二甲雙胍與二氯乙酸鹽對MYCN擴增神經母細胞瘤BE-2C細胞的協同抗腫瘤作用

王文斌，任飛樺，胡少洋，劉 歡，廖清船，陳紅霞，任 平

(1. 咸寧市中心醫院甲乳外科，湖北 咸寧 437100；2. 湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧 437100；3. 貴州醫科大學公共衛生學院，貴州 貴陽 550025)

神經母細胞瘤是小兒最常見的顱外惡性實體腫瘤，據統計，約40%進展期神經母細胞瘤有MYCN擴增[1]。MYCN擴增神經母細胞瘤惡性程度高，對常規化療藥物高度耐藥，常因多重治療出現嚴重毒性反應[2]。因此，尋找新的治療方法提高治愈率，減少毒性反應意義重大。二甲雙胍(metformin)是治療2型糖尿病的一線口服藥物。體外研究顯示，二甲雙胍可抑制多種癌細胞的生長，包括乳腺癌、結腸癌、前列腺癌、卵巢癌、膠質瘤等[3-4]。但是二甲雙胍在調節細胞代謝時，誘導乳酸堆積，引起腫瘤周圍微環境酸化，從而降低二甲雙胍的抗癌效應[5]。若能有效克服該副作用，無疑有助于增強二甲雙胍的抗癌效果。近年來研究發現，用于治療人類遺傳性線粒體代謝疾病和乳酸酸中毒的廉價藥二氯乙酸鹽(dichloroacetate，DCA)可殺死多種癌細胞，如卵巢癌、腦癌細胞等，但對正常細胞無損害，并可改善腫瘤細胞對多種化療藥物的獲得性耐藥[6-7]。有文獻報道，DCA可減少乳酸堆積，破壞腫瘤細胞賴以生存的微環境，抑制腫瘤細胞的生存[8]。因此推測，二甲雙胍和DCA對MYCN擴增神經母細胞瘤可能具有協同抑制作用。本文旨在研究二甲雙胍和DCA對MYCN擴增神經母細胞瘤細胞增殖的影響，并探討其機制，為MYCN擴增神經母細胞瘤的治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株MYCN擴增神經母細胞瘤細胞株BE-2C細胞，購自中科院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.1.2藥物與試劑 二甲雙胍鹽酸鹽、DCA，均購自Sigma公司(使用前均用培養基配制成所需濃度)；RPMI 1640培養基，購自美國Hyclone公司；胎牛血清、胰酶、青霉素、鏈霉素，均購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒，購自于碧云天生物技術有限公司；葡萄糖測試盒、乳酸測定試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；一抗Bax、Bcl-2，p-Akt、Akt、p-S6K、S6K、cleaved caspase-3及β-actin，均購自于美國Cell Signaling公司；ECL發光液，購自美國Thermo公司。

1.1.3儀器 細胞培養箱、生物安全柜(Thermo公司)；倒置顯微鏡(德國徠卡公司)；多功能酶標儀(美國Bio-Tek公司)；流式細胞儀(美國BD公司)；化學發光成像系統(美國Bio-Rad公司)；超凈工作臺( 蘇州凈化設備廠)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 BE-2C細胞常規培養于37 ℃、5%二氧化碳，含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和100 kU·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養基中，0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2CCK-8法檢測細胞增殖活性與聯合指數的計算 取對數生長期的BE-2C細胞，用0.25%胰酶消化成單細胞懸液，按每孔8 000個細胞接種于96孔板中，培養24 h后分組進行處理，分為空白對照組、二甲雙胍單獨用藥組(1.25、2.5、5、10、20 mmol·L-1)、DCA單獨用藥組(2.5、5、10、20、40、80 mmol·L-1)、二甲雙胍與DCA聯合用藥組(摩爾比1 ∶2)，以1.25、2.5、5、10、20 mmol·L-1的濃度為基準，以上每組設置5個復孔。藥物作用24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，37 ℃避光孵育30 min后，用酶標儀在450 nm處測量96孔板的吸光度值(OD值)，計算細胞生長抑制率：細胞生長抑制率/%=[1-(實驗組OD值-調零組OD值)/(空白對照組OD值-調零組OD值)]×100%。使用Graph Pad Prism5.0軟件計算藥物半數抑制質量濃度IC50，同時應用CalcuSyn1軟件，計算兩藥聯用的聯合指數(combination index，CI)，判斷兩藥聯用效果。

