10%腦組織勻漿，按照Ga2+試劑盒說明書進行測定。

1.2.5.2大鼠腦組織線粒體的提取 參考文獻[7]，解剖取出大鼠腦組織，徹底漂洗干凈至無血跡，稱重0.1 g，轉移至玻璃勻漿器中，按如下步驟提取線粒體：① 加入1 mL大鼠腦線粒體分離介質，勻漿破碎組織塊釋放出細胞器；② 將勻漿好的樣品轉移至2 mL離心管內，1 000×g離心10 min；③ 將上清轉移至2 mL離心管，10 000×g離心10 min；④ 用棉簽將液面以及附著在管壁的油脂擦拭干凈，棄上清；⑤ 用線粒體分離介質重懸沉淀，10 000×g離心10 min；⑥ 棄上清，用線粒體分離介質重懸沉淀，分裝，-80 ℃保存。

1.2.5.3大鼠腦線粒體膜電位的測定 將線粒體一定量稀釋，先在96孔熒光酶標板中加入180 μL JC-1工作液，之后在測定孔加入20 μL待測樣品，對照孔每孔加入20 μL PBS，充分混勻，37 ℃孵育20 min，使用熒光酶標儀，激發波長488 nm，發射波長530 nm(綠光)、585 nm(紅光)。結果以紅光熒光強度/綠光熒光強度表示。

1.2.5.4大鼠腦線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的測定 使用南京建成線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ測定試劑盒，按照說明書進行測定。

1.2.6蛋白免疫印跡分析 稱取一定質量的腦組織，加入9倍體積的蛋白質裂解液，中速冰水浴電動勻漿1 min后，冰上裂解45 min，每間隔5 min渦旋5 s，隨后12 000 r·min-1離心10 min，吸取上清20 μL用于測定蛋白濃度。定量轉移剩余上清于新的離心管中，按比例加入蛋白質上樣緩沖液，混勻，變性，-20 ℃冰箱保存。12%的分離膠，5%的濃縮膠，上樣50 μg，濃縮膠80 V，分離膠110 V。TBST洗膜后濕法轉膜，110 V轉膜1.5 h，5%脫脂奶粉封閉2 h。一抗Bax(1 ∶2 000)、caspase-3(1 ∶1 000)、Cyt C(1 ∶2 000)、β-actin(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜后取出，1×TBST洗膜4次，每次10 min；二抗孵育2 h，再次洗膜4次，每次10 min，ECL超敏發光液A液 ∶B液=1 ∶1配制發光液，曝光儀曝光。

2 結果

2.1 MitoQ對常壓密閉缺氧小鼠的保護作用MitoQ對常壓密閉缺氧小鼠存活率的影響見Tab 1，給予不同劑量MitoQ后，與缺氧模型組比較，低劑量組并未顯現出明顯的保護作用，MitoQ(5、10、20 mg·kg-1)明顯延長了小鼠的存活時間，小鼠存活率分別提高了47.69%、49.08%和49.05%。由結果可以看出，大于5 mg·kg-1后隨著MitoQ給藥劑量的增加，其對常壓密閉缺氧小鼠的存活率并沒有明顯變化，因此，最佳劑量選擇為5 mg·kg-1。

Tab 1 Effect of MitoQ on survival rate of mice under conditionof atmospheric airtight which lack of

#P<0.05,##P<0.01vsControl

2.2 MitoQ對缺氧大鼠腦組織顯微結構的影響如Fig 1所示，正常組大鼠腦組織結構致密，缺氧12 h組細胞間隙增寬，空泡化，血管明顯水腫，缺氧24 h組變化更為明顯；與模型組相比較，12 h MitoQ組與24 h MitoQ組細胞間隙均減小，血管水腫程度減弱，提示MitoQ對缺氧大鼠腦組織發揮保護作用。

2.3 MitoQ對缺氧大鼠腦組織MDA和SOD的影響SOD被認為是阻止機體免受ROS攻擊的首要的防御酶。Tab 2結果顯示，缺氧12 h和24 h均能明顯提高缺氧大鼠腦組織中MDA水平，對機體產生損傷；MitoQ能夠降低MDA的含量，在24 h時降低作用差異具有顯著性(P<0.05)。缺氧能夠明顯降低大鼠腦組織中SOD活力，降低機體對O2-·等氧自由基的清除能力；MitoQ能夠在一定程度上提高缺氧大鼠腦組織SOD的活性，增加機體對ROS的清除能力。

2.4 MitoQ對缺氧大鼠腦組織Ga2+的影響如Fig 2所示，與正常組比較，缺氧增加了大鼠腦組織Ga2+含量，引起機體鈣超載，在缺氧12 h時差異具有顯著性(P<0.05)；給予MitoQ能夠明顯降低缺氧12 h大鼠腦組織Ga2+含量。缺氧24 h組大鼠腦組織Ga2+含量與正常組相比差異無顯著性。