1.2.3培養基中葡萄糖含量和乳酸生成量的測定 取對數生長期的BE-2C細胞，以2×105每孔的密度接種于6孔板中。細胞貼壁生長24 h后，更換含藥物的培養基。以培養基為對照組，以單用二甲雙胍10 mmol·L-1、DCA 20 mmol·L-1及其聯用組為實驗組。藥物作用24 h后，收集培養基上清于EP管中，采用葡萄糖測試盒和乳酸測定試劑盒，檢測培養基中葡萄糖含量和乳酸生成量。

1.2.4流式細胞技術檢測細胞凋亡 取對數生長期的BE-2C細胞，以2×105每孔的密度接種于T25細胞培養瓶中，待細胞貼壁生長24 h后，更換含藥物的培養基。以培養基為陰性對照組，單用二甲雙胍10 mmol·L-1、DCA 20 mmol·L-1及其聯用組為實驗組。藥物作用24 h后，用不含EDTA的胰酶消化細胞，接著用預冷的PBS洗1次，再加入binding buffer 0.5 mL輕柔吹打混勻，吸取細胞至流式管，避光加入5 μL PI與5 μL Annexin-V FITC溶液孵育5 min，此外需設置空白管，于1 h內用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.5Western blot檢測凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2，cleaved caspase-3的表達 取對數生長期的BE-2C細胞，以2×105每孔的密度接種于6孔板中。待細胞貼壁生長24 h后，更換含藥物的培養基。以生理鹽水為陰性對照組，單用二甲雙胍10 mmol·L-1、DCA 20 mmol·L-1及其聯用組為實驗組。藥物作用24 h后，于冰上裂解收集蛋白，采用BCA檢測蛋白含量，取40 μg蛋白上樣，進行SDS-PAGE電泳，用濕轉法將蛋白轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，4 ℃孵育一抗過夜，洗膜，室溫孵育二抗1 h，洗膜，ECL發光液顯影，通過ImageJ軟件分析各樣品目的蛋白的灰度值，用β-actin作為內參。

2 結果

2.1 二甲雙胍與DCA聯用對BE-2C細胞增殖的抑制具有協同作用不同濃度的二甲雙胍或DCA處理BE-2C細胞24 h，采用CCK-8法檢測其細胞毒性。結果顯示，二甲雙胍或DCA對BE-2C細胞的抑制率隨濃度的增加而增高，具有濃度依賴性(Fig 1A、1B)。通過Graph Pad Prism5.0軟件，計算二甲雙胍的IC50值為(23.1±0.1)mmol·L-1，DCA的IC50值為(46.1±0.1)mmol·L-1，確定二甲雙胍與DCA聯用的摩爾比為1 ∶2。繼而通過CCK-8法，測定藥物聯用對細胞毒性的大小，并采用CalcuSyn1軟件計算兩藥聯用的CI。結果顯示，兩藥聯用在不同效應(即聯用時細胞生長抑制率)時的CI均小于1，表明二甲雙胍和DCA聯用呈現協同效應(Fig 1C)。倒置顯微鏡下觀察到單獨應用二甲雙胍或DCA組的細胞數量減少，但未見明顯的脫落細胞，而聯用組細胞數量明顯減少，細胞皺縮明顯，并可見大量漂浮的死亡細胞(Fig 1D)。