Tab 2 Effect of MitoQ on activity of MDA, SODon rats under hypoxia

**P<0.01vsnormal;#P<0.05vshypoxia

2.5 MitoQ對缺氧大鼠腦組織線粒體膜電位的影響如Fig 3所示，與正常組相比，缺氧能夠明顯降低線粒體膜電位，對線粒體功能造成損傷；給予MitoQ后，缺氧12 h組大鼠腦組織線粒體膜電位明顯升高(P<0.05)，即MitoQ對缺氧大鼠腦線粒體功能具有一定的保護作用。缺氧24 h MitoQ組與模型組相比無明顯變化(P>0.05)。

2.6 MitoQ對缺氧大鼠腦線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的影響Tab 3結果顯示，缺氧12 h和24 h均使得大鼠腦組織線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ活性明顯下降(P<0.01)，線粒體呼吸鏈復合物Ⅳ活性有一定程度的下降；在缺氧24 h時，MitoQ對大鼠腦組織線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ活性有一定程度提高，但差異無顯著性，能夠明顯提高大鼠腦組織線粒體呼吸鏈復合物Ⅱ的活性(P<0.01)。

Fig1EffectofMitoQonbraintissuesofhypoxicratsbyHEstaining(×200) A: Normal; B:Hypoxia 12 h;C: Hypoxia+MitoQ 12 h; D: Hypoxia 24 h; E: Hypoxia+MitoQ 24 h.

Tab 3 Effect of MitoQ on activity of mitochondrial respiratory chain complexes Ⅰ, Ⅱ, Ⅳon rats under hypoxia

*P<0.05,**P<0.01vsnormal;#P<0.05,##P<0.01vshypoxia

Fig 2 Effect of MitoQ on Ga2+ content inbrain tissues of hypoxic

**P<0.01vsnormal;##P<0.01vshypoxia

Fig 3 Effect of MitoQ on mitochondrial membrane potential inbrain tissues of hypoxic

*P<0.05,**P<0.01vsnormal;#P<0.05vshypoxia

2.7 MitoQ對缺氧大鼠腦組織凋亡蛋白的影響如Fig 4所示，缺氧24 h組Cyt C、caspase-3、Bax表達較正常組明顯提高(P<0.01)；MitoQ組Cyt C、caspase-3、Bax表達較模型組明顯下調(P<0.05，P<0.01)。提示缺氧促進大鼠腦組織細胞凋亡，MitoQ能夠抑制缺氧條件下大鼠腦組織凋亡蛋白的表達，對缺氧大鼠發揮保護作用。

Fig 4 Effect of MitoQ on expression of Cyt C, caspase-3and Bax in brain tissues of hypoxic

**P<0.01vsnormal;#P<0.05,##P<0.01vshypoxia

3 討論

高原缺氧使初上高原的人產生各種不適癥狀，限制了高原地區的發展，嚴重影響了部隊高原作戰能力。低壓性缺氧是產生高原病的主要因素，造成心功能降低、微循環障礙、氧自由基大量產生，使得機體脂質過氧化水平升高，能量代謝和線粒體呼吸功能障礙，ATP合成減少，誘發一系列細胞凋亡反應，促進機體凋亡蛋白表達，引起細胞凋亡[8-9]。線粒體是人體許多重要的代謝發生的部位，通過氧化磷酸化合成細胞內絕大多數的ATP，三羧酸循環氧化反應的中間產物提供H+和電子進入電子傳遞鏈，最終提供能量將ADP磷酸化形成ATP，維持細胞活力。

既往研究顯示，MitoQ作為線粒體靶向抗氧化劑，對神經退行性疾病、代謝綜合征、多發性硬化、缺血/再灌注損傷、膿毒癥等與機體抗氧化系統失衡、氧化應激、線粒體功能障礙相關的疾病，均具有一定的防治作用。在PD模型中，能夠明顯上調Mfn2蛋白和mRNA水平，并以Mfn2依賴的方式促進線粒體融合，還可以穩定6-OHDA存在下線粒體的形態和功能，抑制ROS的形成，改善線粒體破碎和細胞凋亡[10-11]。此外，MitoQ能夠降低高脂飲食小鼠線粒體ROS水平，對動物模型代謝綜合征具有一定作用，并且能明顯抑制自身免疫性腦脊髓炎模型小鼠的神經炎癥，通過抑制炎性細胞因子IL-6、趨化因子及脫髓鞘作用，增加對軸突的保護作用。在膿毒癥模型中，MitoQ通過減少ROS和過氧亞硝酸鹽的形成，維持膿毒癥條件下的線粒體膜電位[5]。

本研究顯示，MitoQ明顯降低缺氧條件下胞內Ga2+含量，緩解缺氧引起的線粒體膜電位的降低，提高缺氧24 h大鼠腦組織線粒體呼吸鏈復合物Ⅱ的活性，改善缺氧引起的大鼠線粒體功能障礙。并且明顯降低Cyt C、caspase-3和Bax的表達，抑制缺氧條件下凋亡的發生。

綜上所述，大型低壓氧艙模擬海拔8 000 m高原缺氧環境，引起大鼠腦組織氧化應激，線粒體功能障礙。線粒體靶向抗氧化劑MitoQ可以明顯降低缺氧條件下大鼠腦組織脂質過氧化程度，提高抗氧化酶活性，從而提高缺氧大鼠抗氧化水平。同時，MitoQ能夠提高線粒體呼吸鏈復合物活性，維持其線粒體功能，對缺氧大鼠發揮保護作用。