2.2 二甲雙胍與DCA聯用對BE-2C細胞中葡萄糖攝取和乳酸生成的影響分別單獨或聯合應用10 mmol·L-1的二甲雙胍或20 mmol·L-1的DCA處理BE-2C細胞24 h，檢測培養基中葡萄糖和乳酸的含量。Fig 2結果顯示，與對照組相比，二甲雙胍組的葡萄糖消耗和乳酸的產生量明顯增加(P<0.05)，而DCA組的葡萄糖消耗和乳酸的產生量明顯減少(P<0.01)；與二甲雙胍組相比，兩藥聯用組的葡萄糖消耗和乳酸的產生量明顯減少(P<0.05)，表明DCA可減少二甲雙胍引起的乳酸的堆積。

Fig 1 Synergistic inhibition of proliferation of BE-2C cells by metformin plus DCA n=5)

A: Metformin inhibited the viability of BE-2C cells in a dose-dependent manner; B: DCA showed a dose-dependent cytotoxicity in BE-2C cells; C: Combination index (CI) values of combined effect of metformin and DCA on BE-2C cells; D: The effects of metformin and DCA combination on morphology of BE-2C cells (×400).

Fig 2 Effects of metformin and/or DCA on glucose uptake and lactic acid production in BE-2C n=5)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmetformin group

2.3 二甲雙胍與DCA聯用對BE-2C細胞凋亡的影響為了證實二甲雙胍與DCA聯用產生協同作用與凋亡相關，采用流式細胞術檢測二甲雙胍和DCA單獨或聯合應用所引起的細胞凋亡變化。Fig 3結果表明，與對照組相比，二甲雙胍或DCA單獨用藥組細胞凋亡比例明顯增高(P<0.05)；與二甲雙胍或DCA單獨用藥組相比，兩藥聯用組細胞凋亡比例明顯增高(P<0.05)，提示二甲雙胍與DCA聯用可誘導BE-2C細胞凋亡增加。

2.4 二甲雙胍與DCA聯用誘導細胞Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白表達增加為了進一步研究兩藥聯用誘導細胞凋亡是否與凋亡相關蛋白表達增加有關，采用Western blot檢測二甲雙胍與DCA單用及聯用對細胞凋亡相關蛋白表達的影響。如Fig 4所示，與對照組相比，二甲雙胍與DCA單用組細胞的Bax、cleaved caspase-3蛋白表達水平均升高，而Bcl-2蛋白表達水平下降(P<0.05)；與二甲雙胍或DCA單獨用藥組相比，聯用組細胞的Bax、cleaved caspase-3蛋白表達水平均較單用組增加，而Bcl-2蛋白表達水平均較單用組明顯降低(P<0.01)。表明二甲雙胍與DCA聯用誘導BE-2C細胞凋亡增加，可能與下調Bcl-2蛋白表達、上調Bax蛋白表達、增強caspase-3活性有關。

3 討論

近年來研究發現，腫瘤是一種代謝異常性疾病[9]。腫瘤細胞由于線粒體呼吸鏈出現不可逆損傷，造成其在正常氧濃度條件下仍然傾向于糖酵解，這種現象稱為Warburg效應[10]。由于腫瘤細胞對糖酵解的依賴和高水平的葡萄糖攝取利用率，因此，抑制糖酵解和葡萄糖代謝可成為腫瘤治療的潛在目標。在諸多通過調節代謝而抗腫瘤的藥物中，DCA與二甲雙胍顯示出良好的抗腫瘤前景。

Fig 3 Effects of metformin and/or DCA on

A: Representative PI-Annexin V staining plots of BE-2C cells treated with control or 10 mmol·L-1metformin and/or 20 mmol·L-1DCA; B: Apoptotic rate detected by Annexin V-FITC /PI flow cytometry.△P<0.05,△△P<0.01 vs control group;**P<0.01vsmetformin group;##P<0.01vsDCA group.

Fig 4 Effects of metformin and/or DCA on protein levels of apoptosis-related proteins in BE-2C n=3)

△P<0.05,△△P<0.01vscontrol group;**P<0.01 vs metformin group;##P<0.01vsDCA group

本研究結果顯示，二甲雙胍和DCA單獨應用可明顯抑制MYCN擴增神經母細胞瘤BE-2C細胞的生長，具有濃度依賴性，其IC50值分別為23.1 mmol·L-1和46.1 mmol·L-1，這些發現與先前報道的二甲雙胍與DCA降低神經母細胞瘤細胞的生長和存活的結果一致[11-12]。而當二甲雙胍與DCA以1 ∶2摩爾比聯用時，其聯用指數均小于1，顯微鏡下觀察，聯用后其細胞數量明顯減少，有大量漂浮的死亡細胞，表明兩藥聯用具有協同作用。

但是二甲雙胍可抑制細胞內線粒體電子傳遞鏈復合物I，進而抑制葡萄糖代謝，造成腫瘤細胞的糖剝奪，誘導了乳酸堆積，引起腫瘤周圍微環境酸化，從而降低二甲雙胍的抗癌效應[5]。我們在研究兩藥對葡萄糖的消耗和糖酵解代謝產物乳酸生成能力的影響中發現，DCA可明顯減少二甲雙胍促進葡萄糖的消耗而導致乳酸堆積的副作用，這表明二甲雙胍與DCA協同抑瘤作用可能與DCA抑制糖酵解有關。

細胞凋亡在生物體的進化、內環境的穩定以及多個系統的發育中起著重要作用，腫瘤細胞會逃避凋亡，這與腫瘤的發展形成及耐藥性有著密不可分的關系。目前已發現，二甲雙胍可激活AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)，進而抑制mTORC1信號轉導，促進癌細胞凋亡[13]。DCA可增強有氧氧化作用，釋放大量活性氧簇，造成線粒體膜去極化，激活Kv通道等[14]，從而逆轉腫瘤細胞中線粒體的功能紊亂，激活線粒體依賴的細胞凋亡，殺傷腫瘤細胞。我們檢測兩藥聯用后其凋亡的變化，結果顯示，二甲雙胍與DCA均可誘導BE-2C細胞發生凋亡，且聯用后細胞凋亡明顯增加，與單用組相比，差異有統計學意義。凋亡是多基因嚴格控制的過程，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如c-Myc、抑癌基因p53等。Bcl-2家族成員可分為兩類，一類為細胞凋亡的抑制基因，主要有Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-W等，在caspase級聯放大與線粒體之間扮演著“橋梁”的作用；另一類是促進細胞死亡，主要包括Bax、Bak、Bid等，可調節凋亡進程，釋放細胞色素C，啟動caspase級聯反應，最終導致凋亡的發生[15]。本研究結果顯示，二甲雙胍與DCA聯用可明顯抑制Bcl-2的表達，上調Bax的表達，說明兩藥聯用可能通過改變Bcl-2與Bax的比例，增加了細胞凋亡。有活性的caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，把DNA降解為特異片段，從而誘導凋亡的發生[15]。本實驗結果顯示，二甲雙胍與DCA聯用可增加cleaved caspase-3的表達，這些結果說明二甲雙胍與DCA聯用發生的協同機制可能是通過上調Bax、cleaved caspase-3蛋白表達，下調Bcl-2蛋白表達，從而誘導細胞凋亡的發生。

綜上所述，二甲雙胍與DCA聯用產生協同作用可能與DCA抑制糖酵解，減弱二甲雙胍誘導的乳酸產生，增強二甲雙胍的抗癌效應，也可能與調節凋亡相關蛋白表達，提高細胞凋亡率有關。本研究為二甲雙胍與DCA聯用治療MYCN擴增神經母細胞瘤提供了良好的實驗依據。

(致謝：本實驗在湖北科技學院任平教授實驗室完成，謹此致謝。)